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Abstract

Artrose Reumatóide (AR) é uma doença auto-imune. O veneno da vespa (WV), que é considerado como uma medicina popular tradicional em Jingpo na nacionalidade de Yunnan, China, alivia a artrite reumatóide. O presente estudo teve como objectivo investigar o efeito do veneno da vespa na melhora dos sintomas da artrite reumatóide em ratos experimentais. Estabelecemos um modelo de artrite induzida por colágeno tipo II (CII-) em ratos com SD e examinamos a inibição da inflamação e da resposta auto-imune. Os efeitos antiartríticos do WV foram avaliados através do inchaço da pata, e o escore histopatológico e as alterações histopatológicas da pata afetada foram avaliados. Os efeitos anti-inflamatórios foram avaliados pelo nível de IL-6, TNF-α, IL-1β e pelo número de células inflamatórias no sangue periférico. A alteração da proporção de células T no baço de ratos foi detectada pela citometria de fluxo e, ao mesmo tempo, foram avaliados o índice de vísceras e os níveis de globulina sérica imunológica. Os resultados sugeriram que várias doses de WV (0,125, 0,25 e 0,5 mg/kg) aliviaram significativamente o inchaço das patas e o escore de artrite em ratos CIA com o controle não tratado (). O WV (0,25 e 0,5 mg/kg) aliviou lesões do tecido sinovial das articulações do tornozelo e escores histopatológicos de hiperplasia de sinoviócitos e infiltração de células inflamatórias com o grupo veículo (). Em relação à regulação imunológica, 0,5 mg/kg de WV diminuiu os níveis de globulina sérica imunológica (), e descobrimos ainda que o WV (0,5 mg/kg) suprimiu a resposta imunológica das células Th, ao mesmo tempo em que melhorou as funções das células Tc e Treg nas células do baço marcadamente (). A ação imunossupressora do WV exibido foi análoga ao seu efeito inibidor sobre os níveis de IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 e PGE2 no soro de rato. Em conclusão, esses achados demonstraram que o WV exibiu atividade antiartrítica, que pode estar associada aos seus efeitos inibidores sobre a imunoregulação e ação antiinflamatória.

1. Introdução

A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune crônica que pode progredir para complicações sistêmicas, incapacidades físicas e até mesmo morte precoce . Hiperplasia das células sinoviais, inflamação crônica da sinóvia e destruição da cartilagem e do osso são as principais características da AR. Além disso, os efeitos sinérgicos das células T, células B e citocinas pró-inflamatórias também desempenham papéis-chave no processo fisiopatológico. Quando as células T CD4+ são ativadas, elas produzem citocinas pró-inflamatórias que aumentam a resposta imunológica ao estimular outras células mononucleares, fibroblastos sinoviais, condrócitos e osteoclastos. A liberação dessas citocinas pró-inflamatórias, especialmente TNF-α, IL-6 e IL-1β, pode contribuir para a sinovite .

Correntemente, os medicamentos de tratamento clínico usados para tratar AR concentram-se principalmente na redução de mediadores inflamatórios, como antiinflamatórios não esteróides (AINEs), antirreumáticos modificadores de doenças (DMARDs) e agentes biológicos. Por exemplo, o metotrexato de folato análogo (MTX), como um AINE, foi aprovado pela FDA para AR em 1988. Além disso, tornou-se o mais utilizado no tratamento da AR, devido à sua actividade imunossupressora, efeito anti-inflamatório e baixo custo. Entretanto, o MTX não é um agente terapêutico ideal por seus efeitos colaterais indesejados sobre o sistema neuronal, gastrointestinal e imunológico, assim como outros medicamentos. É por isso que um número crescente de pessoas está procurando novas alternativas para lidar com a ineficiência e segurança desses medicamentos. Na teoria da medicina tradicional chinesa (MTC), a AR é considerada uma síndrome de artralgia (“Bi Zheng” na MTC), possivelmente causada por vento exógeno, umidade e patógenos de calor ou frio. A aplicação da MTC na prevenção e tratamento de doenças tem uma história de vários séculos, aumentando a importância no tratamento da AR atribuída à sua notável eficácia, mas menos efeitos colaterais e custos.

A terapia do veneno, como uma abordagem de medicina complementar e alternativa, tem sido usada há vários séculos para tratar a dor, inflamação e artrite na medicina popular. Já no Período dos Estados em Guerra, o Cânone Interno do Imperador Amarelo (“Huangdi Neijing” em chinês) tem um registro de “picada de abelha é terapêutica apesar do risco tóxico incorrido”. De acordo com pesquisas médicas modernas, o veneno da abelha (BV) exibe efeitos antiartríticos, anti-inflamatórios e analgésicos atribuíveis à ativação do inibitório central e modulação do sistema imunológico através de múltiplos mecanismos . Vários ensaios clínicos também mostraram que o VB poderia melhorar os sintomas relacionados à artrite .

O veneno da abelha contém uma variedade de constituintes biologicamente ativos, incluindo aminas biogênicas, substâncias de alta massa molecular (como enzimas, alergênios e peptídeos bioativos), e toxinas poliamínicas. O veneno da vespa mostrou vários efeitos farmacológicos no tratamento da dor, doença inflamatória e doenças neurodegenerativas. Vespa magnifica (Smith) é uma espécie de vespa social, encontrada em Yunnan, China. Nos últimos anos, muitos compostos com anticoagulação, antiplaquetários, anti-inflamatórios e imunossupressores foram separados de seu veneno. Com base no seu notável efeito na artrite reumatóide, tornou-se um hábito a ser amplamente utilizado em Jingpo, uma minoria nacional chinesa. No entanto, tanto quanto sabemos, houve poucos relatos sobre as ações antirheumatismais do veneno da vespa.

No trabalho atual, o modelo da artrite induzida pelo colágeno (CIA) foi adotado para replicar de perto a patogênese da AR. Mudanças no volume da pata têm sido classicamente usadas para avaliar os efeitos anti-inflamatórios na AR, como de costume. Além disso, avaliamos o efeito do WV (veneno de vespa da Vespa magnifica) no mesmo modelo. Finalmente, a efetividade do VW no anti-inflamatório e imunomodulação foi observada pela coloração H&E do tecido articular, citometria de fluxo de subconjuntos de células T no baço, assim como ELISA do soro IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 e fatores reumatóides (IgG, IgA e IgM).

2. Materiais e Métodos

2.1. Animais Experimentais

Ratos machos SD (60 ratos, 180-220 g) foram obtidos de Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. Os animais foram alojados em gaiolas padrão de polipropileno revestidas com casca crua (renovadas após 48 h). O alojamento dos animais foi mantido em um ciclo de 12 h de luz/escuro a aproximadamente 22 ± 2°C e umidade relativa de 60-70%, e os animais tiveram livre acesso à água e à vaca padrão. Os ratos foram aleatoriamente atribuídos a 8 controles e 52 modelos, e então um período mínimo de 7 d foi permitido para adaptação em cada experimento. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health) e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Dali.

2,2. Modelo Animal da CIA e Protocolo de Tratamento

Ratos foram desinfetados com álcool e injetados subcutaneamente no pedis voláteis direito, dorso e cauda com 1 mg/ml de emulsificante CCII (Colágeno tipo II de Frango) para a primeira imunização, que é composto de CCII (C9301, Sigma) emulsionado 1 : 1 com adjuvante incompleto de Freund (F5506, Sigma). O dia da indução foi concebido como dia 0. A dose de reforço foi injetada novamente no abdômen, costas e cauda juntamente com 1 ml de emulsificante CCII no dia 8. O pé injetado foi definido como o pé inflamatório, enquanto que o outro pé sem injeção foi anotado como o pé secundário. Em seguida, os ratos com artrite induzida por colágeno (CIA) foram tratados no 14º dia e terminaram no 28º dia. Após o início da CIA, os ratos modelo foram divididos aleatoriamente em cinco grupos, de acordo com os escores clínicos. Grupo I: grupo modelo que recebeu uma injeção hipodérmica (1 ml/kg) de soro fisiológico normal como veículo. Grupos II-IV: ratos CIA receberam uma injeção hipodérmica de 0,125, 0,25 e 0,5 mg/kg WV (veneno de vespa, de Vespa magnifica (Smith) em Yunnan, China, pó liofilizado feito de exsudato de glândulas caudas de vespas, diluído com soro fisiológico normal), respectivamente, como os grupos de tratamento. Grupo V: grupo de controle positivo recebeu TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, No. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) de 9 mg/kg da mesma forma. Simultaneamente, o mesmo volume de soro fisiológico normal foi dado apenas aos ratos normais do grupo de controle. Os ratos acima de tudo tiveram uma administração diária durante 14 dias.

2,3. Avaliação Básica da Artrite Experimental

A gravidade da CIA foi avaliada periodicamente com base no inchaço das patas e nos escores de artrite. Os ratos foram pesados nos dias 0-28 do estudo, e a espessura e o perímetro dos tornozelos do pé inflamatório (pé direito) e do pé secundário (pé esquerdo) foram medidos separadamente pelo calibrador de Vernier e fita adesiva nos dias 0, 14 e 28. A pontuação da artrite foi avaliada com base em observações independentes de três estudiosos. Cada pata foi pontuada em uma escala de 0-4, o que significa que a pontuação máxima total para ambas as articulações da pata traseira foi 8. Os critérios de avaliação foram os seguintes: 0 = sem edema ou qualquer alteração visual; 1 = edema leve e eritema limitado; 2 = edema leve e eritema; 3 = edema óbvio e eritema significativo; e 4 = edema grave e eritema extenso. No dia 28, os animais foram sacrificados e, em seguida, o soro e as articulações secundárias do tornozelo foram coletados e processados para análise posterior.

2,4. Histopatologia das articulações do tornozelo

Os membros posteriores esquerdos sem o abate dos tecidos vizinhos foram imediatamente lavados com PBS por 2-3 vezes, fixados com formalina a 10% por 48 h, e descalcificados com ácido nítrico a 5% por 24 h até que a cortical óssea fosse facilmente atravessada com uma ponta de agulha. As amostras foram embutidas em cortes de parafina e cortadas em fatias (5 μm) para coloração rotineira de hematoxilina-eosina (H&E). Alterações patológicas das articulações foram detectadas com um microscópio de luz (Olympus, Japão) e fotografadas. As fotos foram tiradas com ampliações de 200x. Também foram detectadas alterações na hiperplasia de sinoviócitos e infiltração de células inflamatórias. As alterações histopatológicas foram pontuadas, respectivamente, usando os seguintes critérios: 0 = nenhuma alteração detectável; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = grave .

2,5. Análise do Índice de Viscera

Ratos foram sacrificados e fígado completo, baço e timo foram ressecados com tecido adiposo circundante e fáscia cuidadosamente separados. A massa úmida do fígado, baço e timo foi medida pelo balanço eletrônico e o índice de vísceras (incluindo índice hepático, índice do baço e índice do timo) foi calculado de acordo com a seguinte fórmula. Índice de vísceras = massa do órgão (mg)/ massa corporal (g) × 100%.

2.6. ELISAs de índices bioquímicos séricos

O soro de ratos experimentais foi coletado, e as concentrações de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2, e PGE2 foram detectadas por kits de imunoensaio enzimático (ELISA) (Nanjing JianCheng, China) seguindo as instruções do fabricante. Os kits ELISA para detectar os níveis de expressão de IgA (ERC015), IgG (ERC016), e IgM (ERC017) foram adquiridos da NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, China.

2.7. Citometria de fluxo do baço da artrite

O número de subconjuntos de células T foi detectado usando citometria de fluxo. Linfócitos foram colhidos de células do baço de rato, as quais foram homogeneizadas passando por peneira de nylon de 200 mesh. As células foram filtradas em tampão PBS contendo 10% de soro fetal bovino. A concentração de células foi ajustada para cerca de 2 × 106/ml, e 3 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos (Solarbio, China) foram adicionados para dissolver os glóbulos vermelhos por menos de 5 minutos. Em seguida, as células foram centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos, lavadas duas vezes com tampão FBS-PBS que continha 10% de soro fetal bovino, e depois centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos. Cada 100 μL suspensão de células foi colocada em tubos de centrifugação. Os linfócitos foram seguidos por coloração com anti-CD3-FITC (No. 557354; BD, EUA), anti-CD4-APC (No. 565432; BD, EUA), anti-CD8-PerCP (No. 558824; BD, EUA), e anti-CD25-PE (No. 554866; BD, EUA). Os anticorpos monoclonais foram adicionados a cada tubo, remixados e deixados em gelo por 30 minutos. O tampão FBS-PBS (1 ml) foi adicionado a cada tubo de amostra e centrifugado a 1200 rpm por 5 minutos, e o sobrenadante foi abandonado. O passo anterior foi repetido duas vezes para que as células sem ligação a anticorpos monoclonais fossem eluídas completamente. As células experimentais foram misturadas com 500 μL Tampão FBS-PBS. As razões das células CD25+/CD4+ e CD4+/CD8+ T foram determinadas usando um FACS Canto Flow-cytometer (BD, EUA) .

2.8. Análises estatísticas

Os dados foram analisados estatisticamente usando o SPSS10.0. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão da média (S.D.M). A significância das diferenças entre cada grupo foi analisada através da ANOVA unidirecional seguida de um teste de Tukey. Em particular, o escore de artrite e o escore histopatológico foram analisados pelo teste de Wilcoxon rank sum. Valores de foram considerados estatisticamente significantes.

3. Resultados

3,1. WV Aliviou o Sintoma de Artrite em Ratos CIA

Os sintomas artríticos foram induzidos com sucesso em ratos por injeção de colágeno tipo II, conforme instruído, o qual encarnou em sinais macroscópicos significativos de vermelhidão grave e inchaço na pata secundária e articulação do tornozelo de ratos CIA na Figura1(a), se comparado com o grupo controle saudável. A espessura e perímetro da articulação do tornozelo foram aparentemente aumentados nos veículos no 14º dia (Figura 1(b)) em comparação com os do grupo controle; no entanto, eles foram surpreendentemente diminuídos após o TwHF e todos os grupos tratados com WV no 28º dia em comparação com os do grupo modelo (todos ) (Figura 1(b)). Quando medimos a espessura e o perímetro das articulações do tornozelo, tanto no pé inflamatório quanto no pé secundário, a óbvia subsidência do inchaço foi mostrada com base nos dados (Figura 1(b)). Os resultados do grau de inchaço indicaram que o WV poderia controlar o edema das patas e aliviar a inflamação secundária na pata e articulação do tornozelo correspondente ao efeito TwHF.

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Outras vezes, a pontuação de artrite foi diminuída com diferentes graus através do tratamento do WV, dependendo da quantidade de dose, como mostrado na Figura 1(c). O escore de artrite do grupo de veículos foi de 6,5 ± 1,0 no dia 14 (vs dia 0, ). O índice foi significativamente reduzido no grupo tratado com TwHF no dia 28, mostrando 2,8 ± 0,8 (vs dia 14, ). Da mesma forma, a diminuição dos índices por WV foi significativa e dependente da dose (3,2 ± 0,6 a 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 a 0,25 mg/kg, e 5,6 ± 0,7 a 0,125 mg/kg) (vários vs 14 dias, ). Isto indicou que a potência de WV a 0,5 mg/kg era proporcional à do grupo tratado com TwHF.

3,2. WV aliviou as alterações patológicas das articulações em ratos CIA

H&E (Figura 2(a)) mostrou que a membrana sinovial das articulações do tornozelo dos ratos controle tinha um arranjo celular regular, sem qualquer hiperplasia sinoviocitária, infiltração celular inflamatória e superfície lisa da cartilagem. Em comparação, a arquitetura histológica das articulações dos ratos do grupo veículo era marcadamente anormal com infiltração de células imunológicas, hiperplasia de sinoviócitos, aumento do número de vasos e erosão da cartilagem e do osso. As articulações dos grupos TwHF e WV foram significativamente atenuadas em relação às do grupo veículo e passaram para as do grupo controle. Os escores histopatológicos (Figura 2(b)) indicaram (grupo veículo) a célula de revestimento sinovial anormal e infiltração de célula inflamatória nas articulações artríticas; os tratamentos com TwHF e WV diminuíram significativamente o escore histopatológico médio e restauraram a cartilagem em relação ao grupo veículo ().

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Figura 2

Efeitos do WV na progressão da artrite e histologia articular em ratos da CIA. (a) Histopatologia de cortes de tecido articular de ratos CIA tratados com diferentes doses de WV e TwHF e ratos normais por coloração H&E. Ampliação original ×200. a, destruição óssea; b, infiltração de células imunes; c, sinovium hipertrófico. (b) Escores histopatológicos de hiperplasia de sinoviócitos e infiltração de células inflamatórias em todos os grupos. (b) Escores histopatológicos de hiperplasia de sinoviócitos e infiltração de células inflamatórias em todos os grupos. Efeitos do WV no Índice de Viscera e Níveis de Globulina Imune em Ratos CIA

Comparado com o grupo controle, o índice hepático do grupo veículo diminuiu significativamente () e o WV (0,25 e 0,5 mg/kg) aumentou acentuadamente (). Em comparação com o grupo controle, o índice do baço e o índice do timo do grupo veículo aumentaram marcadamente (); TwHF e WV tiveram um efeito inibitório sobre eles que se refletiu particularmente no efeito da dose de 0,5 mg/kg de WV no índice do timo (Figura 3(a)).

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Figura 3

Efeitos do WV no índice de vísceras e nos níveis de imunoglobulina sérica em ratos da CIA. (a) Alterações no baço, timo e índice hepático em todos os grupos. (b) A expressão IgG, IgA, e níveis de IgM no soro de todos os grupos. (a) A expressão IgG, IgA, e IgM no soro de todos os grupos. (b) A expressão IgG, IgA, e IgM no soro de todos os grupos. (c) A expressão IgG, IgA, e IgM no soro de todos os grupos. E os níveis de IgG sérico foram diminuídos no grupo WV (0,5 mg/kg) em comparação com o grupo veículo (). Esta inibição também foi aplicada a IgA e IgM nos grupos WV (0,25 e 0,5 mg/kg) (Figura 3(b)).

3,4. Efeitos do WV nos subconjuntos de células T no baço de ratos CIA

O número de células CD4+ T aumentou significativamente nos grupos veículos em comparação com o grupo controle (), enquanto aqueles nos grupos TwHF e WV (0,5 mg/kg) foram significativamente menores do que o grupo veículo (Figura 4(a)). Em comparação com o grupo controle, o número de células T CD4+CD25+ no grupo veículo diminuiu significativamente (), enquanto que nos grupos TwHF e WV (0,5 mg/kg) o número de células T CD4+CD25+ no grupo veículo aumentou significativamente (), mas não foi óbvio nos outros grupos (Figura 4(a)). Em comparação com o grupo controle, a redução no grupo veículo do número de células T CD8+ foi notável, mas apenas o WV (0,125 e 0,25 mg/kg) fez os números subirem (, ) na Figura 4(b).

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Figura 4

O número de subconjuntos de células T em células do baço por citometria de fluxo. (a) Os resultados de FCM no número de células Th e células Tc (esquerda); os resultados de FCM no número de células Treg (direita). (b) O gráfico de barras indicou o efeito negativo de WV e TwHF sobre células Th e o efeito positivo sobre células Tc e células Treg. (b) O gráfico de barras indicou o efeito negativo das células WV e TwHF sobre Th e o efeito positivo sobre as células Tc e Treg. WV Citoquinas e Mediadores Séricos Regulados em Ratos CIA

kitsELISA (Figura 5) mostraram que, em comparação com o grupo controle, os níveis séricos de IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 e IL-8 foram significativamente aumentados no grupo veículo e foram significativamente restaurados por TwHF (9 mg/kg) e WV (0,5 mg/kg) (). Enquanto isso, as expressões de IL-6 e PGE2 foram suprimidas por 0,125 e 0,25 mg/kg de dosagem de WV (). WV (0,125 e 0,25 mg/kg) reduziram de forma semelhante a expressão de COX-2 e IL-8 em relação ao veículo (, ). Isto indicou que a inflamação induzida pelo CCII provavelmente mediou as alterações patológicas observadas nos ratos artríticos, e que o WV poderia aliviar a resposta inflamatória.

Figura 5

Efeitos do VH nos níveis de IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2, e COX-2 no soro de rato da CIA. A doença auto-imune crônica caracterizada por dor, inchaço e destruição gradual das articulações, resultando em perda da função. cEmbora os comprimidos de metotrexato (MTX) sejam considerados um medicamento de tratamento para a artrite reumatóide, geralmente estão associados a reações adversas aos medicamentos (RAMs). Assim, procuramos avaliar se o veneno da vespa (WV) poderia representar uma potencial droga alternativa para a AR.

O presente estudo foi o primeiro, que se sabe, a investigar o papel terapêutico do WV (da Vespa magnifica) na artrite induzida por colágeno (CIA) induzida em ratos para SD e comparado com o efeito clinicamente comprovado da TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), também conhecido como Lei Gong Teng em MTC, tem sido utilizado para tratar a AR há muitos anos na China, e os extractos de TwHF têm demonstrado actividades anti-inflamatórias e imunossupressoras tanto in vivo como estudos in vitro . Nós estabelecemos o modelo de ratos CIA por 14 dias e removemos 12 incompetência aparente que poderia ter sido devido a falha de injeção de 52 ratos, ou seja, os ratos CIA tinham uma taxa de artrite de 77%. O grupo controle não apresentou sinais de edema ou inflamação (Figuras 1 e 5), e nossos achados estão de acordo com estudos anteriores de AR e CIA, que relataram que o emulsificante CCII induziu a gravidade do edema e danos inflamatórios nas articulações. Em seguida, a melhora dos sintomas no grupo WV (0,5 mg/kg) foi semelhante aos da droga positiva TwHF, que tem sido relatada para inibir a resposta inflamatória da AR, mas o efeito da baixa dose não foi significativo na redução do inchaço e inibição da IL-1β e TNF-α (Figuras 1 e 5). Além disso, notamos que os ratos do grupo veículo tinham pêlo mais áspero e estado mental mais pobre do que os do grupo controle; estas condições tinham se tornado ainda melhores no grupo de tratamento.

Para avaliar melhor a eficácia terapêutica do VH, H&E foi realizada a coloração em amostras de tecido das articulações traseiras esquerdas do tornozelo para analisar a característica patológica, e constatamos que as células sinoviais causam inflamação, proliferação e invasão de cartilagem e osso localizados no grupo veículo (Figura 2), e essas alterações macroscópicas são consistentes com relatos anteriores . Além disso, o tratamento com TwHF e WV durante 14 dias reduziu significativamente a hiperplasia de células sinoviais e a infiltração de células inflamatórias em comparação com as não tratadas (Figura 2). A sinovite crônica é a base patológica da AR . A inflamação sinovial é impulsionada por uma complexa interação entre sinoviócitos e células infiltrantes do sistema imunológico inato e adaptativo. Portanto, o índice visceral dos órgãos imunitários como o baço e o timo foi calculado nesta experiência. Vale ressaltar que não encontramos a diferença significativa de peso entre o veículo e o grupo de tratamento; assim, utilizamos o índice representativo de vísceras para refletir a saúde geral dos ratos. Verificamos que TwHF e WV poderiam diminuir o aumento do índice visceral do baço e timo em ratos da CIA (Figura 3(a)); isto poderia refletir o seu papel no alívio do realce imunológico causado pela AR. Também notamos a mudança no índice hepático durante este processo; nossos resultados mostraram que o TwHF não reanimou o índice hepático embora seu tratamento fosse eficaz, o que nos lembrou de sua toxicidade para o fígado no relatório anterior. Felizmente, isto não foi encontrado no grupo WV (Figura 3(a)). Com exceção da diminuição do índice hepático no veículo e no grupo TwHF, não foram observados efeitos colaterais nesses ratos, o que poderia se dever à baixa dosagem que utilizamos. Além disso, também detectamos fatores reumatóides (RFs), como marcador diagnóstico para AR, principalmente incluindo isotipos IgG, IgA e IgM; tem uma alta taxa de detecção em pacientes com AR . Este estudo descobriu que ratos CIA não tratados tinham níveis significativamente mais elevados de anticorpos IgG, IgA e IgM no soro do que os dos grupos TwHF e WV (Figura 3(b)); estes resultados concordaram bem com os dados clínicos tal como relatados. Assim, pôde-se observar que TwHF e WV (0,5 mg/kg) poderiam diminuir a resposta auto-imune excessiva de ratos CIA para um nível próximo do normal. Em contraste, o efeito do WV (0,125 e 0,25 mg/kg) não foi óbvio, enquanto que resta saber se uma dose mais elevada irá melhorar o efeito em vez de agir como veneno, por isso ainda nos concentramos nestas três doses para explorar o efeito do WV sobre a AR nesta experiência.

Pesquisas anteriores mostraram que a inflamação sinovial recruta e ativa as células imunes através da produção de mediadores, e as células T desempenham papéis vitais na regulação da AR . Quanto aos papéis das citocinas pró-inflamatórias na auto-imunidade, é essencial considerar o equilíbrio entre os diferentes subconjuntos de células T, principalmente divididos em dois hipotipos de acordo com sua função e fenótipos: célula T (Th) helper CD4+ e célula T (Tc) citotóxica CD8+. As células T e as células Tc, caracterizadas pela produção de várias citocinas específicas, facilitam a resposta imune adaptativa. Em contraste, as células CD4+CD25+ T (Treg) têm uma função essencial na manutenção da tolerância imunológica, controlando as respostas inflamatórias e suprimindo a atividade das células imunes acima mencionadas . Neste estudo, encontramos uma grande concentração de células Th e Tc em células esplênicas e também notamos uma diminuição da função das células Treg em ratos CIA. Felizmente, o equilíbrio entre os subconjuntos de células T foi protegido com o tratamento TwHF e WV (Figura 4). É de notar que o acúmulo de células imunes é o promotor da inflamação das articulações locais, e as células imunes ativadas liberam uma grande quantidade de citocinas pró-inflamatórias, que então induzem a ativação e proliferação de células sinoviais e agravam ainda mais a progressão da inflamação das articulações. Estudos anteriores mostraram que a IL-6 é a citocina mais dominante na patogênese da AR, e quantidades excessivas de IL-1β, bem como de TNF-α e IL-8, foram encontradas no líquido sinovial dos pacientes com AR. A produção de COX-2 e PGE2 após estimulação com IL-1β também aumentou, e bloqueá-los aliviou significativamente os sintomas da AR. Resultados semelhantes foram observados em nossos resultados experimentais, e confirmamos que TwHF e WV (0,5 mg/kg) poderiam efetivamente reduzir os níveis de IL-6, IL-8, PGE2 e COX-2; também, as concentrações aumentadas de IL-1β e TNF-α induzidas pela AR foram suprimidas, exceto pelo WV (0,125 e 0.25 mg/kg) (Figura 5).

Estes resultados sugerem que o VH tem as funções de aliviar o inchaço articular, inibir a inflamação sinovial, suprimir a resposta imunológica excessiva e proteger a homeostase imunológica, que pode melhorar os sintomas e tornar-se um remédio eficaz para a AR. Foi relatado que o veneno da vespa contém uma série de moléculas bioativas, incluindo aminas, pequenos peptídeos, e até mesmo enzimas, alergênios, e toxinas de alta massa molecular. O que torna o WV diferente do BV é que o BV tem principalmente efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e analgésicos sobre a AR, e contém uma variedade de diferentes peptídeos, incluindo melitina, fosfolipase A2, apamina, e assim por diante. Os mecanismos de tratamento da AR com estes dois venenos podem ser diferentes e merecem um estudo mais aprofundado. Embora não tenham sido observados efeitos colaterais na faixa de 0,125 a 0,5 mg/kg de WV, foi necessária uma avaliação adicional dos ingredientes ativos e da segurança do extrato de WV.

5. Conclusões

Veneno de Wasp aliviou a hiperplasia sinovial e destruição de cartilagem causada pela CIA, possivelmente devido à redução do fator pró-inflamatório e efeito imunorregulador. Este estudo demonstrou que o veneno da vespa pode ter sido uma alternativa terapêutica potencial para a AR. Além de ser uma prescrição popular por muitos anos, a AR merece mais estudo para ser descoberta, explorada e reconhecida.

Dados Disponibilidade

Os dados utilizados para apoiar os achados deste estudo estão incluídos no artigo e podem ser disponibilizados gratuitamente.

Aprovação Ética

O estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Dali.

Conflitos de interesse

Os autores declaram que não há conflitos de interesse quanto à publicação deste trabalho.

Contribuições dos autores

YG escreveu o manuscrito e auxiliou na construção e agrupamento de modelos animais. WXY e HL realizaram H&E coloração e citometria de fluxo. XMD e LLN foram responsáveis pelos kits ELISA. ZBY, HRZ, e HX foram os principais colaboradores na redação do manuscrito. ZBY e CGZ administraram e supervisionaram o projeto. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Acknowledgments

Parte deste trabalho foi apoiada pelo Centro de Inovação Colaborativa da Província Yunnan 2011 para Entomoceutics. 2017FA050), e Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (subsídio nº ZKLX2019101).