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Fibroblastos RTT mostram uma ativação de autofagia defeituosa sob condições de fome

A fim de verificar a hipótese relativa a uma autofagia defeituosa em pacientes RTT, analisamos a ativação de autofagia sob condições de fome em fibroblastos primários de pele isolados de pacientes RTT (n = 4) e sujeitos saudáveis (n = 4)17,19.

Definimos primeiramente a viabilidade ao longo do tempo de fibroblastos saudáveis e RTT cultivados em meio faminto pelos testes de exclusão MTT e Trypan blue. Com relação à viabilidade dos fibroblastos RTT cultivados em meio padrão, a viabilidade dos fibroblastos RTT diminuiu após 4 h de inanição (20 ± 3,3% das células que morrem, p < 0,05); esta porcentagem aumentou consideravelmente após 6-8 h de inanição (60 ± 5,1% das células que morrem, p < 0,05) (Fig. 1a). Por outro lado, fibroblastos saudáveis ainda eram totalmente viáveis após 4 h de inanição com apenas uma redução muito baixa na viabilidade após 6-8 h (10 ± 1,2% das células que morrem, p < 0,01) com respeito à viabilidade dos fibroblastos cultivados em meio padrão (Fig. 1a). Assim, a partir de uma comparação direta da viabilidade das duas linhas celulares em cada ponto de tempo, verificou-se que a viabilidade dos fibroblastos RTT estava severamente comprometida a partir do tempo 4 h (ver detalhes nas legendas das figuras, p < 0,05). Além disso, uma análise de Western blotting (WB) destacou que nos fibroblastos RTT que haviam passado fome durante 4 h, uma faixa correspondente ao fragmento p25 do poli (ADP-ribose)polimerase-1 (PARP) foi muito aumentada (96 ± 4%, p < 0,001) com relação à detecção de desmaio no tempo 0. Este fragmento é liberado pela degradação dependente da caspase-dadegradação da proteína durante a fase inicial da indução da apoptose (Fig. 1b)35. O fragmento p25 era quase indetectável nos fibroblastos saudáveis sob as mesmas condições experimentais.

Estes dados confirmaram que os fibroblastos RTT não toleraram crescimento em um meio faminto, e rapidamente foram submetidos à apoptose. Portanto, investigamos ainda mais o fluxo autofágico monitorando o clearance do marcador LC3B-II na presença e na ausência de um inibidor de lisossomo, como a cloroquina (CQ)24,25,26,27,28,29,30.

Após descartar o efeito citotóxico ligado ao CQ (Fig. Suplementar S1), fibroblastos sadios e RTT foram cultivados em repouso ou em meio de inanição por 2 h na presença ou ausência de 20 µM de CQ para quantificar a relação LC3B-II/GAPDH pela WB (Fig. 2a). O padrão da razão LC3B-II/GAPDH (ou qualquer outro controle interno que não seja modulado pela autofagia) sob condições de ativação da autofagia e na presença e na ausência de CQ (ou qualquer outro inibidor lisossômico) é considerado uma estratégia válida para monitorar o fluxo de autofagia.

Em fibroblastos saudáveis, cultivados em meio padrão, o LC3B-I foi claramente imunodetectado, enquanto o LC3B-II foi fraco. A relação LC3BII/GAPDH de fibroblastos saudáveis cultivados em meio padrão na ausência e na presença de CQ foi comparável (Fig. 2a, painel esquerdo). Esta observação sugere que a autofagia basal foi quase indetectável nos fibroblastos saudáveis (Fig. 2a, painel esquerdo).

Quando estas células foram cultivadas no meio faminto e na ausência de CQ durante 2 h, a relação LC3B-II/GAPDH aumentou (60 ± 4.8%, p < 0,05) em comparação com a dos fibroblastos saudáveis cultivados em meio padrão, seja na ausência ou na presença de CQ (que foi, como mencionado anteriormente, idêntica) (Fig. 2a, painel esquerdo e direito). Este comportamento, de fato, indica que a LC3-I realmente sofreu lipidação para formar a LC3B-II, que é um marcador precoce da ativação da autofagia24,25,26,27,28,29,30. Para testar a presença dessa ativação de autofagia, cultivamos células em meio faminto na presença de CQ durante 2 h e elas apresentaram um aumento adicional da razão LC3B-II/GAPDH (94 ± 5,5%, p < 0,001) em relação aos fibroblastos saudáveis cultivados em meio padrão (Fig. 2a, painel esquerdo e direito).

Outras vezes, a diferença entre a relação LC3B-II/GAPDH de fibroblastos sadios cultivados em meio inóspito na ausência e na presença de CQ foi estatisticamente significativa (p < 0,05, Fig. 3a, painel esquerdo e direito). 2a, painel esquerdo)

Assim, de acordo com a interpretação padrão do padrão LC3B-II pela análise WB, o resultado geral indica que, na ausência de nutrientes, os fibroblastos saudáveis estimulam a formação de autofagosomas que se acumulam na presença de CQ. Este comportamento é compatível com um fluxo autofágico normal24,25,26,27,28,29,30. Curiosamente, no caso dos fibroblastos RTT cultivados em meio padrão, enquanto a LC3B-I era claramente imunodetectada, a LC3B-II era muito fraca nas células tanto na ausência como na presença de CQ (Fig. 2a, painel esquerdo). Sob condições de fome e na ausência de CQ, o aparecimento de uma banda tênue correspondente à LC3B-II nos fibroblastos RTT somente após longa exposição do filtro sugeriu que pelo menos uma lipidação mínima da LC3B-I ocorreu (Fig. 2a, painel esquerdo). Assim, a relação LC3B-II/GAPDH entre os fibroblastos LC3B-II crescidos em meio faminto na ausência de CQ foi aumentada (93 ± 5,5%, p < 0,001) em relação aos fibroblastos LC3B-II crescidos em meio padrão na ausência de CQ (Fig. 2a, painel direito).

Entretanto, a administração de fibroblastos CQ para RTT cultivados em meio inantâneo não aumentou ainda mais a razão LC3B-II/GAPDH que foi aumentada (95 ± 3,5%, p < 0,001) se comparada às células cultivadas em meio padrão na ausência de CQ, mas não foi aumentada significativamente em relação à razão LC3B-II/GAPDH de fibroblastos RTT cultivados em meio inantâneo na ausência de CQ (Fig. 2a, painel esquerdo). Este achado sugeriu que não ocorre acúmulo de autofagosomas nas células RTT e a análise WB suportou um bloco, em algum nível, no fluxo autofágico24,25,26,27,28,29,30,31,

Para reforçar ainda mais nossa hipótese sobre um possível fluxo autofágico defeituoso, verificamos a degradação de dois substratos autofágicos reconhecidos em fibroblastos sadios e RTT que passaram fome durante 2 e 4 h na ausência de CQ, a saber (i) a proteína p62/SQSMT1, que auxilia na liberação de agregados protéicos poli-ubiquitinados e é ela própria degradada pelas hidrolases lisossômicas36; (ii) o proteasoma 20 S, que é rapidamente degradado sob condições de fome37,38. Com relação ao nível basal das duas proteínas (i.e. tempo 0), observou-se uma diminuição ao longo do tempo da razão p62/tubulina (44 ± 10% após 4 h, p < 0,001) e da razão PSMA-3/GAPDH (i.e. a subunidade α7 do proteasoma 20 S) (45 ± 3,1% após 2 h, 11 ± 5,2% após 4 h, em ambos os casos p < 0,001) em fibroblastos saudáveis (Fig. 2b, painel superior).

No caso dos fibroblastos RTT, a diminuição da razão p62/tubulina ao longo do tempo não foi estatisticamente significativa mesmo após 4 h (89 ± 9%), enquanto a diminuição da razão PSMA3/GAPDH em 2 h (81 ± 4,4%, p < 0,05) e 4 h (78 ± 5,1%, p < 0,05) foi significativamente diferente se comparada com o nível basal da proteína (ou seja, tempo 0) (Fig. 2b, painel inferior). Entretanto, as diferenças entre os grupos saudáveis e RTT foram estatisticamente significativas no caso da razão p62/tubulina apenas em 4 h (p < 0,05), enquanto a razão PSMA3/GAPDH foi significativamente diferente entre os grupos experimentais ambos em 2 h (p < 0,05).05) e 4 h (p < 0,001) (Fig. 2b, painel inferior).

Interessantemente, os padrões β-tubulin e GAPDH, usados como controles internos para a coloração p62 e a coloração PSMA3, respectivamente, foram inalterados durante 4 h de inanição em fibroblastos saudáveis. Entretanto, a intensidade da faixa β-tubulin, assim como a da faixa GAPDH, diminuiu significativamente nos fibroblastos RTT que passaram fome durante 4 h em comparação com o observado no tempo 0 ou 2 h para essas células (Fig. 2b, painel superior). Esta redução foi provavelmente devida ao menor número de fibroblastos RTT vivos colhidos neste momento (de acordo com a baixa viabilidade dos fibroblastos RTT a 4 h de inanição relatada na Fig. 1a) e não devido a uma diminuição da regulação de β-tubulin ao longo do tempo. Como um todo, verificou-se que os fibroblastos RTT não degradaram eficientemente estes substratos de autofagia, suportando a hipótese de uma autofagia defeituosa.

Para lançar mais luz sobre as características deste bloco, realizamos uma análise de imunofluorescência usando o anticorpo LC3B. Analisamos fibroblastos sadios e RTT cultivados em meio padrão na ausência de CQ (condição de repouso) e no meio de inanição durante 2 h na presença ou ausência de 20 µM CQ (Fig. 2c). Consistente com a lenta taxa metabólica das células primárias, verificamos que os fibroblastos em repouso saudáveis e RTT apresentaram uma coloração fraca e difusa de LC3B+ com uma baixa percentagem de células mostrando mais de 10 pontos (ou seja, autofagosomas) (8 ± 5% e 1 ± 0,5%, respectivamente) indicando que, por imunofluorescência, a autofagia basal foi pouco detectável de acordo com os dados relatados na Fig. 2c. 2a.

Com respeito às células cultivadas em meio padrão, a porcentagem de fibroblastos saudáveis cultivados em meio faminto (na ausência de CQ) apresentando pelo menos 10 autofagosomas LC3B+ foi acentuadamente aumentada (82 ± 10%, p < 0,005), enquanto os fibroblastos RTT cultivados em meio faminto apresentaram um ligeiro aumento (17 ± 8%, p < 0,001). De fato, a porcentagem de fibroblastos sadios cultivados em meio inanição com pelo menos 10 autofagosomas foi significativamente maior que a dos fibroblastos RTT cultivados sob a mesma condição experimental (p < 0,005). Os autofagosomas estavam localizados principalmente na região perinuclear. Na presença de CQ foi observada ainda uma coloração difusa e intensa esperada do LC3B+, embora neste caso a coloração difusa não permitisse quantificar com precisão o número de pontos.

Administração da CQ foi ineficaz em fibroblastos RTT, indicando claramente uma grave deficiência da biogênese do autofagosoma (Fig. 2c).

Pela relevância da suposta deficiência da biogênese do autofagosoma, foi adotada uma abordagem adicional para confirmar esta observação. Tanto os fibroblastos sadios quanto os RTT, que passaram fome durante 2 h na ausência de CQ, foram corados com um corante específico (Cyto-ID) para a membrana auto-fagosomal e analisados por imunofluorescência. Mesmo neste caso, enquanto nos fibroblastos saudáveis foram realmente detectados vários autofagosomas, nos fibroblastos RTT foi observado apenas um número limitado de vesículas pequenas e isoladas (Fig. Suplementar S2). A diferença na porcentagem de células com pelo menos 5 pontos Cyto-ID positivos entre fibroblastos saudáveis e RTT foi marcadamente significativa (80 ± 4% vs 8 ± 6%, respectivamente, p < 0,001). Portanto, a análise geral forneceu evidências de que uma biogênese autofagosômica defeituosa ocorre nos fibroblastos primários RTT.

Buchas maduras de pacientes RTT portadores da mutação R255X MeCP2 retêm mitocôndrias

A seguir procuramos determinar se sinais adicionais de autofagia defeituosa poderiam ser observados ex vivo em pacientes RTT. Devido ao fato do clearance de mitocôndrias ser um mecanismo clássico baseado na autofagia que ocorre nos reticulócitos circulantes no estágio final de maturação das hemácias32,33,34 estendemos nossa investigação também às hemácias humanas ex vivo para verificar se as mitocôndrias estão retidas nessas células.

Hence, as hemácias de pacientes RTT (n = 15) e de doadores saudáveis (n = 11) foram analisadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A investigação do TEM destacou a presença de estruturas semelhantes a mitocôndrias (MRE) em hemácias de forma bicôncava isoladas da maioria dos pacientes com RTT (11 em 15). Dentre esses 11 pacientes RTT, três deles apresentaram a coorte de sintomas mais grave e também uma alta freqüência de hemácias (20 ± 4%) (Fig. 3a-h). Como esperado, as MRE eram indetectáveis em hemácias saudáveis (Fig. 3I). As diferenças entre indivíduos saudáveis e RTT foram estatisticamente significativas (p < 0,0004; Fig. 3, painel inferior).

Não obstante, a gravidade dos sintomas foi baseada na avaliação clínica e, conseqüentemente, aqueles três pacientes com os sintomas mais graves suportaram todos a mutação R255X do gene MeCP2 que está associada a um prognóstico grave39.

Como conseqüência e considerando o fato de não termos tido a possibilidade de registrar um número maior de indivíduos com outras mutações com baixa ou nula freqüência de hemácias mitocondriais, concentramos nossa atenção na análise desses três pacientes. A análise TEM documentou, nesses três casos acima mencionados, a presença de estruturas que se assemelhavam a mitocôndrias intactas ou parcialmente digeridas (densas em elétrons ou lucentes), que tinham forma normal ou em forma de haltere (alongada), e geralmente pequenas com cristae tênue (Fig. 3a-h). De fato, o tamanho e a forma geral dessas estruturas foram encontrados como consistentes com os das mitocôndrias retidas em hemácias maduras em modelos murinos não-TTT de macroautofagia defeituosa (ou seja, os ratos Ulk1-/-) ou mitofagia (ou seja, os ratos Nix-/-) relatados por outros autores32,33. Curiosamente, as alterações morfológicas das mitocôndrias observadas, tais como a dimensão reduzida, a estrutura alongada (ou seja, em forma de haltere) e, em particular, a presença de cristae leve já foram descritas no músculo e no cerebelo dos pacientes com RTT20,21. Para confirmar a identidade mitocondrial do MRE, coramos hemácias de doadores saudáveis e destes pacientes RTT com sintomas graves com um anticorpo anti-COX-IV (citocromo c oxidase). Um número estatisticamente significativo de hemácias dos três pacientes com RTT em comparação às hemácias de indivíduos saudáveis(35 ± 5% vs 0,2 ± 0,01%, respectivamente, p < 0,005) mostrou um padrão pontilhado de COX-IV+ que sugeria retenção de mitocôndria (Fig. 4). O conteúdo médio de mitocôndrias por célula foi calculado como sendo 1,2 ± 0,2 organelas por hemácia em pacientes RTT e 0,002 ± 0,0002 em indivíduos saudáveis (p < 0,005) (Fig. 4). As diferenças em percentagem de hemácias com mitocôndrias entre o TEM e a investigação do FI podem ser atribuídas ao facto de a possibilidade de detecção das organelas pelo TEM ser estritamente dependente da secção fina da célula, o que pode dificultar a sua presença, enquanto que a abordagem do FI não é limitada desta forma.

Para confirmar ainda mais esses resultados, realizamos uma análise citofluorimétrica das hemácias tanto de indivíduos saudáveis quanto dos três pacientes RTT, utilizando um anticorpo anti-CD71 (receptor de transferrina) e um anticorpo anti-COX-IV. A freqüência de positividade CD71, um marcador de hemácias imaturas, não foi significativamente diferente em pacientes saudáveis e RTT (1,34 ± 0,13% vs 1,03 ± 0,3%; Fig. S3 Suplementar). Deve-se salientar que os pacientes RTT incluídos no estudo apresentaram parâmetros hematológicos normais e, embora o índice de reticulócitos tenha sido, pelo menos em alguns sujeitos, inferior ao encontrado em sujeitos saudáveis, as diferenças gerais entre os dois grupos de pacientes não foram estatisticamente significativas (Tabela 1). Por outro lado, foi observada uma população muito fraca de COX-IV+ em hemácias saudáveis, enquanto que uma maior freqüência de células COX-IV+ foi detectada nas hemácias RTT (0,056 ± 0,004% vs 1,15 ± 0,19%, respectivamente, p < 0,01). Esses resultados foram ainda confirmados pelo uso da coloração Mitotracker Green (MT) (Fig. Complementar S3), que documentou um aumento de MT+ de hemácias em um paciente RTT (com a mutação R255X MeCP2) versus um paciente saudável (0,37% versus 0,16%), semelhante ao observado com o anticorpo COX-IV descrito anteriormente.

Para validar ainda mais a identidade do MRE, um número igual de hemácias foi lisado e analisado pelo WB sob condições de desnaturalização e redução. Os filtros foram corados com anticorpos contra sirtuina-3, uma des-acetilase especificamente expressa na matriz mitocondrial40. A sirtuina-3 foi escolhida como marcador mitocondrial nesta abordagem porque, diferentemente da COX-IV e outros marcadores mitocondriais, seu peso molecular não se sobrepõe ao das cadeias de hemoglobina ou oligômeros de hemoglobina no padrão eletroforético. Nos três pacientes RTT examinados, foi observado um aumento estatisticamente significativo da razão sirtuina-3/GAPDH para cada paciente em relação à mesma razão em lisados de hemácias saudáveis (p < 0. 001) (Fig. Suplementar S4).

Estes três pacientes, todos portadores da mutação MeCP2 (ou seja, R255X), apresentaram o pior fenótipo, com uma percentagem muito alta de hemácias apresentando pelo menos 1 mitocôndria. Entretanto, o número muito limitado de pacientes à nossa disposição dificultou qualquer conclusão estatisticamente significativa quanto à possibilidade de uma relação entre a gravidade da doença e a extensão da retenção mitocondrial dentro das hemácias maduras. Outro ponto, que parece valer a pena mencionar, é que a retenção de mitocôndrias dentro das hemácias maduras nos modelos Ulk1-/- e Nix-/- murino previamente citados levou a anemia ou outras patologias do sangue provavelmente determinadas pelo aumento da depuração desses eritrócitos anormais por macrófagos do baço32,33. Nos pacientes RTT inscritos neste estudo, apenas uma diminuição muito limitada e não estatisticamente significativa dos valores hematológicos foi registrada, parecendo não serem anêmicos ou sofrerem de outras patologias sangüíneas. A discrepância entre nossos resultados e os dos modelos murinos pode ser devida ao fato de que o knock-down dos genes de macroautofagia ou mitofagia (ou seja, Ulk1-/- e Nix-/- ratos, respectivamente) induz uma porcentagem muito alta de hemácias contendo mitocôndrias e a retenção de várias organelas dentro das hemácias, o que é um defeito consideravelmente mais grave em comparação com o documentado em pacientes com RTT32,33. Embora tenhamos observado um número significativamente alto de hemácias contendo mitocôndrias em pacientes portadores da mutação R255X (Fig. 4), o número de organelas em cada célula foi muito baixo nas hemácias RTT (Fig. 4). Isto pode não ser suficiente para provocar grandes alterações morfológicas e funcionais nas hemácias. Vale ressaltar que, embora a retenção mitocondrial dentro das hemácias possa ser pelo menos um fator determinante do grave desequilíbrio redox observado nas hemácias RTT em associação a uma mudança significativa do estado energético e do metabolismo (i.e, ATP/ADP e relação AADH/NAD), estudos recentes relataram que a cinética dos ligantes de oxigênio à hemoglobina e difusão de oxigênio quase se sobrepõe à dos pacientes saudáveis16,17,23,41.

A aparente discrepância entre nossos resultados e aqueles derivados de modelos murinos pode também encontrar uma explicação no fato de que a síndrome RTT é uma desordem ligada ao X que afeta quase exclusivamente o sexo feminino e a inativação de uma das duas cópias do cromossomo X (XCI) é um fenômeno aleatório que ocorre durante a embriogênese, como amplamente documentado42,43. Assim, no caso da síndrome RTT, seria esperado que o XCI aleatório produzisse, em células somáticas, um mosaicismo com metade das células expressando o alelo do tipo selvagem, sendo que a metade restante expressaria o alelo mutante do gene MeCP2. Curiosamente, a possibilidade de que pelo menos algumas mutações do MeCP2 possam estar associadas a um XCI não aleatório no tecido neuronal está de acordo com a variabilidade fenotípica dos pacientes RTT (e também para os casos familiares de RTT), uma característica que tem sido extensivamente documentada42,43. Teoricamente, se metade dos progenitores hematológicos da medula óssea retêm o cromossomo X com a mutação MeCP2, apenas metade das hemácias maduras circulantes carregariam o alelo patológico, restringindo assim o número de hemácias mitocondriais circulantes. Entretanto, uma prevalência aumentada de ICX não aleatório em favor do alelo do tipo selvagem tem sido observada em leucócitos circulantes em pacientes com RTT esporádicos42,43. Em relação a este ponto, seria muito desafiador abordar se os pacientes que apresentam ou não um baixo número de hemácias mitocôndricas também apresentam um comprometimento menos significativo da mitofagia ou do ICX não aleatório, o que levaria à seleção positiva de progenitores hematológicos portadores do alelo MeCP2 do tipo selvagem.

Hence, dada a complexidade da patologia RTT, preferimos afirmar que os pacientes RTT, juntamente com os pacientes afetados pela Síndrome de Pearson, poderiam representar os primeiros casos de retenção de mitocôndria em hemácias maduras humanas44.

Avidência da autofagia defeituosa no cerebelo de ratos Mecp2-null

Dado que a RTT é um distúrbio de desenvolvimento neurológico, a fim de apoiar ainda mais nossos resultados que apontam para uma autofagia sistêmica defeituosa, realizamos análises imuno-histoquímicas para p62 e ubiquitina do cerebelo (i.e. um órgão no qual foram observadas alterações mitocondriais e outras anomalias histológicas importantes)21,45 de ratos de 9 semanas de idade do tipo selvagem e de 5 semanas de idade (assintomáticos) e de 9 semanas de idade (sintomáticos) Mecp2 -/y. Para cada condição experimental, foi analisado o órgão isolado de três animais. Comparado ao wt, o RTT cerebellum mostrou um aumento na intensidade da coloração p62 (Fig. 5a) e Ub (Fig. 5b) em todas as camadas (ou seja, grânulos, Purkinje e camadas corticais), que foi linear com a idade dos animais. Além disso, as estruturas hiper-manchadas assemelhavam-se aos agregados intracelulares. De acordo com a avaliação semiquantitativa da intensidade da coloração de p62/SQSTM1 e Ub, as diferenças entre o cerebelo dos animais de 5 semanas em relação aos animais saudáveis, e dos animais de 9 semanas em relação aos animais de 5 semanas foram estatisticamente significativas (p < 0.05).