Estabelecendo a faixa de temperatura
Condições comuns de laboratório para culturas de Macrostomum lignano são as seguintes: temperatura de 20 °C, umidade 60%, e ciclo luz/obscuridade de 14 h/10 h. Estas condições foram escolhidas principalmente por serem ideais para o crescimento da diatomácea Nitzschia curvilineata, que é a principal fonte alimentar para os vermes . Para avaliar as condições de temperatura que podem ser utilizadas na experiência, primeiro estabelecemos a gama de temperaturas em que os vermes sobrevivem. Enquanto o congelamento dos vermes provou ser letal, eles poderiam sobreviver quando mantidos a 4 °C por pelo menos duas semanas. No entanto, como a diatomácea não cresce nestas condições, decidimos excluir os 4 °C de mais experiências. Outras temperaturas abaixo dos 20 °C também foram excluídas da experiência, uma vez que o objectivo principal do estudo era encontrar condições que acelerassem o crescimento e o desenvolvimento. Do outro lado do espectro de temperaturas, os vermes dissolvem-se quando mantidos a 42 °C durante duas horas, e morrem após uma semana de cultivo a 37 °C. Portanto, decidimos usar 20 °C, 25 °C, 30 °C e 35 °C como nossas condições experimentais para estudar os efeitos a longo prazo da temperatura em M. lignano (Fig. 1).
Design do estudo. Embriões e animais de duas linhagens do tipo selvagem, DV1 e NL10, foram cultivados em uma faixa de temperaturas de 20 °C a 35 °C e o tempo de desenvolvimento, reprodução, tempo de regeneração, resposta ao choque térmico e eficiência do choque gênico por interferência do RNA foram medidos
Resposta ao choque térmico
Para investigar quais temperaturas induzem resposta ao estresse nos vermes, monitoramos a atividade do promotor do choque térmico 20 (Mlig-hsp20). Primeiro, realizamos uma RT-PCR quantitativa para medir o nível de expressão do Mlig-hsp20 a 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C e 35 °C. Não houve diferença significativa no nível de expressão de Hsp20 entre 20 °C e 25 °C (Fig. 2a). Entretanto, um pequeno (2 vezes), mas significativo (P = 0,027, teste t), aumento na expressão foi observado a 30 °C em comparação com 20 °C (Fig. 2a). Foi observado um aumento de mais de dez vezes no nível de expressão a 33 °C, que aumentou para mais de 100 vezes à temperatura mais alta testada de 35 °C (Fig. 2a). No segundo teste criamos uma linha transgênica expressando a proteína mScarlet-I sob o controle do promotor Mlig-hsp20 (Fig. 2b) e medimos o nível de fluorescência 24 h após uma incubação de 2 h a diferentes temperaturas variando de 20 °C a 37 °C (Fig. 2c, d). Mais de duas e dez vezes o aumento da fluorescência foi observado a 34 °C e 37 °C respectivamente (Fig. 2c).
Resposta ao choque térmico em M. lignano uma análise qRT-PCR da expressão do gene Mlig-hsp20 a diferentes temperaturas. O gráfico é normalizado para os níveis de expressão a 20 °C. A significância estatística das alterações relativas à condição de 20 °C é calculada utilizando o teste t. ns, P > 0,05; *, P ≤ 0,05; **, P ≤ 0,01; ***, P ≤ 0,001. Foram utilizadas três réplicas biológicas para cada condição. As barras de erro indicam intervalos de confiança de 95% b Estrutura da construção do sensor de choque térmico transgênico KU#49. Promotor de um gene Mlig-hsp20 que responde a choques térmicos, o gene Mlig-hsp20 conduz a expressão do mScarlet-I, e promotor do gene Mlig-EFA, expresso de forma omnipresente, conduz a expressão do mNeonGreen e é usado como um marcador de seleção positiva para transgênese. c Intensidade de fluorescência do hsp20::mExpressão do transgene MScarlet a diferentes temperaturas. d Imagens de exemplo de animais transgênicos NL28 usados para medir a expressão do hsp20::mScarlet transgene. Os canais DIC e dsRed são mostrados para cada temperatura. As barras de escala são 100 μm
velocidade de desenvolvimento embrionário
De acordo com Morris et al. , demora cerca de 120 h (cinco dias) para que os ovos Macrostomum se desenvolvam completamente quando os ovos são mantidos a 20 °C. Para investigar como a temperatura afeta a velocidade de desenvolvimento embrionário e eclosão, nós coletamos embriões recém-pousados e monitoramos seu desenvolvimento até a eclosão a diferentes temperaturas. Para investigar potenciais diferenças devido ao background genético, utilizamos duas linhas de M. lignano que são atualmente utilizadas na maioria dos estudos sobre M. lignano, as linhas DV1 e NL10. Estas linhas derivam independentemente de populações do tipo selvagem da mesma localização geográfica e diferem por uma duplicação de todo o cromossoma, mas de resto comportam-se de forma muito semelhante em condições laboratoriais. Estudamos primeiro o efeito da baixa temperatura. A 4 °C o desenvolvimento dos ovos é preso e eles podem ser armazenados por pelo menos um mês, e retomar o seu desenvolvimento uma vez retornados a temperaturas mais altas. Em seguida, estudamos a rapidez com que os ovos se desenvolvem a temperaturas entre 20 °C e 35 °C. Como mostrado na Fig. 3, quando mantidos em condições normais (20 °C) os ovos começaram a eclodir após seis dias. O aumento da temperatura resultou num desenvolvimento embrionário proporcionalmente mais rápido e numa eclosão mais precoce, que foi duas vezes mais rápida a 35 °C em comparação com 20 °C e demorou apenas três dias. De notar que cerca de 10% dos ovos permanecem sem eclosão após oito dias de incubação a 20 °C, em comparação com menos de 5% a temperaturas mais elevadas, o que sugere que mesmo a temperatura mais elevada de 35 °C não tem efeitos prejudiciais para a sobrevivência dos embriões.
Tempo de desenvolvimento embrionário de M. lignano a diferentes temperaturas de incubação. As linhas DV1 (vermelho) e NL10 (azul) de M. lignano foram utilizadas no experimento, e 20 ovos foram monitorados por condições. O experimento foi repetido três vezes. A média ± valores de desvio padrão são indicados
Reprodução
A taxa de reprodução é um fator muito importante para um organismo modelo, uma vez que animais com menor tempo de geração permitem a geração mais rápida de dados em experimentos genéticos. Além disso, se os animais produzirem grandes quantidades de descendentes, os dados gerados terão, na maioria dos casos, maior poder estatístico.
Para avaliar o impacto da temperatura na taxa de reprodução de M. lignano, comparamos o número de descendentes gerados ao longo de cinco semanas por vermes mantidos em diferentes condições de temperatura. O experimento foi iniciado com nascimentos para incorporar o desenvolvimento pós-ventembriônico no estudo, e tanto a linha DV1 quanto a NL10 foram utilizadas. Os nascimentos de ambas as linhas levaram três semanas para crescer e produzir a primeira prole a 20 °C, enquanto que a 25 °C foram observados em duas semanas para a linha NL10, mas não para a DV1. A 30 °C e 35 °C ambas as linhas produziram progenitura já após duas semanas (Fig. 4). A partir de três semanas, o número de recém-nascidos produzidos por semana aumentou de abaixo de 200 a 20 °C para mais de 300 em temperaturas superiores a 20 °C; o número de recém-nascidos foi maior para os vermes mantidos a 30 °C. Isto foi verdade para ambos os fundos genéticos, e não observamos diferenças significativas entre as linhas DV1 e NL10 (Fig. 4).
Efeito da temperatura de incubação na taxa de reprodução nas linhas DV1 e NL10 M. lignano. Para cada condição foram seleccionados 20 nascimentos e os seus ovos eclodidos contados todas as semanas. Foram feitas experiências em triplicata
Apesar de temperaturas de 30 °C e superiores resultarem em mais nascimentos, também ativa uma resposta de choque térmico (Fig. 2). Para investigar o efeito a longo prazo da temperatura elevada e das tensões potenciais que esta pode ter sobre os vermes, mantivemos os vermes às temperaturas seleccionadas e monitorizámos aberrações morfológicas após três e seis meses de culto. Os vermes mantidos a 25 °C não mostraram alterações morfológicas em ambos os pontos de controlo em comparação com os vermes mantidos a 20 °C (Fig. 5). Contudo, tanto para as condições de temperatura de 30 °C como de 35 °C, foram observadas várias aberrações na morfologia geral. Após três meses, um número aumentado de quistos, tecido danificado e testes aumentados estavam normalmente presentes em ambas as linhas DV1 e NL10 (Fig. 5). Nenhum dos vermes mantidos a 35 °C sobreviveu até ao ponto de controlo de seis meses, e todos os vermes que sobreviveram a 30 °C apresentaram aberrações morfológicas (Fig. 5). Portanto, a exposição prolongada às temperaturas acima de 30 °C é prejudicial para M. lignano.
Efeitos da exposição prolongada a altas temperaturas sobre a morfologia em M. lignano. Nenhuma anormalidade visível após incubação a 20 °C ou 25 °C por até 6 meses. As barras de escala são 100 μm
Tempo de regeneração
Desde que a principal atracção de M. lignano como organismo modelo é a sua capacidade regenerativa, estudamos em seguida como a temperatura influencia a regeneração. É comumente aceito que temperaturas mais altas levam a aumentos na atividade metabólica global. Para avaliar a influência da temperatura no tempo necessário para que um verme regenere totalmente seu corpo após a amputação acima da região dos testículos, nós rastreamos a regeneração dos testículos e o aparecimento de espermatozóides no seminalis vesicular usando uma linha transgênica NL22 previamente estabelecida, que expressa a GFP sob o controle do promotor ELAV específico para os testículos e espermatozóides. O uso desse marcador transgênico proporciona melhor precisão, consistência e eficiência no ensaio da extensão da regeneração. De fato, não observamos variação significativa ao avaliar o tempo de aparecimento do sinal de GFP após a amputação em todas as temperaturas testadas (Tabela 1).
Como esperado, a velocidade de regeneração aumentou com a temperatura (Tabela 1). Se tomarmos o tempo de regeneração a 20 °C como taxa padrão, então para a regeneração dos testes os coeficientes de temperatura calculados são Q10 = 4 a 25 °C e Q10 = 3 para 30 °C e 35 °C. Isto mostra que o maior efeito é obtido quando se aumenta a temperatura até 25 °C, e a regeneração mais rápida ocorre a 30 °C, sem que haja mais benefícios de aumento de temperatura no tempo de regeneração. Portanto, temperaturas de 25 °C e 30 °C devem ser consideradas em experimentos de regeneração em M. lignano, pois encurta a duração de um experimento de duas a três vezes (Tabela 1).
Interferência do RNA
Knockdown da expressão gênica por interferência do RNAi é atualmente a abordagem primária para estudos de perda de função em M. lignano . Nesta abordagem, os animais são encharcados com RNA de cadeia dupla contra o gene alvo, e frequentemente são necessários tratamentos prolongados por várias semanas para observar um fenótipo . Testamos como a temperatura influencia a velocidade do desenvolvimento do fenótipo no tratamento com RNAi. Para isso, derrubamos Mlig-ddx39, um gene conhecido pela sua função na proliferação celular em M. lignano e um fenótipo robusto e letal de derrubar. De forma semelhante ao teste de reprodução, utilizamos as linhas DV1 e NL10 para este experimento (Tabela 2). A 20 °C, foram necessários cerca de 20 dias para que todos os animais morressem no knockdown Mlig-ddx39. Quando os vermes foram mantidos a temperaturas mais elevadas, a morte ocorreu mais rapidamente: a 11 e 8 dias para os vermes mantidos a 25 °C e 30 °C respectivamente. Não houve diferença visível entre as duas estirpes utilizadas para a experiência (Tabela 2). Em seguida, investigamos se o aumento observado na velocidade de manifestação do fenótipo ddx39 RNAi a temperaturas mais elevadas é atribuível a uma maior eficiência de derrubamento do gene pelo RNAi, ou a outros fatores. Para isso, medimos por qRT-PCR a abundância de transcrições de Mlig-ddx39 em diferentes pontos de tempo após o início da experiência do RNAi em diferentes temperaturas (Fig. 6). Animais tratados com dsRNA contra gfp foram usados como controles de referência. Em todas as temperaturas testadas não foram observadas variações significativas nos níveis de expressão de Mlig-ddx39 entre amostras controle durante o decorrer do experimento (Fig. 6). Ao mesmo tempo, para os animais tratados com Mlig-ddx39 dsRNA uma queda de ~ 80% no nível de transcrições de ddx39 já foi observada após um dia de tratamento a 20 °C ou 25 °C, e até mesmo uma queda maior de ~ 90% a 30 °C. No entanto, nos dias seguintes, os níveis de queda se estabilizaram em torno de 95% a todas as temperaturas. Assim, concluímos que a cinética do próprio RNAi não é significativamente afectada pela temperatura. Ao contrário, o encurtamento de tempo observado para a manifestação do fenótipo Mlig-ddx39 RNAi a temperaturas mais elevadas pode ser explicado pelo aumento da taxa de rotação celular.
Níveis de expressão do gene Mlig-ddx39 a diferentes temperaturas e durações de tratamento com Mlig-ddx39 dsRNA medido por qRT-PCR. O tratamento com dsRNA contra gfp foi utilizado como controle, e os gráficos são normalizados para os níveis de expressão de Mlig-ddx39 no dia 1 em animais tratados em controle a uma determinada temperatura. A significância estatística das alterações é calculada usando o teste t. ns, P > 0,05; *, P ≤ 0,05; **, P ≤ 0,01; ***, P ≤ 0,001. Foram utilizadas três réplicas biológicas para cada condição. As barras de erro indicam intervalos de confiança de 95%. Não foram realizadas medições no 7º dia a 30ºC, já que quase todos os animais tratados com Mlig-ddx-39 estavam mortos nesse momento
Para testar se a aceleração do desenvolvimento dos fenótipos RNAi a temperaturas elevadas pode ser generalizada a outros genes, investigamos o gene Mlig-sperm1, cuja derrubada leva a uma morfologia anormal do esperma e testes aumentados. Este é um fenótipo de RNAi lento que leva 2-3 semanas para se desenvolver a 20 °C . Para quantificar a extensão do fenótipo a diferentes temperaturas, no quarto dia de tratamento com RNAi contamos a fração de animais com testículos aumentados na medida em que se tocavam uns aos outros. (Fig. 7). Similar aos resultados com Mlig-ddx39 RNAi, temperaturas mais altas resultaram em desenvolvimento mais rápido do fenótipo, e embora não tenham sido observados testes suficientemente grandes após quatro dias de tratamento com dsRNA a 20 °C, 25 e 85% dos animais tinham desenvolvido testes aumentados a 25 °C e 30 °C respectivamente (Tabela 2). Assim, semelhante à regeneração, os fenótipos RNAi podem ser acelerados com a temperatura em M. lignano e temperaturas mais altas podem ser usadas para encurtar a duração dos experimentos.
Fenótipo de knockdown de Mlig-sperm1 após quatro dias de tratamento com dsRNA. Note a diferença no tamanho dos testes (linhas tracejadas) entre 20 °C e 30 °C. As barras de escala são 100 μm