Metode spectroscopice
Spectroscopie de absorbție. Pentru unele teste enzimatice, este posibil să se măsoare reactantul sau produsul direct pe baza proprietăților sale de absorbție Fersht (1999). În reacția catalizată de glucoza-6-fosfat dehidrogenază (EC 1.1.1.1.49), un produs (NADH) absoarbe lumina la 340 nm, ceea ce face posibilă monitorizarea reacției urmărind creșterea absorbanței la această lungime de undă.
Glucoză 6-fosfat + NAD+ → 6-fosfogluconat + NADH + H+
În alte cazuri, un reactant sau un produs este măsurat indirect. În cazul acetilcolinesterazei (EC 3.1.1.1.7), de exemplu, acetiltiocolina este utilizată ca substrat care eliberează tiocolină la expunerea la enzimă. Tiocolina reacționează cu reactivul lui Ellman pentru a produce un produs colorat, ceea ce face posibilă monitorizarea reacției prin urmărirea creșterii absorbanței.
Acetiltiocolină + H2O → acetat + H+ + tiocolină
Tiocolină + reactiv Ellman → derivat colorat
Dezvoltarea cuplată este uneori utilizată pentru a monitoriza activitatea enzimatică. În acest caz, reacția enzimatică de interes este împerecheată cu o a doua reacție care este cuplată pentru o măsurare convenabilă. Un exemplu în acest sens este testul pentru hexokinază (EC 2.7.1.1.1). În acest caz, în amestecul de analiză se include un exces de glucoză-6-fosfat dehidrogenază și NAD+ și se monitorizează absorbția la 340 nm.
Reacția I: Glucoză + ATP → glucoză 6-fosfat + ADP
Reacția II: Glucoză 6-fosfat + NAD+ → 6-fosfogluconat + NADH + H+
În acest exemplu, reacția I ar trebui să fie limitatoare de viteză și concentrația de glucoză 6-fosfat ar trebui să ajungă la o stare de echilibru după o perioadă de întârziere. Cleland Cleland (1979) a formulat o procedură pentru a se asigura că testul cuplat furnizează o măsurătoare exactă a vitezei de reacție a enzimei. Dacă este posibil, este preferabil să se monitorizeze o reacție în mod continuu. Cu testele descrise mai sus, spectrofotometrul poate fi programat pentru a oferi o citire continuă în funcție de timp. În tehnicile de separare, care pot include utilizarea radioactivității, a electroforezei sau a cromatografiei, se folosesc teste discontinue sau cu punct final. După ce s-a stabilit o perioadă de timp liniară pentru o analiză, se măsoară un parametru la un singur moment în cadrul perioadei de timp liniare (cel mai preferabil, un moment aproape de mijlocul fazei liniare). Viteza se determină apoi pe baza diferenței de semnal la acel moment și la inițierea reacției. Trebuie să se dea dovadă de prudență în cazul testelor cu punct final și trebuie să se verifice cursul timpului pentru a confirma liniaritatea. Modificările condițiilor de incubare, cum ar fi temperatura, pH-ul sau concentrația de substrat, pot modifica liniaritatea unui test. Pentru testele enzimatice de rutină, vasul de reacție conține toate componentele, cu excepția uneia, iar reacția este inițiată prin adăugarea componentei lipsă (enzima sau unul dintre substraturi). Celelalte componente trebuie să fie echilibrate din punct de vedere al pH-ului, temperaturii și puterii ionice. Reacția este inițiată, de obicei, prin adăugarea unui volum mic de soluție stoc concentrată a componentei lipsă. Un volum mic asigură faptul că această adăugare nu perturbă condițiile de echilibru deja stabilite. În cazul în care nu este posibil să se adauge o componentă mică, componentele separate trebuie să se afle la aceeași temperatură, forță ionică și p H. Deși trebuie să existe o amestecare completă a celor două componente, trebuie evitată agitația energică, deoarece aceasta poate denatura proteina enzimatică. Amestecul poate fi realizat prin inversarea unui tub cu un dop atașat sau a unei cuve cu un sigiliu Parafilm. Proteinele diluate sunt adesea mai puțin stabile decât cele mai concentrate, iar testele sunt adesea efectuate în prezența unei proteine inerte, cum ar fi albumina serică bovină (0,25 mg/ml), pentru a stabiliza enzima purificată. Trebuie efectuate experimente pentru a se asigura că proteina este inertă. Deoarece albumina, de exemplu, se poate lega de substraturile hidrofobe, este posibil ca aceasta să nu fie întotdeauna adecvată în acest scop. Pentru testele discontinue, se poate seta cronometrul și se pot aspira probe la intervale de timp specifice după amestecare. Pentru majoritatea spectrofotometrelor, detecția este inițiată manual cu ajutorul unui panou al instrumentului sau al unei tastaturi de calculator. Pentru a adăuga un component într-o cuvă, este nevoie de aproximativ 20 de secunde pentru a plasa cuva într-un spectrofotometru și pentru a începe detecția prin apăsarea unei taste de calculator. Acest timp nu are, de obicei, o mare importanță, deoarece, pentru majoritatea reacțiilor, testul se execută între 10 și 30 de minute. Măsurătorile de control includ un martor alb care nu conține enzime și un martor alb care nu conține substrat. Aceste controale garantează că nu au loc reacții accidentale. Viteza de control (martor fără enzime) se scade din data generată de experiment pentru a obține viteza reală a reacției enzimatice. Pentru multe teste, este necesar să se stingă sau să se oprească reacția la un anumit moment pentru a preveni producerea ulterioară de produs. De exemplu, probele pot fi prelevate la intervale de 5 minute pentru o perioadă de timp predeterminată, iar produsul poate fi măsurat prin HPLC.
Fiecare analiză cromatografică poate dura 30 de minute. Metodele de terminare a reacției implică, de obicei, denaturarea enzimei prin adăugarea de acid sau prin scufundarea într-o baie de apă clocotită. Activitatea unor metaloenzime poate fi stinsă cu EDTA sau cu un alt chelator de ioni metalici. Cele mai multe teste enzimatice se bazează pe tehnici spectroscopice, cele două cele mai frecvent utilizate fiind absorbția și fluorescența Fersht (1999). Lungimea de undă utilizată pentru urmărirea vitezei de reacție trebuie să fie cea care produce cea mai mare diferență de absorbție între substrat și produs. Măsurătorile de absorbție se efectuează cu ajutorul unui spectrofotometru standard, probele fiind conținute în celule specializate, sau cuve. Sunt disponibile în comerț cuve de unică folosință din plastic care conțin probe de 1 sau 3 ml. Utilizarea lor este limitată la domeniul lungimilor de undă vizibile (350-800 nm). Pentru măsurători la lungimi de undă mai mici de 350 nm trebuie utilizate cuve de cuarț (sticla și plasticul absorb lumina în domeniul UV). Lungimile de parcurs pentru cuvete sunt furnizate de către producător. Lungimile de parcurs populare sunt de 1,00 cm, 0,40 cm și 0,20 cm. Un număr din ce în ce mai mare de teste se efectuează cu plăci de microtitrare cu 96 de godeuri cu fund de plastic sau de cuarț. Concentrația unei substanțe care absoarbe lumina la anumite lungimi de undă poate fi determinată prin legea lui Beer:
A = εcl,
unde A este absorbanța probei la o anumită lungime de undă, c este concentrația probei, l este lungimea traseului și ε este coeficientul de extincție sau absorptivitatea molară. ε are ca unități de măsură M-1 cm-1 sau mM-1 cm-1. Dacă valoarea lui ε este cunoscută pentru o anumită substanță, este posibil să se calculeze concentrația acelei substanțe într-o soluție prin măsurarea absorbției sale în acea soluție. Utilizând legea lui Beer, este posibil să se calculeze rata de variație a concentrației pe parcursul unei reacții. O potențială eroare în cazul utilizării măsurătorilor de absorbție rezultă dintr-o abatere de la legea lui Beer, deoarece aceasta este valabilă doar pentru o gamă finită de valori de absorbție. Astfel, deoarece este posibil să nu se aplice în cazul unor absorbanțe mai mari de 1, testele ar trebui să fie concepute astfel încât valorile experimentale să fie mai mici decât această valoare. Este posibil să se ocolească unele dintre aceste probleme prin utilizarea unor cuve cu lungimi de parcurs mai mici. Un eșantion cu o absorbanță de 1,00 într-o cuvă cu lungimea traseului de 1,00 cm va avea o absorbanță de 0,20 într-o cuvă cu lungimea traseului de 0,20 cm. În general, lucrul cu o absorbanță de aproximativ 0,5 reprezintă un compromis între minimizarea zgomotului optic inerent unui spectrofotometru și obținerea unui semnal rezonabil de măsurat. Turbiditatea dintr-o soluție poate împrăștia lumina și produce o absorbție aparentă. Filtrarea sau centrifugarea pot fi utilizate pentru a elimina aceste particule. Cu toate că modificările lungimii traseului ocolesc unele abateri de la liniaritate (adică atunci când absorbanța este atât de mare încât spectrofotometrul nu poate face o măsurătoare precisă), frecvent abaterile se datorează interacțiunilor intermoleculare dintre speciile absorbante. Dimerizarea (sau formarea de eximeri de ordin superior) are loc la concentrații mai mari ale speciilor absorbante. În aceste cazuri, legea lui Beer va fi respectată dacă se scade concentrația de produs. Acest lucru poate fi realizat fie prin încetinirea reacției (prin scăderea concentrației de enzimă), fie prin efectuarea de măsurători pe o perioadă mai scurtă de timp (înainte de a se constata abateri de la legea lui Beer).
.