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Coronavírus causaram duas pandemias em larga escala nas últimas duas décadas, SRA e síndrome respiratória do Médio Oriente (MERS)8,9. Tem sido geralmente pensado que a SRA-Sr-CoV – que se encontra principalmente nos morcegos – poderia causar um surto futuro de doença10,11. Aqui relatamos uma série de casos causados por um surto não identificado de pneumonia em Wuhan, província de Hubei, China Central. Este surto de doença – que partiu de um mercado local de frutos do mar – cresceu substancialmente para infectar 2.761 pessoas na China, está associado a 80 mortes e levou à infecção de 33 pessoas em mais 10 países a partir de 26 de Janeiro de 202012. Os sintomas clínicos típicos destes pacientes são febre, tosse seca, dificuldades respiratórias (dispneia), dor de cabeça e pneumonia. O início da doença pode resultar em insuficiência respiratória progressiva devido a lesão alveolar (como observado por imagens computadorizadas transversais do tórax) e até mesmo morte. A doença foi determinada pelos clínicos como sendo causada por pneumonia induzida por vírus, de acordo com sintomas clínicos e outros critérios, incluindo aumento da temperatura corporal, diminuição do número de linfócitos e glóbulos brancos (embora os níveis destes últimos fossem por vezes normais), novos infiltrados pulmonares na radiografia de tórax e nenhuma melhoria óbvia após tratamento com antibióticos durante três dias. Parece que a maioria dos primeiros casos teve história de contato com o mercado original de frutos do mar; entretanto, a doença evoluiu para ser transmitida por contato humano a humano.

Amostras de sete pacientes com pneumonia grave (seis dos quais são vendedores ou entregadores do mercado de frutos do mar), que foram admitidos na unidade de terapia intensiva do Hospital Wuhan Jin Yin-Tan no início do surto, foram enviados ao laboratório do Instituto de Virologia de Wuhan (WIV) para o diagnóstico do patógeno causador (Tabela de Dados Estendidos 1). Como laboratório que investiga o CoV, utilizámos pela primeira vez primers pan-CoV PCR para testar estas amostras13, dado que o surto ocorreu no Inverno e num mercado – o mesmo ambiente que as infecções da SRA. Encontrámos cinco amostras positivas para a PCR para CoV. Uma amostra (WIV04), colhida do fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), foi analisada por análise metagenómica usando sequenciação de próxima geração para identificar potenciais agentes etiológicos. Das 10.038.758 leituras totais – das quais 1.582 leituras totais foram retidas após filtragem das leituras do genoma humano – 1.378 (87,1%) sequências corresponderam à sequência da SRA-Sr-CoV (Fig. 1a). Por nova montagem e PCR direccionada, obtivemos um genoma CoV de 29.891 pares de bases que partilhavam 79,6% de identidade de sequência para a SRA-CoV BJ01 (GenBank accession number AY278488.2). A alta cobertura do genoma foi obtida através do remapeamento das leituras totais para este genoma (Dados Estendidos Fig. 1). Esta sequência foi submetida ao GISAID (https://www.gisaid.org/) (número de acesso EPI_ISL_402124). Seguindo o nome dado pela Organização Mundial de Saúde (OMS), nós tentamos chamá-lo de novo coronavírus 2019 (2019-nCoV). Mais quatro sequências genómicas completas de 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 e WIV07) (números de acesso GISAID EPI_ISL_402127-402130) que eram mais de 99,9% idênticas entre si foram subsequentemente obtidas de quatro pacientes adicionais usando sequenciação de próxima geração e PCR (Tabela de Dados Estendidos 2).

O genoma do vírus consiste em seis grandes quadros de leitura aberta (ORFs) que são comuns aos coronavírus e vários outros genes acessórios (Fig. 1b). Análises posteriores indicam que alguns dos genes de 2019-nCoV partilharam menos de 80% da identidade da sequência nucleotídica do SRA-CoV. No entanto, as sequências de aminoácidos dos sete domínios de replicase conservados no ORF1ab que foram usados para a classificação das espécies do CoV foram 94,4% idênticos entre 2019-nCoV e SRA-CoV, sugerindo que os dois vírus pertencem à mesma espécie, SRA-Sr-CoV.

Verificámos então que uma pequena região de RNA polimerase dependente do RNA (RdRp) de um morcego coronavírus (BatCoV RaTG13) – que foi previamente detectado em Rhinolophus affinis da província de Yunnan – mostrou uma identidade de sequência elevada para 2019-nCoV. Realizamos a sequência completa desta amostra de RNA (número de acesso GISAID EPI_ISL_402131). A análise simplot mostrou que 2019-nCoV foi altamente similar em todo o genoma ao RaTG13 (Fig. 1c), com uma identidade de sequência geral do genoma de 96,2%. Usando as sequências genómicas alinhadas de 2019-nCoV, RaTG13, SRA-CoV e Bat SRA-Sr-CoV previamente reportadas, nenhuma evidência para eventos de recombinação foi detectada no genoma de 2019-nCoV. A análise filogenética do genoma de comprimento total e das sequências genéticas de RdRp e spike (S) mostrou que para todas as sequências-RaTG13 é o parente mais próximo de 2019-nCoV e formam uma linhagem distinta de outros SRA-Sr-CoV (Fig. 1d e Dados Estendidos Fig. 2). A proteína do pico de ligação dos receptores codificada pelo gene S era altamente divergente de outros CoV (Dados Estendidos Fig. 2), com menos de 75% de identidade de sequência nucleotídica para todos os SRASr-CoV anteriormente descritos, excepto para um 93,1% de identidade nucleotídica para RaTG13 (Dados Estendidos Tabela 3). Os genes S de 2019-nCoV e RaTG13 são mais longos que outros SRASr-CoVs. As principais diferenças na sequência do gene S de 2019-nCoV são as três inserções curtas no domínio N-terminal, bem como as alterações em quatro dos cinco resíduos chave no motivo de ligação dos receptores, em comparação com a sequência do SRA-CoV (Dados Estendidos Fig. 3). Se as inserções no domínio N-terminal da proteína S de 2019-nCoV da actividade de ligação de ácido siálico como acontece no MERS-CoV precisam de ser mais estudadas. A estreita relação filogenética com RaTG13 fornece evidências de que 2019-nCoV pode ter tido origem em morcegos.

Desenvolvemos rapidamente um método de detecção baseado em qPCR com base na sequência do domínio receptor-ligante do gene S, que era a região mais variável do genoma (Fig. 1c). Os nossos dados mostram que os iniciadores podem diferenciar 2019-nCoV de todos os outros vírus corona humanos incluindo o morcego SRA-Sr-CoV WIV1, que partilha 95% da identidade com o SRA-CoV (Dados Estendidos Fig. 4a, b). Das amostras obtidas dos sete doentes, verificou-se que seis amostras de BALF e cinco amostras de esfregaço oral foram positivas para 2019-nCoV durante a primeira amostragem, conforme avaliado pelo QPCR e PCR convencional. No entanto, não conseguimos mais detectar amostras de vírus positivos em esfregaços orais, esfregaços anais e amostras de sangue obtidas desses pacientes durante a segunda amostragem (Fig. 2a). Entretanto, recomendamos que outros alvos qPCR, incluindo os genes RdRp ou envelope (E) sejam usados para a detecção rotineira de 2019-nCoV. Com base nesses achados, propomos que a doença poderia ser transmitida por via aérea, embora não possamos descartar outras possíveis vias de transmissão, pois é necessária uma investigação mais aprofundada, incluindo mais pacientes.

Para a detecção serológica de 2019-nCoV, utilizámos uma proteína nucleocapsid (N) previamente desenvolvida da proteína N do morcego SARSr-CoV Rp3 como antigénio para os ensaios immunosorbent ligados à enzima IgG e IgM (ELISAs), uma vez que esta proteína partilhava uma identidade de 92% de aminoácidos para a proteína N de 2019-nCoV (Dados Estendidos Fig. 5) e não mostrou reactividade cruzada contra outros vírus corona humanos excepto o SRA-Sr-CoV7. Apenas conseguimos obter cinco amostras de soro dos sete doentes com infecções virais. Monitorizámos os níveis de anticorpos virais num doente (ICU-06) 7, 8, 9 e 18 dias após o início da doença (Dados alargados Tabela 2). Uma tendência clara foi observada nos títulos de IgG e IgM, que aumentaram com o tempo, exceto que o título de IgM foi diminuído na última amostra (Fig. 2b). Como segunda análise, testamos a presença de anticorpos virais em 5 dos 7 pacientes com vírus positivos cerca de 20 dias após o início da doença (Tabela de Dados Estendida 1, 2). Todas as amostras de doentes – mas não amostras de indivíduos saudáveis – foram fortemente positivas para IgG viral (Fig. 2b). Também houve três amostras IgM-positivas, indicando uma infecção aguda.

A seguir isolamos com sucesso o vírus (chamado 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) de células Vero E6 e Huh7 usando a amostra BALF da UCI-06 do paciente. Efeitos citopatogênicos claros foram observados nas células após a incubação por três dias (Dados Estendidos Fig. 6a, b). A identidade da linhagem WIV04 foi verificada nas células Vero E6 por microscopia de imunofluorescência usando o anticorpo viral N reativo cruzado (Dados Estendidos Fig. 6c, d) e por seqüenciamento metagenômico, a maioria das leituras mapeadas para 2019-nCoV, e a análise qPCR mostrou que a carga viral aumentou do primeiro dia para o terceiro dia (Dados Estendidos Fig. 6e, f). Partículas virais em seções ultrathin de células infectadas apresentaram uma morfologia típica de coronavírus, visualizada por microscopia eletrônica (Dados Estendidos Fig. 6g). Para confirmar a actividade de neutralização das amostras víricas IgG-positivas, realizámos ensaios de neutralização sérica em células Vero E6 utilizando os cinco soros de pacientes que eram IgG-positivos. Demonstramos que todas as amostras foram capazes de neutralizar 100 TCID50 (50% de dose infecciosa de cultura de tecidos) de 2019-nCoV a uma diluição de 1:40-1:80. Mostramos também que este vírus pode ser neutralizado cruzadamente com soro anti-SARS-CoV (presente de L.-F. Wang) em diluições de 1:40; contudo, o potencial de reactividade cruzada com anticorpos SRA-CoV precisa de ser confirmado com soro anti-SARS-CoV de humanos (Dados Estendidos Tabela 4).

ACE2 é conhecido por ser um receptor celular para o SRA-CoV14. Para determinar se 2019-nCoV também usa ACE2 como receptor de entrada celular, nós conduzimos estudos de infecciosidade de vírus usando células HeLa que expressavam ou não as proteínas ACE2 de humanos, morcegos em ferradura chineses, civets, porcos e ratos. Mostramos que 2019-nCoV é capaz de usar todas as proteínas ACE2, exceto o ACE2 do rato, como receptor de entrada para entrar nas células que exprimem ACE2, mas não as células que não exprimiram ACE2, indicando que o ACE2 é provavelmente o receptor celular através do qual 2019-nCoV entra nas células (Fig. 3). Mostramos também que 2019-nCoV não utiliza outros receptores coronavírus, como a aminopeptidase N (APN) e a peptidase dipeptidase 4 (DPP4) (Dados ampliados Fig. 7).

O estudo fornece um relatório detalhado sobre 2019-nCoV, o provável agente etiológico responsável pela epidemia de síndrome respiratória aguda em curso na China e em outros países. A soroconversão nucleotide-positiva e viral-proteína específica do vírus foi observada em todos os pacientes testados e fornece evidência de associação entre a doença e a presença deste vírus. No entanto, ainda há muitas questões urgentes a serem respondidas. A associação entre 2019-nCoV e a doença não foi verificada por experiências em animais para cumprir os postulados de Koch de estabelecer uma relação causal entre um microorganismo e uma doença. Ainda não conhecemos a rotina de transmissão deste vírus entre os hospedeiros. Parece que o vírus está se tornando mais transmissível entre humanos. Devemos monitorar de perto se o vírus continua a evoluir para se tornar mais virulento. Devido à escassez de tratamentos específicos e considerando a relação entre 2019-nCoV e o SRA-CoV, alguns medicamentos e vacinas pré-clínicas contra o SRA-CoV poderiam provavelmente ser usados para tratar este vírus. Finalmente, considerando a ampla disseminação do SRA-CoV nos seus reservatórios naturais, a investigação futura deve ser focada na vigilância activa destes vírus para regiões geográficas mais vastas. A longo prazo, medicamentos e vacinas antivirais de largo espectro devem ser preparados para doenças infecciosas emergentes que são causadas por este grupo de vírus no futuro. Mais importante ainda, regulamentações rigorosas contra a domesticação e o consumo de animais selvagens devem ser implementadas.

Nota adicionada à prova: Desde que este artigo foi aceite, o ICTV designou o vírus como SRA-CoV-215; além disso, a OMS divulgou o nome oficial da doença causada por este vírus, que é COVID-1916.