Alai

Câncer de cabeça e pescoço é o sétimo tipo de câncer mais comum por incidência e mortalidade, com 890.000 novos casos e 450.000 mortes em todo o mundo em 2018 . O tratamento permanece desafiador com as terapias atuais, resultando em taxas de sobrevida de cinco anos abaixo de 50% para pacientes com doenças localmente avançadas . A resistência aos medicamentos e a toxicidade limitam a eficácia de quimioterápicos como a cis- ou carboplatina, 5-fluorouracil e taxanos. A introdução de agentes específicos como o cetuximab, nivolumab ou pembrolizumab melhorou o resultado, mas não superou o problema da resistência ao tratamento primário ou adquirido na maioria dos pacientes. Apenas muito poucos biomarcadores são atualmente utilizados na prática clínica ou têm realmente procedido à validação para uso rotineiro . Modelos pré-clínicos confiáveis são, portanto, críticos para entender melhor os mecanismos moleculares envolvidos na resistência e progressão do tratamento do HNSCC e para desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes.

Linhas celulares imortalizadas derivadas de tumores de HNSCC representam uma ferramenta valiosa para a análise funcional da resistência ao tratamento. O rastreamento de drogas em culturas de células monocamadas continua sendo a abordagem comum para a identificação de novos agentes terapêuticos. Entretanto, as culturas tridimensionais (3D) que representam mais de perto a arquitetura do tecido tumoral e o ambiente celular podem ser superiores para prever a eficácia do medicamento em pacientes. De fato, grandes variações na radiação e na sensibilidade aos medicamentos têm sido mostradas em estudos que utilizam culturas de células 3D, semelhantes àquelas encontradas com tumores in vivo. Mesmo que as culturas em 3D sejam úteis para estudar as interações entre diferentes populações celulares, elas não reproduzem totalmente a complexidade do HNSCC. Assim, o desenvolvimento de novas terapias pode, em última análise, requerer modelos animais de HNSCC clinicamente relevantes que representem com precisão as mudanças celulares e moleculares associadas ao início e progressão do câncer humano. Nesse sentido, modelos de HNSCC induzidos por carcinógenos, animais transgênicos e modelos de xenoenxertos transplantáveis entraram no campo da pesquisa do HNSCC. Esta revisão descreve os modelos pré-clínicos de HNSCC mais utilizados (esquematicamente descritos na Fig. 1) e dá uma visão geral dos seus pontos fortes e limitações. Também discutimos novas abordagens de seleção de tratamento personalizado com base nesses modelos.

Modelos ex vivo

Linhas de células de HNSCC imortalizadas

Há quatro décadas, foram relatados os primeiros protocolos para culturas ex vivo de células de HNSCC. Após a resolução de obstáculos anteriores como o crescimento excessivo de fibroblastos e a dependência das camadas de alimentação com esses protocolos, as linhas de células de HNSCC foram estabelecidas com sucesso. As técnicas de cultura têm sido melhoradas desde então, e várias linhas de células de HNSCC têm crescido de forma estável em numerosas passagens. Uma descrição detalhada de todas as linhas de células de HNSCC disponíveis estaria além do escopo desta revisão. Assim, gostaríamos de remeter o leitor para dois artigos de revisão anteriores . Como as linhas de células imortalizadas de HNSCC podem ser facilmente mantidas e expandidas, elas têm sido amplamente utilizadas para estudar alterações genéticas e respostas biológicas a perturbações químicas e genéticas, para identificar potenciais alvos moleculares e para desenvolver uma nova terapêutica de pequena molécula e biológica. Mais recentemente, foram fornecidas evidências de que estas linhas celulares também podem ser usadas para estudar a heterogeneidade intratumoral e a evolução clonal que ocorre sob pressão terapêutica. Dados de estudos moleculares e funcionais tão abrangentes nestes modelos foram reunidos em bibliotecas como a Enciclopédia das Linhas Celulares de Câncer (CCLE), representando um valioso repositório da diversidade do câncer humano .

As linhas de células HNSCC cultivadas em culturas de monocamada bidimensional (2D) continuam sendo modelos importantes na busca de novas abordagens terapêuticas para esta doença, mas geralmente sofrem da sua incapacidade de refletir a natureza histológica, arquitetura tridimensional (3D) e diferenças estruturais e funcionais do tumor in vivo. Estas limitações influenciam significativamente o valor informativo dos estudos in vitro que avaliam a eficácia das modalidades de tratamento estabelecidas e novas para o HNSCC em monoculturas monocamadas. De fato, diferenças notáveis na sensibilidade das culturas 2D versus 3D das linhas de células de HNSCC foram relatadas para tratamento com radiação e drogas, por exemplo, com cisplatina , cetuximab e o inibidor mTOR AZD8055 . A análise molecular comparativa de células crescendo em culturas 2D versus 3D forneceu possíveis explicações para menor sensibilidade das células em culturas 3D, como a expressão e ativação de genes associados ao reparo do DNA, e aumento dos níveis de expressão de genes associados à transição epitelial-mesênquima e estaminais sob condições 3D.

A instabilidade genética e a ocorrência de seleção clonal durante a cultura in vitro são outras limitações potenciais das linhas celulares cancerígenas, e podem explicar por que os achados envolvendo linhas celulares são frequentemente difíceis de reproduzir. De fato, uma análise abrangente das linhagens de células MCF7 da mama e A549 do câncer de pulmão comumente usadas revelou extensa variação genômica entre as linhagens, que foi associada com variação nas propriedades celulares biologicamente significativas. É importante notar que quando as estirpes foram testadas contra 321 compostos anticancerígenos, foram observadas respostas consideravelmente diferentes às drogas, com pelo menos 75% dos compostos inibindo fortemente algumas estirpes, mas estando completamente inativos em outras. Este estudo sublinha claramente a necessidade urgente de modelos ex vivo melhorados para apoiar a investigação do cancro maximamente reproduzível.

Modelos ex vivo avançados de HNSCC

Köpf-Maier e colegas foram os primeiros a estabelecer um método que permitiu às células cancerígenas humanas de diferentes entidades histológicas, incluindo carcinomas espinocelulares (CEC) da faringe, reorganizarem-se in vitro para “estruturas organóides” . Eles mostraram que essas culturas organóides mantiveram as propriedades críticas do estado in vivo, como a arquitetura 3D, o crescimento de tipos celulares heterogêneos de um carcinoma individual e a diferenciação morfológica sob condições experimentais relativamente simples. Em um estudo subsequente, o mesmo grupo demonstrou que essas culturas organóides podem ser utilizadas para testes de drogas e que os dados de resposta obtidos foram concordantes com a resposta dos pacientes à terapia. Os autores foram os primeiros a propor as culturas organóides como plataforma personalizada de testes de drogas in vitro, permitindo a previsão da quimiossensibilidade individual dos carcinomas em poucos dias .

Desde então, as técnicas de cultivo de tecidos in vitro em 3D como estruturas organotípicas foram refinadas. Foram desenvolvidos protocolos para o estabelecimento de organóides de células estaminais adultas e embrionárias capazes de se auto-organizar em estruturas 3D que reflitam o tecido de origem (para uma revisão ver Clevers, 2016 ). As primeiras culturas organoidais derivadas de células estaminais adultas foram estabelecidas a partir de células estaminais intestinais de camundongos que foram colocadas em condições que imitam o nicho de células estaminais intestinais. A reprogramação condicional induzida pela adição de R-spondina-1, fator de crescimento epidérmico (EGF) e Noggin ao meio de cultura, e a incorporação das células em um extrato de membranas basais extracelulares de matriz que fornece a matriz, mostrou estimular as células-tronco adultas a se auto-renovarem, proliferarem e formarem descendência diferenciada, assemelhando-se ao epitélio intestinal. Esta técnica, inicialmente desenvolvida para estudar tecido infectado, inflamatório e neoplásico do trato gastrointestinal humano, não só tem sido utilizada para o estabelecimento de culturas organóides a partir de uma variedade de tecido normal humano, mas também tecido tumoral derivado de pacientes. Esses estudos ampliaram e melhoraram significativamente o conjunto de modelos de câncer disponíveis.

Mais recentemente, as descobertas iniciais de Köpf-Maier e colegas de culturas de organóides HNSCC sendo uma plataforma adequada de testes de drogas in vitro foram confirmadas por vários estudos independentes. Embora diferenças consideráveis nas taxas de sucesso no estabelecimento de culturas organóides primárias de crescimento a longo prazo de pacientes com CECP (30% versus 65%) tenham sido relatadas, todos os estudos até agora descreveram unanimemente que os organóides retêm muitas propriedades do tumor original, incluindo heterogeneidade intratumoral, perfil de mutação e padrões de expressão de proteínas. Além disso, foi demonstrado que os organóides retiveram seu potencial tumorigênico no xenotransplante. As respostas ao tratamento medicamentoso in vivo foram semelhantes ao IC50 calculado a partir de organóides por ensaios de sensibilidade a drogas in vitro Além disso, os dados de radio sensibilidade de testes organóides correlacionados com a resposta clínica em pacientes . Importante, não apenas os efeitos relacionados ao tratamento de tumores, mas também os efeitos colaterais indesejados da terapia em tecidos normais podem ser estudados em modelos organóides. Por exemplo, organóides de glândulas salivares derivadas de pacientes têm sido usados para dissecar a base molecular da hiposalivação, um efeito colateral severo de radiação freqüente .

Um estudo adicional identificou culturas de células primárias 2D de tumores de pacientes com HNSCC como modelo adicional valioso ex vivo de HNSCC . Aqui, o rastreio individualizado em larga escala de terapêuticas anti-cancerígenas identificou reprodutivamente medicamentos com actividade antitumoral em modelos de xenoenxerto derivado de pacientes (PDX) combinados, fornecendo assim evidências adicionais de que as culturas primárias de HNSCC poderiam ser utilizadas para apoiar a tomada de decisões terapêuticas num ambiente clínico de rotina .

Culturas organóides de tecidos normais, displásicos e malignos da língua humana também têm sido utilizadas para reproduzir os principais passos da tumorigenese da língua . A histomorfometria, imunohistoquímica e análises por microscopia eletrônica em co-culturas 3D de queratinócitos primários derivados da língua e fibroblastos em matriz de colágeno mostraram que o crescimento estratificado, a proliferação celular e a diferenciação eram comparáveis entre as co-culturas e seus respectivos tecidos nativos, no entanto, eles diferiram muito nas culturas cultivadas sem fibroblastos. Estes resultados apoiam estudos anteriores mostrando um papel importante dos fibroblastos associados ao câncer na patogênese do HNSCC . Estes dados, juntamente com amplas evidências da literatura sobre os efeitos promotores do microambiente tumoral (MTE), argumentam fortemente a favor do uso futuro de modelos pré-clínicos mais avançados, compreendendo todos os principais componentes da MTE. Novos protocolos estão atualmente disponíveis para geração de organóides contendo ao lado das células do estroma também as células imunes do paciente. Assim, embora a cultura de organóides tenha limitações , como o consumo de tempo e recursos consideráveis e a incorporação de fatores extrínsecos indefinidos que podem influenciar o resultado dos experimentos (Tabela 1), essas culturas podem representar modelos adequados para desenvolver e otimizar estratégias futuras de tratamento, incluindo medicamentos imunológicos.

Modelos animais

Modelos animais de câncer oral induzido por carcinógenos

CECs mais humanos são conhecidos por serem induzidos por exposição crônica a carcinógenos. Inicialmente, abordagens experimentais de indução de tumores malignos orais sempre falharam quimicamente, porque a mucosa oral era mais resistente à ação de produtos químicos do que a pele. Finalmente, usando 9, 10 dimetil-1, 2, benzantraceno (DMBA) HNSCC poderia ser induzido com sucesso na bolsa da bochecha do hamster como um modelo animal. Parecido com o cenário em pacientes, a carcinogênese da mucosa ocorreu em quatro estágios sucessivos: hiperplasia, hiperplasia atípica, carcinoma in situ e carcinoma espinocelular. Entretanto, houve dificuldades em distinguir entre alterações do epitélio causadas pelo contato direto com o carcinógeno e a verdadeira transformação pré-maligna, pois as alterações foram transitórias e reversíveis nos tumores da bochecha induzidos por DMBA. Além disso, os tumores induzidos por DMBA não possuíam muitas das características histológicas do HNSCC diferenciado e não se assemelhavam muito às lesões humanas iniciais. Mais importante ainda, o tumor ocorreu na bolsa da bochecha do hamster, que representa uma área imunodeficiente ausente em humanos, por isso este modelo não imitava muito bem o HNSCC humano. Embora o DMBA tenha sido posteriormente amplamente empregado em modelos de hamster e câncer oral de rato, provou-se ser difícil induzir carcinoma oral com DMBA em camundongos. O 1-óxido de 4-Nitroquinolina (4-NQO), um derivado de quinolona solúvel em água, foi então introduzido como potente indutor de tumores orais. A administração do 4-NQO com água potável ou sua aplicação tópica resultou em múltiplas lesões displásicas, pré-neoplásicas e neoplásicas após tratamento a longo prazo em modelos de ratos e camundongos, e estas lesões assemelhavam-se muito à transformação neoplásica da cavidade oral humana. Após várias modificações, o modelo foi padronizado por Tang et al. , que mostraram que o fornecimento de 4-NQO na água potável de ratos C57BL/6 durante 16 semanas promove carcinogênese da cavidade oral com alta incidência.

Ao recapitular a sequência de eventos e o tipo de lesões observadas durante a carcinogênese humana, os modelos animais induzidos por carcinogênese acima descritos fornecem um excelente sistema in vivo para o estudo dos principais eventos de condução da carcinogênese oral. Estes modelos também têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento de estratégias de quimioprevenção do câncer, enquanto menos estudos têm aproveitado estes modelos animais para avaliar a eficácia dos medicamentos para o tratamento de tumores estabelecidos. Uma grande limitação como plataforma de triagem de medicamentos é o tempo prolongado necessário para completar a avaliação dos efeitos de um composto de teste (Tabela 1). A maioria dos modelos animais de HNSCC induzidos por carcinógenos requer até 40 semanas para desenvolver carcinomas de pleno direito, e ainda mais tempo se a metástase for o ponto final do estudo. Neste contexto, um relatório recente de Wang e colegas oferece um atalho potencial ao usar o xenoenxerto tumoral de língua induzido pela linha celular 4NQO como uma alternativa mais expedita ao modelo syngênico de camundongo .

A maior vantagem do modelo animal induzido pelo 4NQO é sua adequação para estudar os efeitos de fatores carcinogênicos e genéticos na tumorigenese, especialmente em um ambiente imunocompetente. Assim, fornece uma plataforma adequada para acelerar o desenvolvimento de regimes imunoterapêuticos no HNSCC. O modelo também tem sido utilizado com sucesso para investigar o papel das células-tronco putativas do câncer na resistência ao tratamento, recidiva e metástase. O seu potencial para desenvolver novas estratégias terapêuticas visando não só o volume tumoral proliferativo mas também a subpopulação relativamente quiescente de células estaminais cancerosas foi estabelecido .

Modelos de camundongos geneticamente modificados

Apesar do dano do DNA por químicos ocorrer aleatoriamente, de acordo com a teoria da evolução tumoral, a aquisição aleatória de mutações através do genoma é seguida pela seleção de clones que abrigam mudanças genéticas que facilitam a sobrevivência e a proliferação celular. Estudos de perfis moleculares identificaram vários genes propulsores putativos que contribuem para o desenvolvimento do câncer no HNSCC. No entanto, estes estudos moleculares não forneceram evidências diretas de causalidade ou uma visão detalhada dos mecanismos biológicos pelos quais estes genes impulsionam o desenvolvimento tumoral. Embora modelos animais induzidos por carcinógenos possam recapitular de perto o cenário heterogêneo de alterações genômicas em tumores primários humanos, apenas uma fração dessas mutações conduzem à autogênese tumoral afetando oncogenes ou genes supressores de tumores, mas muitas mutações são passageiros sem contribuição clara para o desenvolvimento tumoral. Estes estudos também não revelam se os fatores que levam à manutenção do tumor são essenciais e, portanto, podem ser de utilidade limitada para o desenho de estratégias terapêuticas eficazes. Em contraste, sistemas de modelos pré-clínicos como os modelos de ratos geneticamente modificados (GEMMs) fornecem uma abordagem experimentalmente traçável na qual os efeitos biológicos de mutações específicas podem ser estudados em detalhe em um fundo genético controlado. Nos próximos capítulos, descrevemos os principais achados de estudos anteriores baseados em GEMMs em HNSCC.

Poucos GEMMs associados à formação espontânea de HNSCC na ausência de exposição crônica ao carcinógeno foram descritos até o momento (Tabela 2). Um modelo de camundongo geneticamente modificado de câncer oral foi introduzido pela primeira vez por Schreiber e colegas . Após o cruzamento de ratos transgênicos para o gene v-Ha-ras com ratos transgênicos que abrigavam E6/E7 do vírus do papiloma humano (HPV)-16, foi observado o desenvolvimento de tumores na boca, ouvido e olho a partir de cerca de 3 meses de idade. Em 6 meses, 100% dos animais bi-transgênicos tinham desenvolvido tumores orais, enquanto a prevalência em qualquer um dos dois grupos mono-transgênicos era de 0% . O pré-requisito de um segundo ataque genético para tumorigenese também foi relatado para um modelo transgênico de K-rasG12D, no qual um Cre recombinase tamoxifen-induzível sob o controle do promotor queratina 14 (K14) foi utilizado para o alvo do locus K-ras endógeno. No modelo mono-transgene, apenas papilomas grandes na cavidade oral e hiperplasias na língua foram observados após 1 mês de tratamento com tamoxifeno . No entanto, se os ratos foram cruzados com os ratos boiados p53, 100% dos ratos compostos desenvolveram carcinomas da língua logo 2 semanas após a indução do tamoxifeno . Além da expressão de oncogenes virais E6/E7 e perda do TP53, a deleção homozigótica do fator de transcrição tipo krüppel 4 (KLF4) e a deleção heterozigótica do SMAD4 foram identificadas como segundos hits genéticos que, em conjunto com uma mutação de condutor oncogênico, promovem a formação de tumor oral com alta prevalência (Tabela 2).

Embora se recapitule a progressão do HNSCC, a adequação dos modelos de HNSCC descritos acima como plataforma para explorar novas abordagens de tratamento molecular direcionado permanece de alguma forma questionável, considerando que as alterações genéticas que conduzem à tumorigenese nestes animais estão ausentes ou só raramente encontradas em pacientes com HNSCC. Em geral, mutações na SARH e KRAS foram detectadas em apenas 6 e 0,2% dos pacientes com CECP, e deleção homozigotos de KLF4 e SMAD4 em 0 e 4% dos casos, respectivamente. Além disso, os casos que abrigam um dos genótipos compostos propensos ao tumor dos GEMMs descritos acima não foram identificados no Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) da coorte HNSCC. Um GEMM de HNSCC espontâneo mais parecido com as características moleculares da doença humana pode ser o modelo único de SMAD4 em epitélio de cabeça e pescoço (HN-Smad4del/del) relatado por Bornstein e colegas . Na verdade, embora a deleção homozigota seja rara, a perda heterozigota do SMAD4 é detectada em 30-35% dos HNSCCs primários associados à desregulamentação dos níveis de expressão do Smad4 . Mais recentemente, tem sido relatada uma heterogeneidade intratumoral significativa da perda de SMAD4 em tumores primários de HNSCC. Curiosamente, em culturas ex vivo derivadas do PDX, a subpopulação celular apresentando perda heterozigótica de SMAD4 por deleção ou redução da expressão superou as células com genótipo SMAD4 do tipo selvagem do tumor parental, sugerindo uma vantagem de sobrevivência das células com deficiência de Smad4 . Em apoio à adequação deste GEMM de um só knockout, o HNSCC de ratos HN-Smad4del/del exibiu maior instabilidade genómica , que se correlacionou com a expressão e função desregulada dos genes que codificam proteínas na via de reparação da anemia de Fanconi/BRCA, também ligada à susceptibilidade ao HNSCC em humanos . Além disso, tanto o tecido normal da cabeça e pescoço quanto o HNSCC de ratos HN-Smad4del/del apresentaram inflamação grave que também tem sido ligada à patogênese em humanos, onde bactérias orais e mediadores inflamatórios associados à doença periodontal podem ser co-fatores na iniciação e promoção do SCC oral .

Desde o relatório original em 2009, o modelo HN-Smad4del/del tem sido usado para analisar em detalhes os processos moleculares envolvidos na tumorigenese do HNSCC. Ao nosso conhecimento, ele ainda não foi explorado para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Esta restrição pode ser explicada por um tempo médio de início de 40 semanas para o desenvolvimento tumoral neste modelo, uma limitação semelhante aos modelos animais induzidos por carcinógenos de câncer oral (Tabela 2). A integração do tratamento carcinogênico para acelerar a formação do tumor em GEMMs monotransgênicos pode, assim, representar uma forma adequada para resolver esta limitação, como já demonstrado com sucesso em estudos de GEMMs abrigando uma deleção em um gene supressor do tumor (GRHL3 , PTEN ) ou superexpressor de microRNAs oncogênicos (Tabela 1).

Modelos de xenoenxertos derivados de pacientes

O desenvolvimento e a melhoria de cepas de camundongos gravemente imunodeficientes tem aumentado notavelmente a disponibilidade de modelos PDX para a pesquisa do câncer. O estabelecimento bem sucedido dos modelos PDX HNSCC tem sido relatado por vários grupos de pesquisa. Na nossa própria série, foi observada uma taxa geral de gravura de 48%, no entanto, as taxas de gravura parecem variar muito entre os diferentes subgrupos de pacientes. Os fatores limitantes para a enxertia ainda não foram claramente identificados. O local do implante e as cepas de camundongos parecem influenciar a taxa de tomada. Além disso, fatores de risco patológico como histologia tumoral e estado do HPV são importantes determinantes da formação do PDX. Em geral, tumores indiferenciados de HPV-negativos com crescimento agressivo são mais propensos a serem enxertados. Assim, a taxa e a cinética da formação de PDX têm sido associadas a um prognóstico desfavorável dos pacientes. Ao contrário dos tumores HPV-negativos, os tumores HNSCC associados ao HPV frequentemente não conseguem engravidar. Uma vez que estes tumores estão a crescer em locais imuno-associados como a amígdala ou a base da língua, o seu transplante para ratos imunodeficientes sem controlo imunológico das células infectadas viralmente comporta o risco de co-transferir células B positivas do vírus Epstein-Barr (EBV). Como resultado, a proliferação descontrolada de células B e a transformação para linfoma EBV+ ocorre frequentemente. Como a taxa de proliferação destes linfomas artificiais é muito maior do que a proliferação de células tumorais em fragmentos de tecido transplantados de SCC, os transplantes tumorais originais são frequentemente supercrescidos . Assim, a validação histopatológica do PDX por um patologista certificado pelo conselho é essencial para confirmar a histologia do carcinoma escamoso celular do modelo.

A questão de quão bem o PDX se assemelha ao tumor primário do paciente tem sido abordada por muitos grupos. Como mostrado para outras entidades tumorais, modelos de HNSCC estabelecidos em ratos apresentam características histopatológicas como o tumor original do paciente. Uma análise genética abrangente dos tumores primários e modelos PDX derivados através do sequenciamento da próxima geração revelou padrões semelhantes e frequências alélicas de aberrações moleculares . A correlação entre os perfis mutacionais dos tumores originais e modelos derivados foi significativamente maior para PDX (R = 0,94) em comparação com as linhas celulares (R = 0,51) . A análise do metiloma também mostrou alta concordância entre PDX e tumores de pacientes. De fato, uma média de apenas 2,7% dos locais de CpG testados foram submetidos a grandes alterações de metilação como resultado do transplante de tumores em camundongos . Além disso, estudos de expressão gênica mostraram a relação geral dos tumores parentais com seus PDX, como confirmado pela sua agregação em conjunto na análise hierárquica não supervisionada da agregação. Em contraste com a crescente evidência de correspondência entre os perfis genético e transcriptométrico entre PDX e HNSCCs primários, existem apenas poucos dados para expressão de proteínas. Uma primeira análise preliminar do tecido PDX usando a matriz de proteína de fase reversa (RPPA) revelou perfis de proteína comparáveis aos dados de expressão de proteína TCGA HNSCC, sugerindo similaridade entre tecido original e modelo derivado também neste nível.

Uma característica chave do PDX é a conservação de um compartimento estromal. Mesmo que o estroma humano seja substituído pelo estroma do rato nas primeiras passagens, um estroma integrado permanece, o que torna possível a avaliação de compostos que visem este compartimento ou o cruzamento entre o compartimento do estroma e as células tumorais. Além disso, tumores cultivados em ratos constroem sua própria vasculatura tumoral, o que oferece a oportunidade de avaliar a rede angiogênica e a interferência com compostos direcionados à angiogênese. Após o estabelecimento do modelo, os tumores cultivados em camundongos podem ser colhidos, congelados vitalmente e sempre que necessário descongelados e re-transplantados em camundongos. Em geral, o PDX pode ser considerado um método adequado para a expansão do tecido tumoral e um promissor sistema de modelo pré-clínico para estudos mecanicistas e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.

Com o recente advento da imunoterapia no algoritmo de tratamento de muitos tipos de câncer, incluindo o HNSCC, a falta de um ambiente imunológico funcional no PDX tornou-se um grande obstáculo a ser superado. Diferentes estratégias têm sido propostas para implementar um sistema imunológico em ratos imunodeficientes. No estudo pioneiro de Mosier e colegas, foi demonstrado que a injeção de células mononucleares periféricas humanas (PBMCs) resultou na reconstituição estável a longo prazo de um sistema imunológico humano funcional em camundongos com imunodeficiência combinada severa (SCID). Assim, modelos PDX imunoproficientes poderiam ser gerados pela transferência de PBMCs do paciente para os ratos portadores de PDX. No entanto, o desenvolvimento adequado das células imunitárias e o priming das células T estão em falta nesta abordagem, resultando na ausência de certas linhagens de células imunitárias humanas em ratos. Protocolos de reconstituição imunológica mais sofisticados desenvolvidos posteriormente são baseados na transferência de células-tronco CD34+ humanas para ratos NSG, assim como o implante de timo fetal humano e tecido hepático sob a cápsula renal destes ratos. Esta abordagem resultou na gravação a longo prazo e na reconstituição sistêmica de um sistema imunológico humano completo, incluindo células imunológicas humanas com várias linhagens, compostas de T, B, NK, células dendríticas e macrófagos. Infelizmente, este método não é viável para um grande número de PDX, devido à complexidade do modelo. Um procedimento mais promissor tem sido proposto no melanoma onde linfócitos T de infiltração tumoral (TILs) isolados do tecido tumoral usado para geração de PDX foram expandidos in vitro pela interleucina humana 2 (IL2) antes da injeção em camundongos PDX portadores de tumor .

O potencial dos modelos PDX para orientar o tratamento do paciente

O valor do PDX para orientar a decisão de tratamento individual do paciente ainda não foi esclarecido. Em geral, correlações paciente-para-PDX em diferentes entidades tumorais comparando respostas de tratamento entre ratos e pacientes têm sido feitas usando dados retrospectivos sobre o resultado clínico. Pelo nosso conhecimento, não foram feitas comparações com amostras suficientemente grandes no HNSCC. Obstáculos para o mérito de tais abordagens compreendem a dosagem de medicamentos em camundongos, que geralmente reflete a dose máxima tolerada, a variabilidade de dose dentro de diferentes cepas de camundongos e especialmente a definição de um desfecho clinicamente significativo. No cenário clínico, as respostas tumorais são determinadas por RECIST. Em camundongos, um conjunto muito heterogêneo de possíveis desfechos tem sido usado para determinar a eficácia de tratamentos com um único medicamento, incluindo regressão tumoral expressa como inibição relativa de crescimento, volume tumoral em comparação a um grupo controle, inibição de crescimento tumoral e tempo para o desfecho. Outras limitações gerais do modelo são o alto custo do estabelecimento do PDX, variando as taxas de gravura e os tempos desde o primeiro transplante até os resultados da triagem do tratamento. Até agora, em nossa grande coleção de quase 80 modelos de PDX HNSCC, não conseguimos estabelecer um valor preditivo das respostas tumorais específicas do medicamento no modelo de xenoenxerto. No entanto, várias empresas anunciam o PDX como uma ferramenta para prever a resposta ao tratamento. Em 2016, a Champions Oncology lançou um estudo de viabilidade (NCT02752932) para explorar o valor preditivo do PDX. Infelizmente, nenhum resultado foi publicado até agora.

A principal desvantagem do PDX é o tempo prolongado necessário para o estabelecimento e expansão do modelo em comparação com os organóides, tornando menos provável o seu uso futuro como plataforma de triagem individual de medicamentos na rotina clínica. Além disso, a reconstituição com componentes de TME derivados de pacientes que estão faltando em ambos os modelos gerados pelos protocolos atuais deve ser muito mais fácil nos organóides do que nos modelos de camundongos xenograft. Isso permitirá a inclusão de terapias anticancerígenas que afetam a TME (por exemplo, everolimus, bevacizumab, anticorpos anti-PD-1/PD-1 L) em futuras abordagens de triagem ex vivo.