Alai

Factorul Von Willebrand, ADAMTS13 și purpura trombotică trombocitopenică

VWF este sintetizat de o genă mare de pe cromozomul 12p13.31 care se întinde pe 178 kb și conține 52 de exoni.49 ARN mesager (ARNm) produs de această genă specifică o polipeptidă de 2813 aminoacizi, care include o peptidă semnal de 22 de aminoacizi, o propeptidă de 742 de aminoacizi și o secvență de 2050 de aminoacizi care alcătuiesc blocul monomeric de construcție al VWF găsit în plasmă. După scindarea peptidei semnal în reticulul endoplasmatic, monomerii care conțin propeptide sunt legați prin disulfură în dimeri prin legături disulfură între lanțuri, care implică reziduuri Cys în apropierea extremității C-terminale a moleculei. Acești dimeri sunt apoi transportați în aparatul Golgi, unde propeptidul catalizează legăturile disulfidice interdimerice între reziduurile din domeniul D3, dând naștere la multimeri lungi compuși din dimeri legați cap la cap care conțin N-terminale la ambele capete. Propeptidul este apoi scindat de o enzimă asemănătoare furinei, iar cea mai mare parte a ULVWF rezultat este împachetat în granule de stocare pentru o secreție reglementată ulterioară.

Se cunosc doar două tipuri de celule care sintetizează VWF: celulele endoteliale și megacariocitele. În celulele endoteliale, VWF este depozitat în granule numite corpuri Weibel-Palade; în trombocite, este depozitat în granule α. Cea mai mare parte a VWF din sânge este de origine endotelială. Mulți stimuli pot induce eliberarea de VWF endotelial, inclusiv epinefrina, desamino-vasopresina (DDAVP), histamina, trombina, toxinele Shiga și citokinele proinflamatorii, inclusiv factorul de necroză tumorală (TNF)-α, interleukina (IL)-8 și IL-6 (în complex cu receptorul IL-6).50 Alți agenți pot, de asemenea, să inducă eliberarea endotelială de VWF, oferind indicii cu privire la unii dintre factorii declanșatori în TTP. Acești agenți includ viruși, cum ar fi adenovirusul51 și oxidanți, cum ar fi superoxidul.52 Oxidanții nu numai că au capacitatea de a induce secreția de FVVF; ei pot, de asemenea, să oxideze VWF, astfel încât să îl facă necolabil de către ADAMTS1353 și mai aderent.54 Mai mult, oxidanții, în special cei produși de neutrofile și monocite în timpul inflamației, pot oxida un reziduu de metionină crucial din domeniul catalitic ADAMTS13 și pot inactiva enzima.55

Atât celulele endoteliale cât și trombocitele eliberează multimeri de VWF care sunt mai mari decât multimerii din plasma normală.56 Acești multimeri ULVWF nu numai că sunt mult mai mari decât cei care se găsesc în mod normal în plasmă; ei sunt, de asemenea, mult mai aderenți și capabili să se lege de glicoproteina Ib a receptorului plachetar VWF (GPIbα; cea mai mare polipeptidă a complexului GPIb-IX-V) în mod spontan și cu o forță de legătură mai mare decât cea obținută prin legarea VWF din plasmă de GPIbα în prezența modulatorilor ristocetină sau botrocetină.57 In vivo, acest lucru se traduce prin faptul că ULVWF este capabil să se lege de trombocite la un stres de forfecare scăzut sau inexistent, în timp ce VWF plasmatic prelucrat necesită o desfășurare indusă de un stres de forfecare ridicat pentru a se lega de trombocite.58

O parte din ULVWF recent eliberat intră direct în sângele circulant, în timp ce o altă fracțiune rămâne atașată la endoteliu, unde multimerii ULVWF se pot autoasocia pentru a forma șiruri de câteva sute de micrometri până la câțiva milimetri lungime care rămân ancorate la suprafața endotelială.59 Șirurile de ULVWF legate la suprafață sunt hiperadezive și se leagă spontan de trombocite pentru a forma șiruri decorate cu trombocite cu aspect de „mărgele pe șiruri” pe suprafața endotelială. În condiții de stres fiziologic de forfecare, șirurile ULVWF decorate cu trombocite sunt scindate de ADAMTS13 și îndepărtate de pe suprafața endotelială. Prelucrarea ulterioară, care nu este încă pe deplin caracterizată, face ca VWF să nu se poată lega spontan de trombocite. Acumularea de șiruri ULVWF decorate cu plachete pe suprafața endotelială ca urmare a nivelurilor reduse sau a absenței ADAMTS13 în circulație inițiază tromboza microvasculară, care duce la formarea și depunerea de trombi hialini bogați în plachete în microvasculatură – o caracteristică definitorie a TTP.

Șirurile ULVWF constau din mănunchiuri de multimeri VWF, iar fiecare șir este legat de suprafața endotelială la mai multe puncte de ancorare. În absența (sau la concentrații scăzute de Ca2+ și Mg2+, șirurile ULVWF se atașează de suprafața endotelială prin legarea la P-selectina.60 În prezența concentrațiilor fiziologice de cationi divalenți, șirurile ULVWF se ancorează la suprafața endotelială prin interacțiunea lor cu integrina αvβ3.61 Alte molecule sunt, fără îndoială, implicate în această ancorare a șirurilor de VWF, dar deocamdată nu au fost identificate.

Capacitatea multimerilor VWF sau ULVWF de a se autoasocia în fibre și cabluri mai groase devine un mecanism important pentru reglarea proprietăților adezive ale VWF. Savage și colab. au arătat că, sub tensiune de forfecare și în prezența trombocitelor, multimerii VWF din faza fluidă se asociază homotipic și reversibil cu multimerii VWF care sunt imobilizați pe o suprafață de colagen; multimerii VWF autoasociați susțin aderența trombocitelor sub tensiune de forfecare.62 Multimerii VWF din faza fluidă se pot asocia, de asemenea, cu șirurile ULVWF atașate la suprafața endotelială,63 iar autoasocierea este facilitată de desfășurarea parțială a moleculelor VWF indusă de stresul de forfecare64,65 sau de legarea ristocetinei.66 Multimerii VWF autoasociați formează o rețea de fibre reticulate pe suprafețele de colagen64 sau în soluție.66 În condiții de stres de forfecare, multimerii VWF în fază fluidă se pot asocia, de asemenea, cu multimerii VWF care sunt legați de trombocite prin interacțiunea cu GPIbα de pe suprafețele trombocitelor.67 Autoasocierea VWF pe suprafețele plachetare poate declanșa activarea plachetară, poate promova agregarea plachetară și poate spori creșterea trombilor.

Capacitatea VWF de a se autoasocia îi permite să producă șuvițe care rivalizează sau depășesc lungimea și grosimea celor produse prin polimerizarea fibrinei. În microvasele sintetice induse să secrete VWF prin stimulare agonistă, VWF secretat din peretele vasului ar putea să se asambleze în șuvițe capabile să acopere lumenul vasului, în special la bifurcații și curbe.68 Capacitatea VWF de a forma șuvițe și cabluri de dimensiuni atât de mari și de a înșira aceste cabluri de-a lungul traseului fluxului nu numai că mărește șansele ca șuvițele să captureze trombocite, dar le sporește și capacitatea de a mărunți eritrocitele în schistocite.

Autoasocierea VWF în sine este reglată nu numai de stresul de forfecare, ci și de factori plasmatici, care probabil pot schimba cursul și severitatea episoadelor de TTP. Autoasocierea VWF este atenuată de lipoproteinele cu densitate mare (HDL) și de apoliproteina (Apo) A-I, componenta proteică majoră din HDL. Ambele reduc semnificativ lungimea și grosimea fibrelor VWF imobilizate pe suprafața endotelială. Aderarea trombocitelor la aceste structuri hiperadezive este, de asemenea, redusă proporțional cu reducerea VWF autoasociate. Într-un model de TMA la șoarecii cu ADAMTS13 knock-out, HDL a atenuat, de asemenea, în mod semnificativ trombocitopenia indusă de infuzia de doze mari de VWF uman.69 În concordanță cu capacitatea ApoA-I de a modula autoasocierea VWF, concentrația plasmatică a acesteia se corelează invers cu nivelul de VWF hiperadeziv la pacienții cu TTP și sepsis. Aceste constatări sugerează că interferența cu autoasocierea VWF ar putea fi o nouă abordare pentru tratarea tulburărilor trombotice asociate cu VWF hiperadeziv, inclusiv TTP.

Metoproteastaza care clivează VWF este al 13-lea membru al unei familii de 18 enzime distincte de tip ADAMTS identificate până în prezent, care au similarități structurale.16,17 ADAMTS13 este compusă dintr-un domeniu N-terminal de metaloprotează de tip reprolysin (M), urmat de un domeniu dezintegrin (D), un domeniu asemănător trombospondinei-1 (T), un domeniu bogat în cisteină (C) care conține o secvență arginină-glicină-aspartat, un domeniu spațial (S), șapte domenii suplimentare asemănătoare trombospondinei-1 (T2-8) și două domenii de tip CUB (CUB1-2) neidentice la capătul C-terminal al moleculei (Fig. 24.2). Domeniile CUB conțin secvențe peptidice similare cu subcomponenții complementului C1r/C1s, cu proteina embrionară egf a ariciului de mare și cu proteina morfogenă osoasă-1.70 ADAMTS13 este o glicoproteină de 190.000 de daltoni care necesită Zn2+ și Ca2+, a cărei genă rezidă pe cromozomul 9q34 și este produsă predominant în celulele stelate ale ficatului.71,72 ADAMTS13 este inhibată de EDTA; prin urmare, testele funcționale ale enzimei se efectuează cel mai bine pe plasmă citrată.12,14-17,73-77 Plasma anticoagulată cu heparină, clorometilcetone (de exemplu, fenilalanină-prolină-aspartat clorometilcetonă), hirudină și alți inhibitori direcți ai trombinei (DTI) ar fi, de asemenea, satisfăcătoare pentru testare. Serul tratat în mod corespunzător cu inhibitori de protează este, de asemenea, adecvat pentru testare.78

Scindarea VWF de către ADAMTS13 depinde de modificările conformaționale ale VWF provocate de stresul de forfecare, o forță care modifică conformația multimerilor VWF din globulară în deschisă.79 Această tranziție conformațională este urmată de desfășurarea unuia sau mai multor domenii A2 în cadrul multimerului VWF, expunând legătura peptidică Tyr1605-Met1606 la scindarea de către ADAMTS1379 sau la oxidarea Met1606 de către hipoclorit.54 În plus față de forța de forfecare, tranziția în conformația accesibilă este facilitată, de asemenea, de modificările în structura domeniului A2 cauzate de atașarea carbohidraților,80 de substituțiile de aminoacizi în VWD de tip 2A care destabilizează plierea domeniului A2,81 și de mutațiile în VWD de tip 2B82 și de legarea ristocetinei,83 care expun simultan domeniul A1 pentru legarea trombocitelor și locul de clivaj al ADAMTS13.

Recunoașterea și clivarea VWF de către ADAMTS13 au fost studiate pe larg. Dovezi recente arată că în molecula nativă ADAMTS13, domeniile C-terminale T8-CUB sunt în contact cu domeniile N-terminale MDTCS, o interacțiune intramoleculară care inhibă parțial capacitatea domeniilor MDTCS de a lega și scinda substratul peptidic VWF-78. În această conformație nativă, ADAMTS13 este parțial autoinhibată.84,85 Capacitatea ADAMTS13 de a se plia în această conformație este aparent facilitată de flexibilitatea conferită de patru secvențe de legătură putative situate între domeniile T1 și T2, T2 și T3, T4 și T5, și T8 și CUB1.86 Autoinhibiția este atenuată atunci când domeniile C-terminale sunt fie trunchiate, fie legate de anticorpi sau de VWF multimeric, permițând angajarea domeniilor MDTCS cu substratul.

Pe baza analizelor de mutație, a studiilor de legare, a analizelor cinetice și a utilizării de substraturi peptidice sintetice, au fost identificate și rezumate într-un model de fermoar molecular,87 așa cum este reprezentat schematic în Fig. 24.3, mai multe situsuri de interacțiune între ADAMTS13 activ din punct de vedere conformațional și domeniul VWF A2 desfășurat. Odată cu expunerea VWF multimeric la un nivel critic de stres de forfecare, este expus mai întâi un exosit din domeniul A2. Acest exosit cuprinde regiunea elicoidală Glu1660-Arg1668, care se află la 65 de aminoacizi C-terminal față de situsul de clivaj și se leagă de domeniul spațial al ADAMTS13 cu o afinitate ridicată (KD ~ 10 nM).88-90 Stresul de forfecare expune, de asemenea, un al doilea exosit cu afinitate scăzută în domeniul A2 la sau în apropierea lui Asp1614 (situsul P9′), care interacționează cu Arg349 în domeniul dezintegrin al ADAMTS13.91 Interacțiunea acestor doi exosite cu regiuni complementare din ADAMTS13 poziționează locul de clivaj Tyr1605-Met1606 din VWF cu centrul activ din domeniul metaloprotezei ADAMTS13. Aceasta implică interacțiunea dintre Leu1603 (situl P3) din VWF cu Leu198, Leu232 și L272 (situl S3) complementare din ADAMTS13, Tyr1605 (situl P1) din VWF cu Leu151 și Val195 (situl S1) din ADAMTS13 și Met1606 (situl P1′) din VWF cu Asp252-Pro256 (situl S1′) din ADAMTS13.92 Phage display și analiza mutațiilor aleatorii confirmă și arată că aminoacizii din regiunea P3-P2′ și P11′ (Ile1616) sunt, de asemenea, importanți pentru clivaj.93 Astfel, interacțiunea secvențială a acestor regiuni complementare din cele două proteine multidomeniu facilitează scindarea specifică a legăturii scissile.

Se bănuiește de mult timp că eșecul de a degrada multimerii ULVWF cauzează tipurile familiale și dobândite idiopatice de TTP, sau că predispune un individ la aceste afecțiuni (Fig. 24.4).11,94 Experimentele critice efectuate pentru a verifica acest concept au fost raportate în 1997 și 1998. S-a demonstrat că patru pacienți cu TTP recurentă cronică prezentau un deficit de activitate plasmatică a ADAMTS13.12 Deoarece nu a fost detectat niciun inhibitor al enzimei, acest deficit a fost atribuit unei anomalii în producția, supraviețuirea sau funcția proteazei. În cursul anului următor, a fost elucidată patogeneza tipului mai frecvent de TTP idiopatică dobândită.13-15 Pacienții cu TTP idiopatică dobândită au avut o activitate plasmatică ADAMTS13 redusă sau chiar inexistentă în timpul episoadelor acute, dar această activitate a crescut spre normal la recuperare. Deși testele plasmatice din aceste studii nu au fost fiziologice, ele au fost totuși inovatoare și informative. Autoanticorpii de imunoglobulină (Ig) G împotriva enzimei au explicat probabil lipsa activității proteazei la majoritatea pacienților cu TTP idiopatică dobândită.13-15 Motivele pentru această dereglare imunitară tranzitorie, precum și pentru țintirea antigenică selectivă a proteazei care descompune VWF, nu sunt încă cunoscute.

Pacienții cu TTP recidivantă cronică familială au frecvent multimeri ULVWF în plasmă.11,94 Multimerii ULVWF sunt detectați folosind o metodă sensibilă de electroforeză pe gel de agaroză în unele probe de plasmă ale pacienților în timpul episoadelor acute de TTP idiopatică dobândită, dar nu și după recuperare.94 Aceste constatări au fost explicate de cercetătorii care au descoperit o absență cronică din plasmă a ADAMTS13 în TTP recidivantă cronică familială, precum și o inhibiție tranzitorie a enzimei în timpul episoadelor acute de TTP idiopatică dobândită.12-15

Majoritatea pacienților cu TTP familială au mai puțin de 5% din activitatea normală a ADAMTS13 în plasmă, indiferent dacă plasma este obținută în timpul sau după episoadele acute (cu condiția ca aceștia să nu fi primit recent perfuzii de plasmă). Majoritatea pacienților cu TTP idiopatică dobândită au mai puțin de 5% din activitatea ADAMTS13 normală în plasmă doar în timpul episoadelor acute de TTP12.-15,24,95 Deficiența severă a activității ADAMTS13 în plasma pacienților cu TTP se corelează cu incapacitatea de a cliva multimerii ULVWF pe măsură ce aceștia ies de pe suprafața celulelor endoteliale (vezi Fig. 24.4).59 Ca urmare, multimerii ULVWF secretați de celulele endoteliale rămân ancorați la aceste celule și se autoasociază în șiruri lungi59 și sunt capabili să captureze trombocitele care trec prin legarea de GPIbα plachetară (Fig. 24.5).68 (Trombocitele nu se leagă în mod spontan de formele mai mici de VWF care circulă după scindarea multimerilor ULVWF.)56 Alte trombocite se alătură ulterior agregatului plachetar în creștere (recrutate la agregat prin intermediul αIIbβ3 activat), care poate crește până la punctul de a ocluziona vasul (vezi Fig. 24.4).59,96 Deși majoritatea cazurilor de TTP idiopatică prezintă un deficit sever de ADAMTS13, un subset nu prezintă un deficit sever de activitate enzimatică, așa cum se măsoară prin testele disponibile în prezent.97 Nu este încă clar dacă acest lucru se datorează interferenței cu activitatea enzimatică din partea anticorpilor care nu sunt detectați de testele disponibile, rezistenței VWF la scindare (de exemplu, din cauza modificării oxidative),53 sau altor cauze. Cu toate acestea, este probabil ca mulți pacienți din această categorie să beneficieze în continuare de terapia de schimb de plasmă.98 De asemenea, trebuie subliniat faptul că deficitul de ADAMTS13 nu este nici sensibil, nici specific (activitatea ADAMTS13 este diminuată în multe alte afecțiuni)99 pentru a pune diagnosticul de TTP dobândit.

Circuitele de UVVWF sunt capabile să se detașeze de celulele endoteliale în absența activității ADAMTS13, fiind secționate mecanic odată cu creșterea tensiunii generate de stresul de forfecare a fluidului pe măsură ce trombocitele aderă și se agregă.59 Șirurile ULVWF-plachetare detașate pot ocluziona microvasilele din aval, contribuind la ischemia de organ.

Activitatea ADAMTS13 din plasmă este aproape întotdeauna absentă sau sever redusă la pacienții cu TTP familială,12,100,101 ca urmare a mutațiilor homozigote sau heterozigote compuse ale genei ADAMTS13.18,24,95,102,103 Mutațiile în TTP familială au fost detectate în întreaga genă în regiuni care codifică diferite domenii (vezi Fig. 24.2). În cazul unei deficiențe congenitale severe a activității ADAMTS13, episoadele de TTP încep de obicei în timpul copilăriei sau copilăriei. Cu toate acestea, la unii pacienți, episoadele de TTP manifestă nu se dezvoltă timp de ani de zile (de exemplu, în timpul unei prime sarcini),102 dacă se întâmplă vreodată. Această ultimă observație sugerează că, la unii pacienți, activitatea reziduală a ADAMTS13 rămâne, iar episoadele acute de TTP sunt declanșate atunci când eliberarea de ULVWF de către celulele endoteliale depășește capacitatea limitată a ADAMTS13 a acestora de a le procesa. Un caz în care acest lucru s-ar putea întâmpla cu regularitate este în timpul sarcinii: Se știe că nivelurile de VWF cresc în timpul gestației.104-106 În concordanță cu această noțiune, femeile cu TTP congenitală sunt adesea diagnosticate în timpul primei lor sarcini.29 La sugarii cu debut neonatal de TTP congenitală și activitate ADAMTS13 mai mică de 5%, insuficiența renală tranzitorie sau progresivă este adesea o componentă proeminentă a afecțiunii.107 Acești pacienți se aseamănă din punct de vedere clinic cu doi pacienți descriși în 1960 de Schulman și colaboratorii săi108 și în 1978 de Upshaw109; în consecință, acest subgrup pediatric este denumit uneori ca având „sindromul Upshaw-Schulman.”

La mulți pacienți cu TTP dobândită, activitatea ADAMTS13 plasmatică este fie absentă, fie sever redusă în timpul episoadelor acute, și crește pe măsură ce se recuperează, fie că este vorba de episoade unice sau recurente.13-15 Autoanticorpii IgG care inhibă activitatea plasmatică ADAMTS13 pot fi detectați la 44% până la 94% din acești pacienți.13-15,102,110,111 Aceste rezultate sugerează prezența unui defect tranzitoriu sau intermitent recurent în reglarea imunitară la mulți pacienți care au TTP idiopatic dobândit asociat cu deficit de ADAMTS13. Anticorpii care inhibă ADAMTS13 plasmatică au fost, de asemenea, identificați la câțiva pacienți cu TTP asociată cu ticlopidină sau clopidogrel.34,112 Nu se știe încă dacă un defect sever tranzitoriu în producția sau supraviețuirea ADAMTS13 apare la pacienții cu TTP dobândită care nu au autoanticorpi detectabili împotriva enzimei. Alternativ, eșecul de a detecta autoanticorpii inhibitori la unii pacienți poate reflecta sensibilitatea limitată a sistemelor de testare utilizate în prezent. Autoanticorpii neinhibitori care s-ar putea lega și ar putea media eliminarea imună a ADAMTS13 nu sunt detectați de sistemul de testare actual.

Un studiu a evaluat epitopi ai ADAMTS13 recunoscuți de autoanticorpii policlonali la 25 de pacienți cu TTP dobândită,113 constatând că țintele anticorpilor au inclus invariabil secvența domeniului bogat în cisteină/spacer (CS); la 3 pacienți, aceasta a fost singura regiune vizată de anticorpi. Ceilalți 22 de autoanticorpi au reacționat cu secvența domeniului CS plus domeniile CUB (64%), cu secvența de metaloprotează/disintegrin-like/primul domeniu asemănător trombospondinei-1 (MDT) (56%) sau cu regiunea care conținea a doua până la a opta repetiție asemănătoare trombospondinei-1 (T2-8, 28%) (vezi Fig. 24.2). Regiunea propeptidică a fost, de asemenea, identificată de 20% dintre autoanticorpi,113 ceea ce indică faptul că eliminarea propeptidei nu este necesară pentru secreția enzimei active.114 Autoanticorpii inhibă activitatea ADAMTS13 sau îi scad supraviețuirea. Într-un alt studiu efectuat pe șapte pacienți, Luken et al.115 au identificat la șase pacienți autoanticorpi ADAMTS13 care se legau exclusiv în cadrul domeniului spacer (S); la cel de-al șaptelea pacient, anticorpii se legau atât de domeniul S, cât și de repetițiile T2-8. Prin mutageneză, acești cercetători au determinat că regiunile Thr572-Asn579 și Val657-Gly666 din domeniul spacer al ADAMTS13 erau epitopi comuni pentru legarea autoanticorpilor.116 Când Arg660, Tyr661 sau Tyr665 au fost înlocuite cu alanină, legarea autoanticorpilor de la cei șase pacienți cu TTP a fost eliminată.117

Autoanticorpii împotriva ADAMTS13 la pacienții cu TTP dobândită aparțin predominant clasei IgG,118 deși au fost detectați și anticorpi din clasa IgM și IgA.119 Clonarea și secvențierea anticorpilor monoclonali de la pacienții cu TTP dobândită arată că există o încorporare preferențială a segmentului genetic al lanțului greu VH1-69 în regiunea variabilă a imunoglobulinelor.120,121 Această preferință sugerează că regiunea CDR2 sau CDR3 a VH1-69 poate contribui la specificitatea pentru un epitop de pe domeniul spacer al ADAMTS13. Într-o analiză a distribuției subtipurilor de anticorpi la 58 de pacienți cu TTP acută dobândită, au fost detectați anticorpi aparținând tuturor subtipurilor IgG.118 IgG4 a fost cel mai răspândit subtip, fiind prezent la 90% dintre pacienți, fie singur, fie în combinație cu alte subtipuri IgG.

Producția de autoanticorpi ADAMTS13 este aproape sigur influențată genetic. Acest fapt este subliniat de descoperirea la surori gemene a TTP dobândită cauzată de autoanticorpii ADAMTS13.122 Recidivele apar la 23% până la 44% dintre pacienții cu TTP dobândită,102,110,123,124 adesea în timpul primului an de la episodul inițial.102 Recidiva este mai frecventă la pacienții cu cele mai scăzute niveluri de activitate ADAMTS13 (<10%).

Printre sarcină și perioada postnatală reprezintă o provocare specială în ceea ce privește TTP. În primul rând, preeclampsia și sindromul HELLP (hemoliză, enzime hepatice crescute, trombocite scăzute) au multe caracteristici clinice care se suprapun cu TTP și pot împărtăși anumite caracteristici fiziopatologice, cum ar fi disfuncția endotelială sistemică și proteinuria (vezi capitolul 32).125 Sindromul HELLP poate fi deosebit de dificil de distins de TTP prin faptul că manifestă, de asemenea, anemie hemolitică microangiopatică, niveluri ridicate de LDH și trombocitopenie (deși, de obicei, nu la fel de severă ca în cazul TTP).126 TTP în timpul sarcinii poate fi asociat cu autoanticorpi împotriva ADAMTS13, iar boala se manifestă, de obicei, aproape de termen sau după naștere.127 Estimările riscului de recurență în timpul sarcinilor ulterioare variază foarte mult, variind de la 26% la 73% pentru fiecare sarcină.102

Activitatea ADAMTS13 plasmatică la adulții sănătoși variază de la aproximativ 50% la 178% din plasma mixtă normală folosind testele statice disponibile în prezent. O activitate redusă a ADAMTS13 a fost, de asemenea, constatată în afecțiuni hepatice, tumori maligne diseminate,128 sindroame inflamatorii sistemice, cum ar fi cele cauzate de endotoxină,129 pancreatită acută,130 sepsis sever și șoc septic,131 CID indusă de sepsis,132 și disfuncție de organ indusă de sepsis.133-135 În plus, niveluri scăzute de ADAMTS13 pot fi constatate în timpul sarcinii și la nou-născuți.136 Cu excepția acelor femei peripartum care dezvoltă TTP manifestă,102,110 activitatea ADAMTS13 observată la pacienții cu aceste afecțiuni nu este redusă la valorile extrem de scăzute (<5% din valoarea normală) întâlnite la majoritatea pacienților cu TTP familială sau dobândită.

Sesizări ADAMTS13

Sesizările ADAMTS13 determină activitatea proteolitică, nivelul antigenului și nivelul autoanticorpilor anti-ADAMTS13. Primele teste de activitate ADAMTS13 se bazau pe degradarea multimerilor VWF purificați în prezența agenților denaturanți și pe cuantificarea produselor de scindare prin imunoblotting,74,75 legarea colagenului rezidual,137 sau reducerea agregării plachetare induse de ristocetină.138 Deși aceste teste sunt sensibile, realizarea lor este greoaie și consumatoare de timp și implică utilizarea de denaturanți. Aceste teste au fost înlocuite după ce studiile asupra fragmentelor de VWF recombinant au evidențiat secvențe minime necesare pentru măsurarea activității. Kokame și colaboratorii au efectuat deleții parțiale ale domeniului A2 al VWF și au identificat o peptidă minimă de 73 de aminoacizi (VWF73, Asp1596-Arg1668) care a fost scindată eficient de ADAMTS13 în absența denaturanților în condiții statice.88 Ulterior, au fost dezvoltate mai multe teste bazate pe scindarea peptidelor care înglobează VWF73, cum ar fi transferul de energie prin rezonanță de fluorescență (FRET),97 un VWF78 legat cu HRP,139 ELISA,140 imunoblotting,141 și spectrometrie de masă142.

În 2008, a fost efectuat un al doilea studiu colaborativ internațional pentru a compara performanța a opt teste funcționale și a trei teste antigenice pentru ADAMTS13.143 Compararea acestor metode a arătat că testele de clivaj bazate pe peptide VWF modificate ca substraturi au oferit o acuratețe și o reproductibilitate ridicate și o variație și o variabilitate între metode scăzute. De atunci, testul FRET-VWF73 a fost utilizat pe scară largă pentru a cuantifica activitatea ADAMTS13 în probele pacienților. Deși este ușor de realizat, testul bazat pe FRET are mai multe limitări. În primul rând, scindarea FRET-VWF73 folosind plasmă citrată ca sursă de ADAMTS13 ar trebui să se efectueze la o temperatură mai mică de 33°C, deoarece la 37°C are loc o inactivare ireversibilă semnificativă a ADAMTS13 prin chelarea calciului mediată de citrat. În al doilea rând, pentru detectarea optimă a semnalului de fluorescență este necesar să se efectueze scindarea substratului FRET-VWF73 la pH 6,1, ceea ce reduce rata de scindare. În al treilea rând, la acest pH suboptimal, unii autoanticorpi inhibitori nu formează complexe stabile cu ADAMTS13, iar acești anticorpi rămân nedetectați în studiile de inhibiție. În al patrulea rând, se produce o interferență semnificativă a semnalului de fluorescență de către hemoglobină și bilirubină din cauza suprapunerii spectrale. A fost dezvoltat un substrat peptidic îmbunătățit bazat pe FRET, FRETS-rVWF71. Activitatea ADAMTS13 în ser și în plasmă citrată sau heparinizată poate fi măsurată cu acest substrat îmbunătățit la pH fiziologic, forță ionică și concentrație de calciu, fără interferența multimerilor VWF endogeni, a bilirubinei sau a hemoglobinei din plasmă.78 O altă limitare a acestor teste de activitate pe bază de peptide este faptul că nu este evaluată capacitatea ADAMTS13 de a scinda VWF multimeric în condiții de stres de forfecare. Cu toate că s-a demonstrat că stresul de forfecare produs de un vortex constant promovează scindarea multimerilor VWF144 , cuantificarea produselor de scindare prin imunoblotting necesită mult timp. Cel puțin patru kituri comerciale sunt disponibile pentru măsurarea activității ADAMTS13 pe baza unor metode raportate. Cu toate acestea, aceste kituri nu au fost evaluate în cadrul unor studii de comparare directă și standardizare.

Nivelurile antigenului ADAMTS13 au fost cuantificate cu ajutorul anticorpilor monoclonali și policlonali.145,146 Influența trunchierii, a mutațiilor și a autoanticorpilor asupra preciziei și sensibilității acestor teste nu este clară. Sunt disponibile cinci kituri de testare comerciale pentru măsurarea nivelurilor de antigen ADAMTS13, dar nu au fost efectuate validări și comparații cu alte teste.

În 2015, a fost stabilit primul standard internațional pentru ADAMTS13 și a fost testat în 32 de laboratoare din 14 țări pentru activitatea ADAMTS13 și nivelurile de antigen față de standardele locale.147 Acest standard de plasmă, denumit WHO IS (12/252), a fost derivat din plasmă combinată de la 38 de donatori sănătoși normali. Acest studiu a arătat o valoare medie consensuală de 0,91 unități/mL de activitate ADAMTS13 pentru această plasmă, cu o variabilitate interlaboratoare de 12,4%, și 0,92 unități/mL de antigen ADAMTS13, cu o variabilitate interlaboratoare de 16,3%. Variabilitatea mare între laboratoare nu s-a datorat în primul rând utilizării unor standarde locale diferite, ci diferențelor metodologice dintre laboratoare.

Dezvoltarea autoanticorpilor anti-ADAMTS13 se realizează de obicei prin amestecarea plasmei pacientului inactivate termic cu o cantitate cunoscută de plasmă normală combinată și măsurarea activității reziduale ADAMTS13. Anticorpii ne-neutralizanți sunt detectați prin imunoblotting. 148

Deși până în prezent nu a fost identificat niciun inhibitor non-anticorp specific ADAMTS13, mai multe proteine și peptide pot inhiba clivarea ADAMTS13 a VWF în condiții speciale. Printre acestea se numără hemoglobina, IL-6, trombospondina-1 și α-defensinele neutrofile. În toate cazurile, agenții inhibitori se leagă aparent de substrat, VWF, împiedicând scindarea VWF de către ADAMTS13. S-a demonstrat că hemoglobina acționează în acest mod, legând șirurile de VWF pe suprafața endotelială în condiții de flux și blocând competitiv clivarea de către ADAMTS13.149 Acest mecanism poate contribui la complicațiile vaso-ocluzive la pacienții cu anemie falciformă cu hemoliză semnificativă și poate complica și mai mult TTP atunci când ratele hemolitice sunt ridicate. Concentrații ridicate de IL-6 (50 și 100 ng/mL) inhibă, de asemenea, clivarea mediată de ADAMTS13 a șirurilor ULVWF endoteliale sub flux in vitro,50 sugerând că acest mecanism poate contribui la tromboză în timpul furtunii de citokine150 sau a sindromului de eliberare de citokine.151 Trombospondina-1, o proteină abundentă în granulele α ale trombocitelor care este eliberată în circulație la activarea trombocitelor, se leagă de regiunile A2-A3 ale VWF, blocând și inhibând competitiv clivarea de către ADAMTS13 in vitro.152 Această proprietate protrombotică a trombospondinei-1 este în concordanță cu recrutarea defectuoasă a trombocitelor la endoteliul activat sau lezat și cu embolizarea crescută a trombilor trombocitare observate la șoarecii knock-out cu trombospondină-1.153 Peptidele neutrofile umane cunoscute sub numele de α-defensine, eliberate de neutrofilele activate, se pot lega de domeniul A2 al VWF și pot bloca competitiv clivarea mediată de ADAMTS13.154 Concentrațiile de α-defensine cresc de până la șapte ori mai mult în plasma pacienților cu TTP dobândită.

.