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A ATPase Vacuolar (V-ATPase) é uma bomba de protões ATP multi-subunitária que acidifica as vesículas intracelulares e o meio extracelular e, portanto, está envolvida num grande número de funções biológicas . Revisões anteriores descreveram elegantemente a estrutura e a função do V-ATPase . Aqui revisamos a literatura recente sobre a função do V-ATPase e sua contribuição para vários processos celulares na fisiologia normal, com ênfase no câncer. Também apresentamos em detalhes a regulação de Notch e outras vias de sinalização por V-ATPase revelando uma função até então menos conhecida do V-ATPase na sinalização celular.

Subunidade de isoformas

Estruturalmente, o V-ATPase é um nanomotor rotativo composto de múltiplas subunidades, cada uma com múltiplas isoformas . As subunidades estão organizadas em dois domínios: um domínio periférico V1, responsável pela hidrólise ATP e um domínio de membrana integral VO, que funciona na translocação de prótons. A estrutura do V-ATPase tem sido altamente conservada entre todas as células eucarióticas e está envolvida em diversas funções através das espécies. Nos mamíferos, o domínio V1 tem oito subunidades diferentes (A, B, C, D, E, F, G e H) enquanto o domínio VO é composto por seis subunidades diferentes (a, c, c’, c’, c”, d, e) . A exigência diferencial de acidificação em vesículas intracelulares e meio extracelular aciona a função e regulação do V-ATPase. Para diminuir ou aumentar a eficiência da bomba, o V-ATPase controla o acoplamento entre a hidrólise ATP e o bombeamento de prótons. Este processo é trazido pela subunidade ‘a’ do V-ATPase . Da mesma forma, o direcionamento específico de célula e compartimento do V-ATPase também depende das isoformas da subunidade ‘a’. VOa é uma proteína de membrana integral 100-kDa com uma cauda citosólica terminal N e 9 domínios transmembrana. Quatro isoformas da subunidade ‘a’ (a1, a2, a3 e a4) foram identificadas com uma distribuição vesicular e tipo celular distintos. VOa1 é expressa nas vesículas sinápticas e VOa2 é expressa nas vesículas intracelulares, como o golgi e os endossomos iniciais. VOa3 é expresso na membrana plasmática dos osteoclastos, enquanto VOa4 é expresso na membrana plasmática das células intercaladas renais. Além disso, o N-termino da subunidade ‘a’ é um motivo importante que liga o domínio V1 à membrana e também tem sido relatado como sendo um sensor de pH único em lisossomos . A expressão e localização isoforma da subunidade ‘a’ é crítica para o funcionamento do V-ATPase .

Função fisiológica do V-ATPase

O V-ATPase é ubiquamente expresso e desempenha diversas funções biológicas dentro das células da maioria dos tecidos através da acidificação vesicular, luminal e extracelular . Para alcançar numerosas funções celulares, a V-ATPase facilita a concentração localizada de prótons em vesículas ácidas das vias endocíticas e exócitas .

Acidificação ventricular

Endossomos e lisossomos

V-ATPase é mais conhecida pelo seu papel na acidificação de vesículas intracelulares como endossomos e lisossomos. Na superfície dos endossomos, a V-ATPase acidifica e modula importantes processos celulares como endocitose de receptores e tráfico vesicular. A acidificação dos endossomos por V-ATPase é crucial para a internalização endocítica dos complexos ligandicos receptores. Após a iniciação da sinalização, um pH mais baixo nos endossomos libera o ligante reciclando-o para a membrana plasmática . Nos lisossomos, os V-ATPases ajudam a manter o baixo pH de 4,5 e também são importantes para o transporte de hidrolases ácidas recentemente sintetizadas do Golgi para os lisossomos. Além disso, fagosomas e auto-fagosomas em macrófagos e células tumorais respectivamente, também dependem do pH ácido mantido pelo V-ATPase para a atividade das enzimas degradantes nestes compartimentos .

Golgi

A classificação dos equipamentos exócitos e endocíticos começa no complexo do Golgi. Importante, a maioria das proteínas sofre glicosilação, uma modificação pós-tradução crucial dentro do aparelho golgi . Mutações na subunidade a2 do V-ATPase resultam em cutis laxa, uma síndrome autossômica recessiva e recessiva da pele onde se observa uma glicosilação deficiente das proteínas de matriz extracelular. Embora a V-ATPase tenha sido geneticamente correlacionada ao defeito de glicosilação, a relação exata entre a acidificação do golgi e a maturação da proteína não foi explorada.

Vesículas especializadas

V-ATPase é uma proteína importante expressa em compartimentos especializados de tipos celulares específicos. Durante a neurotransmissão, a V-ATPase fornece a força motriz protônica crucial necessária para a formação de vesículas sinápticas e subseqüente acúmulo de neurotransmissores. Nas células pancreáticas, a acidificação dependente da V-ATPase é importante para a exocitose da insulina . A V-ATPase também rege o equilíbrio fissão-fusão do sistema vesicular pela interação com a proteína solúvel de fixação NSF Receptor (SNARE) e GTPase .

Acidificação luminosa

V-ATPases foram inicialmente identificadas em vesículas intracelulares, mas a importância da membrana plasmática V-ATPases tem crescido enormemente . Nas células epiteliais do túbulo proximal do rim, a isoforma a4 da V-ATPase mantém o equilíbrio ácido-base e a acidificação da urina (acidose sistêmica) . Da mesma forma, nas células claras do epidídimo, a membrana plasmática V-ATPase acidifica o compartimento luminal e ajuda na maturação e armazenamento dos espermatozóides . Nos osteoclastos ósseos, o lisossomal V-ATPase transloca para a membrana plasmática durante a reabsorção óssea para acidificar as lacunas. O V-ATPase plasmático é crucial para o funcionamento das células interdentais do ouvido, células epiteliais do nariz e visão . A disfunção V-ATPase está associada a condições patológicas como acidose tubular renal, surdez, comprometimento do sentido olfactivo e osteoporose. 1.

Role in cancers

Recentemente, a membrana plasmática V-ATPase tem sido extensivamente estudada no câncer, onde ajudam a manter um ambiente alcalino intracelular favorável ao crescimento e um ambiente ácido extracelular favorável à invasão . Em tumores, a expressão da V-ATPase tem se mostrado mais elevada em direção à ponta da proliferação de células cancerosas da mama, próstata, pulmão, ovário, fígado, pâncreas, melanoma e cânceres esofágicos. Especificamente, as células cancerosas da mama expressam V-ATPase na membrana plasmática para acidificar o espaço extracelular e a expressão quantitativa de V-ATPase se correlaciona com a invasividade e o potencial metastático da linha celular . A contribuição exata da V-ATPase para o tumor em crescimento é alcançada através de sua influência nos mecanismos moleculares/vias discutidos abaixo.

Immunomodulação

A isoforma a2 da ATPase Vacuolar (VOa2 ou a2V) tem um papel imunomodulador na gravidez e no câncer. Estudos envolvendo a2V em biologia reprodutiva descobriram um papel até então desconhecido para esta molécula na maturação e produção normal do esperma, além da implantação do embrião. No microambiente tumoral, o domínio terminal N de a2V polariza os macrófagos para os macrófagos associados ao tumor (tipo M2) e estimula diferentes subconjuntos de monócitos através da via de endocitose. Após esses achados, foi demonstrado que a deficiência de a2V nas células tumorais altera a população de macrófagos residentes no microambiente tumoral e afeta o crescimento tumoral in vivo . a2V é expressa nos grânulos primários dos neutrófilos e ajuda a manter o pH na via exótica durante a ativação dos neutrófilos . O tratamento dos neutrófilos humanos com peptídeo terminal N recombinante de a2V (a2NTD) promove a migração e polarização dos neutrófilos . Juntos, estes estudos destacam o papel imunomodulador do V-ATPase na obtenção de respostas imunes potentes.

Efeito de Warburg

Uma marca do câncer é o efeito Warburg onde as células mudam da fosforilação oxidativa para a glicólise aeróbica . Vários estudos apontam para a hipótese de que as células cancerígenas dependem mais da V-ATPase do que qualquer outro regulador de pH, como trocadores Na+H+, transportadores de bicarbonato e sínteres de próton-lactato para alcançar o pH intracelular alcalino favorável e o pH ácido extracelular. A alcalização do citosol activa a glicólise, suprimindo a fosforilação oxidativa . Além disso, alguns oncogenes relacionados à glicólise como o Fator Induzido de Hipóxia (HIF-1) são regulados pela alteração do pH induzida pela V-ATPase .

Proteases ácidas

A acidificação extracelular em tumores é a ativação de proteinases ácidas, que são enzimas que clivamam a matriz extracelular durante a invasão tumoral. Estas enzimas pertencem à classe das proteinases ácidas como as catepsinas , Matrix Metallo Proteinases (MMP) e gelatinases e são activas a pH ácido . Além disso, a atividade das enzimas intracelulares como γ-secretase, que são ativas em pH ácido, também é realçada com o aumento da atividade da V-ATPase em vesículas. Posteriormente, isto leva à desregulação de vias oncogênicas como Notch.

Resistência a drogas e inibidores de V-ATPase

O pH alterado do microambiente tumoral pode influenciar a sensibilidade às drogas quimioterápicas . Antraciclinas e alcalóides têm uma pKa de 7 a 8 e são internalizados no compartimento endossômico . Dados recentes sugerem que o uso de inibidores de V-ATPase não só causa alterações citosólicas do pH, levando à morte celular, mas também aumenta a absorção de drogas, tornando assim um componente eficaz do tratamento combinatório do câncer. No câncer de ovário, o a2V é expresso na extremidade superior das células cancerosas e modula a atividade do MMP9. Além disso, o a2V contribui na resistência a drogas mediadas pela cisplatina no câncer de ovário e a inibição seletiva do a2V poderia servir como uma estratégia eficiente para tratar o câncer de ovário quimio-resistente . Os inibidores de V-ATPase bafilomicina e concanamicina pertencem a uma classe de pleomacrolides que visam o setor VO e inibem eficientemente a atividade da V-ATPase. Recentemente, Apicularen e archazolids têm sido relatados como inibidores potentes e específicos da V-ATPase . Entretanto, todos os inibidores de pequenas moléculas disponíveis têm toxicidade significativa, considerando o envolvimento da V-ATPase na fisiologia celular normal. Portanto, o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes específicos contra a isoforma da subunidade ‘a’ que tem expressão específica celular pode ser uma alternativa eficiente para causar inibição direta da V-ATPase, ao mesmo tempo em que também ataca indiretamente a resistência a múltiplas drogas com uso combinatório .

Autofagia

Autofagia é o processo de degradação seletiva ou reciclagem de cargas entregues por autofagosomas a lisossomos . As células tumorais mostram uma dependência variada da autofagia à medida que progridem do tumor primário para o tumor sólido altamente metastásico . As cargas celulares marcadas para degradação são entregues aos lisossomos por processos autofágicos. A atividade de bombeamento de prótons do V-ATPase é responsável pela ativação de hidrolases de ácido lisossômico que degradam a captação de carga dos autofagosomas . Embora estudos apontem para a necessidade de V-ATPase funcional para autofagia e inibidor de V-ATPase a Bafilomicina é utilizada como inibidor clássico de autofagia , o papel exato da V-ATPase na dinâmica de membrana do fluxo autofágico não é compreendido. Um estudo recente relatou que o tratamento com Bafilomicina, que inibe a atividade tanto da bomba SERCA V-ATPase quanto da bomba Ca2+, levou a um bloqueio no fluxo autofágico, enquanto os lisossomos deficientes em V-ATPase ainda eram capazes de se fundir com os autofagosomas. Estes resultados sugerem o envolvimento do V-ATPase na degradação da carga autofágica em lisossomos do que no fluxo autofágico e destacam a necessidade de desenvolver inibidores específicos e técnicas de manipulação genética para estudar o papel exato do V-ATPase em vários processos celulares importantes.

Sinalética

A via endolysosomal é importante tanto para a regulação positiva como negativa das vias de sinalização . O primeiro relatório conhecido de envolvimento do V-ATPase na sinalização veio de um estudo mostrando que a inibição do V-ATPase pela Bafilomicina afetou a internalização do EGFR . Desde então, o V-ATPase tem sido associado à transdução de sinal associada à m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β e Notch Signaling regulation.

Notch signaling

Talvez a via de sinalização mais bem estudada regulada pelo V-ATPase seja a Notch. Isto pode ser atribuído ao fato de que a sinalização Notch depende do caminho endolysosomal para sua ativação, manutenção e degradação dos mediadores-chave do caminho. O V-ATPase mantém o equilíbrio do pH celular e desempenha um papel importante na endocitose, ativação da protease e degradação da proteína. Especificamente, o a2V (subunidade V-ATPase – VOa2) foi previamente localizado para endossomos iniciais – o local para endocitose do receptor . Seguindo a ligação ligand, o receptor Notch toma a via endocítica e é clivado por proteases para ativação. Mais tarde, os receptores são degradados no lisossoma . Em Drososphila, mutações em Vps25, um componente da máquina ESCRT que regula a classificação endossômica dos receptores de sinalização, causa acúmulo do receptor Notch nos endossomos e melhora a sinalização Notch . Em um estudo analisando mutações drosophila de Hrs, outro componente do ESCRT, o Notch se acumula em endossomos mas não causa ativação ectópica da sinalização do Notch . A perda da autofagia leva à activação da sinalização de Notch nas células foliculares ovarianas de Drosophila devido à perturbação da degradação do Notch . Ao contrário destes relatos, um estudo independente descobriu que mutações na Rabconnection-3 interrompem a atividade de bombeamento do próton V-ATPase e acumulam a Notch nos endossomos tardios após a clivagem S2, reduzindo assim a sinalização da Notch nas células de Drosophila e mamíferos. Estes achados foram seguidos por relatórios em Drosophila indicando ainda que através da acidificação da via endolysosomal, o V-ATPase é necessário para a ativação do Notch nos endossomos, bem como para a degradação do Notch nos lisossomos . Durante o desenvolvimento de mamíferos, a expressão de uma subunidade negativa dominante do V-ATPase em precursores neurais reduziu a sinalização do Notch e esgotou as células-tronco neurais, levando à diferenciação neuronal. Recentemente, estudos em astrocitos na retina de ratos com mutação Nuc1 mostraram uma desregulação da sinalização de Notch. A redução na sinalização do Notch foi devida à mutação do βA3/A1-crystallin, que regula a atividade V-ATPase resultando em acidificação endossômica comprometida e a atividade secreta do βA3 afetando assim a taxa de processamento do receptor do Notch . Esta é uma descoberta interessante considerando que o papel do V-ATPase na visão, agora emergindo . Juntos, esses achados indicam que a regulação da sinalização Notch pelo V-ATPase pode ter resultados positivos e negativos, dependendo da localização celular da atividade V-ATPase afetada (endossomos vs lisossomos) e da dependência do processamento do receptor Notch no caminho endossômico . Embora o V-ATPase e Notch crosstalk tenha sido investigado no contexto da acidificação endolysosomal dependente do V-ATPase afetando a sinalização Notch, um relatório recente sugere que a regulação também poderia ser inversa. Especificamente, os autores sugerem que a Presinilina1 (PS1), um componente do complexo enzimático γ-secretase responsável pela clivagem do receptor Notch e do peptídeo amilóide β interage fisicamente com a isoforma VOa1 da V-ATPase e visa desde o retículo endoplasmático até os lisossomos. Nossos estudos identificaram que o V-ATPase regula a Notch Signaling no câncer de mama e desenvolvimento da glândula mamária . a2V é expresso na superfície das células epiteliais mamárias proliferantes e células triplas negativas do câncer de mama (TNBC), indicando seu papel na proliferação celular durante o desenvolvimento normal e doença. No TNBC, a inibição do a2V melhora a sinalização do Notch ao bloquear a degradação lisossômica e autofágica do receptor do Notch . A perda de a2V na glândula mamária de camundongo leva à ativação anormal do Notch e prejudica a morfogênese ductal, causando defeitos de lactação . A sinalização do entalhe é ativada durante o parto pré-termo induzido por infecção com PGN + poli (I:C), resultando em upregulação de respostas pró-inflamatórias, e sua inibição melhora a sobrevivência inutero de fetos vivos. Além disso, no trabalho de parto pré-termo induzido pela resposta inflamatória à injeção de LPS, foi observada a regulação ascendente da inflamação relacionada a Notch e a regulação descendente dos fatores de angiogênese. Tanto nos modelos de infecção quanto nos de trabalho de parto pré-termo inflamatório, conseguimos resgatar o fenótipo através do tratamento com inibidores da secreção γ (GSI) . Isso abre um caminho para uma importante direção futura, especialmente porque o GSI é um inibidor eficiente da Notch Signaling e está atualmente em testes clínicos para vários tipos de câncer. Com isto, o V-ATPase e Notch crosstalk emerge como importante durante o desenvolvimento normal e indiseases como Alzheimer e vários cancros .

Wnt signaling

O caminho de sinalização Wnt desempenha um papel importante na manutenção, polaridade e diferenciação das células e tecidos. Em humanos, a desregulação da sinalização de Wnt tem sido implicada no câncer . Um exemplo clássico de desregulação da sinalização de Wnt é o câncer colorretal onde a perda da Polipose Coli Adenomatosa (APC), um regulador negativo da sinalização de Wnt desencadeia a tumorigenese. Durante a sinalização, os ligandos Wnt actuam sobre as células alvo ligando-se ao Frizzed, Fz e LRP (baixa densidade-lipoproteína), um complexo receptor de superfície celular que leva à desmontagem do Glycogen Synthase Kinas (GSK-3) e subsequente libertação de β-catenin. β-catenin é o principal mediador a jusante da via Wnt, que activou os genes oncogenes alvo da Wnt como c myc e ciclinD1 . O (P) RR, Receptor Pro Renin também chamado ATP6ap2 atua como uma molécula adaptadora entre o V-ATPase e o complexo receptor LRP 5/6 de Wnt. Em Xenopus e Drosophila, foi demonstrado que o V-ATPase interage com o complexo de receptores LRP 5/6 e que tanto o choque genético como a inibição farmacológica do V-ATPase interferem na transdução do sinal e reduzem significativamente a resposta celular à sinalização Wnt . Além disso, a V-ATPase regula indiretamente o mediador de sinalização Wnt β-catenin e Notch mediador NICD foi demonstrado através da autofagia .

Sinalização TGF-β

Mutações no gene a2V causam a síndrome da Cútis Laxa (LCA) recessiva autossômica, onde os pacientes apresentam menor quantidade de proteínas de matriz extracelular como colágeno, resultando em fenótipo de pele enrugada . Em apoio a estas descobertas, uma investigação mecanicista das mutações responsáveis pela mutação da cutis laxa em humanos identificou a mutação a2P405L como sendo instável e defeituosa no tráfico do Golgi em comparação com o tipo selvagem . Além disso, relatos apontam para um defeito de glicosilação no LCA que resulta em elevação promove a transformação do fator de crescimento beta (TGF-β) sinalizando nesses pacientes com mutações a2V . O V-ATPase promove a transição epitelial-mesquelimal induzida por TGF-β das células epiteliais proximais tubulares de ratos . Além do seu efeito na sinalização de Notch, a via Wnt ativada por inibição de a2V em TNBC e a via TGF-β em células epiteliais mamárias . Isto sugere que o papel do a2V na modulação dos mediadores de sinalização não é exclusivo do Notch. Além disso, esses ratos também apresentaram uma redução do colágeno total devido à glicosilação deficiente .

sinalização mTOR

Na sinalização mTOR, o mTOR da serina trionina quinase e outros componentes do complexo mTOR 1 (mTORC1) detectam a disponibilidade de aminoácidos, e modulam o crescimento .Na estimulação dos aminoácidos, o V-ATPase ativa a atividade do Fator de Troca Guanina (GEF) do Ragulador em direção ao RagA que, por sua vez, promove a hidrólise do GTP RagC. O RagA ligado ao GTP e o RagC carregado com GDP juntos recrutam mTORC1 para a superfície lisossomal . O mTORC1 activado responde à sinalização do factor de crescimento que controla a mudança reguladora da morte celular para a proliferação . Um relatório recente sugeriu o envolvimento do regulador da bomba de protões Atp6v1c1 para melhorar o crescimento do câncer de mama, ativando a via da mTORC1 e a metástase óssea, aumentando a atividade V-ATPase .