Estirpes virais
HCoV-229E (VR-740) e HCoV-OC43 (VR-1558) foram propagados em fibroblastos MRC-5 de pulmão diplóide humano (CCL-171) e WI-38 (CCL-75), respectivamente (todos da ATCC, Manassas, VA). Ambas as linhas celulares humanas foram cultivadas em MEM suplementadas com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamina, 100 U/ml penicilina e 100 μg/ml estreptomicina (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, EUA). O meio de infecção viral consistiu de MEM ou RPMI-1640 mais 2% de FBS inativado por calor para HCoV-229E e HCoV-OC43, respectivamente. As cepas virais foram propagadas através da inoculação de frascos contendo células hospedeiras com 24 horas de idade, que eram 80-90% confluentes. Após uma hora de incubação, a monocamada celular foi lavada e incubada em meio de infecção fresco por três ou quatro dias a 35 °C para o HCoV-229E e a 33 °C para o HCoV-OC43. O sobrenadante contendo o estoque viral de trabalho foi então coletado por centrifugação (300 g durante 15 minutos). O título do vírus foi determinado por cultura de 50% de dose infecciosa de TCID50 através da avaliação dos efeitos citopáticos (CPE), que foram pontuados em um microscópio de campo brilhante (10×) como vacuolização do citoplasma, arredondamento celular e sloughing.
Câmara de irradiação de aerossol de bancada
Câmara dinâmica de irradiação de aerossol/vírus de uma só passagem foi usada para gerar, expor e coletar amostras de aerossol como descrito anteriormente23. Os aerossóis virais foram gerados pela adição de uma solução viral em um nebulizador de terapia respiratória com aerossóis de alta capacidade (Westmed, Tucson, AZ) e operando usando uma bomba de ar com uma taxa de fluxo de entrada de 11 L/min. O vírus fluiu para a câmara e foi misturado com ar seco e úmido para manter a umidade entre aproximadamente 50-70%. A umidade relativa, temperatura e distribuição do tamanho das partículas de aerossol foram monitoradas durante toda a operação. O aerossol foi exposto à luz UV distante e finalmente coletado usando um BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
A lâmpada UV distante foi posicionada a aproximadamente 22 cm de distância da câmara de exposição UV e direcionada para a janela de plástico transmissor de UV 26 cm × 25,6 cm × 254 μm (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). Consistente com nossas experiências anteriores utilizando esta câmara23 , a vazão através do sistema era de 12,5 L/min. O volume da região de exposição UV foi de 4,2 L de modo que cada aerossol foi exposto durante aproximadamente 20 segundos enquanto atravessava a janela. Toda a câmara de irradiação estava contida em um gabinete de nível 2 de biossegurança e todas as entradas e saídas de ar estavam equipadas com filtros HEPA (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) para evitar a entrada ou saída de contaminação indesejada do sistema.
Execução da câmara de irradiação
A câmara de irradiação personalizada simulava a transmissão de vírus aerossolizados produzidos através da tosse e respiração humana. A câmara funcionava com uma humidade relativa média de 66% e uma temperatura média de 24 °C em todas as pistas. A distribuição média do tamanho das partículas foi de 83% entre 0,3 μm e 0,5 μm, 12% entre 0,5 μm e 0,7 μm, e 5% >0,7 μm (Tabela 3). Os vírus aerosolizados foram transmitidos eficientemente através do sistema como evidenciado pelo controle (exposição zero) mostrando clara integração de vírus (Figs. 2 e 3, painéis superiores esquerdos).
Lâmpada Far-UVC e dosimetria
A fonte Far-UVC utilizada neste estudo foi um módulo de lâmpada de 12 W 222-nm KrCl excimer feito pela USHIO America (Item #9101711, Cypress, CA). A lâmpada está equipada com uma janela de filtragem óptica proprietária para reduzir as emissões da lâmpada fora do pico de emissão KrCl de 222 nm. A lâmpada foi posicionada a 22 cm de distância da janela da câmara de exposição e direcionada para o centro da janela. As medições de potência óptica foram realizadas utilizando um fotodetector de silício de baixo consumo de energia UV 818-UV/DB com um medidor de potência óptica 843-R (Newport, Irvine, CA). A dosimetria foi realizada antes do início de um experimento para medir a fluência dentro da câmara na posição do aerossol.
A distância entre a lâmpada e a câmara de irradiação permitiu que uma única lâmpada irradiasse uniformemente toda a área da janela de exposição. As medições usando o fotodetector de silício indicaram uma intensidade de exposição de aproximadamente 90 μW/cm2 em toda a área de exposição. A câmara está equipada com uma superfície reflectora de alumínio oposta à janela de exposição. Como em nosso trabalho anterior com esta câmara23 , a refletividade desta superfície era de aproximadamente 15%. Assim, estimamos, de forma conservadora, a intensidade em toda a área de exposição em 100 μW/cm2. Com a lâmpada posicionada a 22 cm da janela e dados os 20 segundos necessários para uma partícula de aerossol atravessar a janela de exposição, calculámos a dose total de exposição a uma partícula em 2 mJ/cm2. Utilizámos folhas adicionais de janelas de plástico com transmissão UV para reduzir uniformemente a intensidade em toda a região de exposição e criar diferentes condições de exposição. Enquanto em nosso trabalho anterior com estas folhas medimos uma transmissão mais próxima a 65%23, para estes testes medimos a transmissão de 222 nm de cada folha para ser aproximadamente 50%. Esta diminuição na transmissão é provável devido à fotodegradação do plástico ao longo do tempo4. A adição de uma ou duas folhas de plástico cobrindo a janela de exposição diminui a dose de exposição para 1 e 0,5 mJ/cm2, respectivamente.
Protocolo experimental
Como descrito anteriormente23, a solução de vírus no nebulizador consistiu de 1 ml de Modified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) contendo 107-108 TCID50 de coronavírus, 20 ml de água deionizada, e 0,05 ml de Hank’s Balanced Salt Solution com cálcio e magnésio (HBSS+++). A câmara de irradiação foi operada com partículas de vírus aerosolizadas fluindo através da câmara e do canal de bypass por 5 minutos antes de cada amostragem, a fim de estabelecer o valor de RH desejado. A coleta das amostras foi iniciada pela mudança do fluxo de ar do canal de bypass para o BioSampler, utilizando o conjunto de válvulas de três vias. O BioSampler foi inicialmente enchido com 20 ml de HBSS++ para capturar o aerossol. Durante cada tempo de amostragem, que durou 30 minutos, o interior da câmara de irradiação foi exposto à luz de 222 nm de distância-UVC que entrava pela janela de plástico. A variação da dose de UV distante entregue às partículas de aerossol foi alcançada através da inserção de filmes plásticos adicionais transparentes à radiação UV, como descrito acima, fornecendo assim as três doses de teste de 0,5, 1,0 e 2,0 mJ/cm2. Foram realizados estudos de controle de dose zero com a lâmpada do excimer desligada. Após a conclusão do período de amostragem, a solução do BioSampler foi usada para os ensaios de infecciosidade do vírus.
ensaios de infecciosidade do vírus
TCID50
Usamos o ensaio de dose infecciosa de cultura de 50% de tecido para determinar a infecciosidade do vírus28. Resumidamente, 105 células hospedeiras foram plaqueadas em cada poço de 96 placas de poços no dia anterior ao experimento. As células foram lavadas duas vezes em HBSS++ e diluições em série 1:10 no meio de infecção do vírus exposto do BioSampler foram sobrepostas em células durante duas horas. As células foram então lavadas duas vezes em HBSS++, cobertas com meio de infecção fresco, e incubadas por três ou quatro dias a 34 °C. Os efeitos citopáticos (CPE) foram pontuados em um microscópio de campo brilhante (10×) como vacuolização do citoplasma, arredondamento celular e sloughing. O TCID50 foi calculado com o método de Reed e Muench28,38. Para confirmar os escores de CPE, as amostras foram fixadas em metanol 100% durante cinco minutos e coradas com violeta cristal 0,1%. Os resultados são relatados como a estimativa de unidades formadoras de placas (PFU)/ml utilizando a conversão PFU/ml = 0,7 TCID50 aplicando a distribuição de Poisson29,
Imunofluorescência
Para avaliar se o aumento das doses de luz de 222 nm reduziu o número de células infectadas, realizámos um protocolo padrão de imunodifusão fluorescente para detectar um antigénio viral nas células humanas do hospedeiro23. Em resumo, 2 × 105 células do hospedeiro (células MRC-5 para HCoV-229E e WI-38 para HCoV-OC43) foram plaqueadas em cada poço de 48 placas de poços no dia anterior ao experimento. Após percorrer a câmara de irradiação por 30 minutos, 150 μl de suspensão de vírus coletados do BioSampler foram sobrepostos na monocamada de células hospedeiras. As células foram incubadas com o vírus durante uma hora, depois lavadas três vezes com HBSS++, e depois incubadas durante a noite em meio de infecção fresco. As células infectadas foram então fixadas em 100% metanol gelado a 4 °C por 5 minutos e rotuladas com glicoproteína de pico de coronavírus humano (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 no HBSS++ contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, EUA) à temperatura ambiente por uma hora com agitação suave. As células foram lavadas três vezes em HBSS+++ e rotuladas com Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 em HBSS++ contendo 1% de BSA, à temperatura ambiente durante 30 minutos no escuro com agitação suave. Após três lavagens no HBSS++, as células foram coradas com Vectashield contendo DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e observadas com a objetiva 10× de um microscópio fluorescente Olympus IX70 equipado com uma câmera digital Fotométrica PVCAM de alta resolução e alta eficiência e software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Para cada 222 nm de dose e género de vírus, os resultados representativos foram repetidos duas vezes. Para cada amostra, foram adquiridos até dez campos de visão das imagens DAPI e Alexa Fluor-488 fundidas.
Análise de dados
A fração sobrevivente (S) do vírus foi calculada dividindo-se a fração PFU/ml a cada dose de UV (PFUUV) pela fração a dose zero (PFUcontroles): S = PFUUV/PFUcontrolos. Os valores de sobrevivência foram calculados para cada experiência repetida e o log natural (ln) foi transformado para aproximar a distribuição de erros do normal39. Regressão linear robusta usando os mínimos quadrados re-ponderados (IWLS)40,41 foi realizada no software R 3.6.2 usando estes valores ln normalizados como variável dependente e dose UV (D, mJ/cm2) como variável independente. Usando esta abordagem, a sobrevivência do vírus foi descrita pela cinética de primeira ordem de acordo com a equação4:
onde k é a taxa de inativação UV constante ou fator de suscetibilidade (cm2/mJ). A regressão foi realizada com o termo de intercepção fixado em zero representando a definição de 100% de sobrevivência relativa à dose de UV zero, separadamente para cada estirpe de vírus estudada. Os dados em dose zero, que por definição representam ln = 0, não foram incluídos na regressão. Incertezas (intervalos de confiança de 95%, IC) para o parâmetro k para cada cepa do vírus foram estimadas por bootstrapping para cada método de regressão, pois bootstrapping pode resultar em estimativas de incerteza mais realistas, em comparação com a aproximação analítica padrão baseada na normalidade assimptótica, em pequenos conjuntos de dados como os utilizados aqui (n = 3 HCoV-229E e n = 4 para HCoV-OC43). A bondade de ajuste foi avaliada pelo coeficiente de determinação (R2). A análise dos resíduos para autocorrelação e para heterocedasticidade foi realizada utilizando os testes Durbin-Watson42 e Breusch-Pagan (implementado pelo pacote lmtest R)43, respectivamente. As estimativas dos parâmetros (k) para cada estirpe de vírus foram comparadas entre si com base nas IC 95% e diretamente pelo teste t, usando os tamanhos das amostras, os valores k e seus erros-padrão. A secção transversal de inactivação do vírus, D90, que é a dose UV que inactiva 90% do vírus exposto, foi calculada como D90 = – ln/k. Outros valores de D foram calculados de forma semelhante.