Organizarea și expresia genomului
ARN genomic al luteoviridei conține cinci până la șapte ORF-uri conservate (Fig. 3). ORF-urile 1, 2, 3 și 5 sunt împărțite între toți membrii Luteoviridae. Luteovirusurilor le lipsește ORF0. Enamovirusurilor le lipsește ORF4. Genomurile luteovirusurilor și polerovirusurilor conțin un mic ORF (ORF3a) în amonte de ORF3. Genomurile luteovirusurilor conțin un mic ORF (ORF6) în aval de ORF5. Genomul PLRV conține ORF-urile 6 și 7, în cadrul ORF5 și ORF8 în cadrul ORF1. La enamo- și polerovirusuri, ORF0 se suprapune ORF1 cu mai mult de 600 nt, care se suprapune, de asemenea, ORF2 cu mai mult de 600 nt. La luteovirusuri, ORF1 se suprapune ORF2 cu mai puțin de 50 nt. În majoritatea secvențelor genomice ale luteovirusurilor și polerovirusurilor, ORF4 este conținută complet în ORF3. Un singur codon de terminație de tip „in-frame amber” (UAG) separă ORF5 de ORF3.
Fig. 3. Hărți ale genomurilor virale ale genurilor din familia Luteoviridae. ORF-urile individuale sunt reprezentate cu cutii deschise. ORF-urile sunt eșalonate pe verticală pentru a arăta diferitele cadre de citire ocupate de fiecare ORF. Căsuțele galbene indică produsele proteice cu dimensiunile preconizate enumerate în dreapta fiecăruia. Poliproteinele codificate de ORF1 din enamo- și polerovirusuri conțin protează și proteina legată de genom (VPg). Secvențele de aminoacizi prezise ale proteinelor codificate de ORF2 sunt similare cu ARN-polimerazele ARN-dependente. ORF3, care codifică principala proteină de acoperire, este separată de ORF5 printr-un codon de terminare de culoare chihlimbar. ORF4, atunci când este prezent, este cel mai adesea conținut în ORF3 și codifică o proteină necesară pentru mișcarea virusului de la celulă la celulă. Luteo- și polerovirusurile conțin un ORF3a pentru care traducerea este inițiată la un codon non-AUG. Regiunile necodificatoare 3′ ale luteovirusurilor conțin elemente potențatoare de traducere (BTE). La PLRV, ORF7 se află în cadru cu extremitatea C-terminală a ORF5, iar traducerea ORF8 este mediată de un site de inițiere internă de intrare a ribozomului (IRES). Luteo- și polerovirusurile produc trei ARN subgenomici (sgRNA), dar enamovirusurile produc un singur sgRNA.
Luteoviridele au secvențe non-codificatoare 5′ și intergenice relativ scurte. Primul ORF este precedat de 21 nt în cazul ARN-ului CABYV și de 142 nt în cazul ARN-ului virusului pitic al soiei (SbDV). ORF-urile 2 și 3 sunt separate de 112-200 nt de ARN necodificator. Există o variație considerabilă în ceea ce privește lungimea secvenței din aval de ORF5, care variază de la 167 nt pentru CYDV-RPV la 650 nt pentru SbDV.
Luteoviridele utilizează o gamă largă de strategii pentru a-și exprima genomurile compacte. ORF-urile 0, 1, 2 și 8 sunt exprimate direct din ARN-uri genomice. ORF-urile din aval sunt exprimate din ARN-uri subgenomice (sgRNAs) care sunt transcrise din situsuri de inițiere interne de către ARN-polimerazele dependente de ARN (RdRps) codificate de virus din ARN-uri cu catenă negativă și sunt 3′ co-terminale cu ARN-ul genomic. Deoarece codonul de inițiere pentru ORF0 al polerovirusurilor și enamovirusurilor se află în amonte de cel al ORF1, traducerea ORF1 este inițiată prin „scanare cu scurgeri”, în care ribozomii ocolesc AUG-ul din ORF0 și continuă să scaneze ARN-ul genomic până când ajung la AUG-ul ORF1. Produsele proteice ale ORF2 sunt exprimate sub forma unei fuziuni translaționale cu produsul ORF1. Cu o frecvență redusă, dar semnificativă, în timpul exprimării ORF1, traducerea continuă în ORF2 printr-o schimbare de cadru -1 care produce o proteină mare care conține secvențe codificate atât de ORF 1, cât și de ORF 2 într-o singură polipeptidă. Schimbarea de cadru este mediată de o „secvență hepta-nucleotidică alunecoasă” (sub forma X XXY YYZ) și de o structură secundară a ARN-ului din aval, denumită pseudoknot, care determină ribozomii să facă o pauză și apoi să se deplaseze înapoi cu un nt înainte de a continua traducerea în noul cadru de citire. ORF8, care a fost identificat numai la PLRV, se află în întregime în ORF1 într-un cadru de citire diferit și codifică o proteină de 5 kDa asociată replicării. Pentru a exprima ORF8, secvențele din cadrul ORF se pliază într-o structură numită situs de intrare internă a ribozomului (IRES), care recrutează ribozomii pentru a iniția traducerea la aproximativ 1600 nt în aval de terminalul 5′ al ARN PLRV.
ORF-urile 3a, 3, 4 și 5 sunt exprimate printr-un mecanism de scanare cu scurgeri de la terminalul 5′ al sgRNA1, care este situat la aproximativ 200 nt în amonte de ORF3 la sfârșitul ORF2 și se extinde până la terminalul 3′ al genomului. Traducerea ORF3a este inițiată la un codon non-AUG. ORF4 al majorității luteo- și polerovirusurilor este conținut în ORF3. La toate luteoviridele, ORF5 este exprimat numai ca o fuziune translațională cu produsele ORF3 prin citirea codonului de oprire UAG de la sfârșitul ORF3, care produce o proteină cu produsul ORF3 la extremitatea N-terminală și produsul ORF5 la extremitatea C-terminală. Trecerea prin citire este reglată de interacțiunile ARN-ARN locale și pe distanțe lungi și, în cazul luteovirusurilor și al unor polerovirusuri, necesită prezența repetițiilor CCXXXX (unde X este o bază oarecare) în aval de codonul de oprire ORF3. Luteo- și polerovirusurile produc un al doilea sgRNA mai mic, capabil să exprime ORF-urile 6 și 7. Al treilea sgRNA, care nu pare să codifice proteine, este produs la niveluri foarte ridicate la luteovirusuri, dar doar la niveluri scăzute la PLRV.
În timp ce ARN-urile luteo- și polerovirusurilor conțin 5′ VPg care interacționează cu factorii de inițiere a traducerii, ARN-urile luteovirusurilor conțin doar un fosfat 5′. Terminațiile 5′ nemodificate sunt slab recunoscute pentru inițierea traducerii. Pentru a eluda această problemă, genomul BYDV-PAV conține o secvență scurtă (element de traducere BYDV; BTE) situată în regiunea necodificatoare 3′ în aval de ORF5, care interacționează cu secvențele din apropierea terminațiilor 5′ ale ARN genomic și sgRNA1 pentru a promova inițierea traducerii independente de cap.
Silențierea post-transcripțională a genelor (PTGS) este o apărare antivirală înnăscută și foarte adaptivă care se găsește la toate eucariotele și care este activată de ARN dublu catenar (dsRNA), care sunt produse în timpul replicării virusurilor. Cercetările privind funcțiile proteinelor codificate de luteoviridele au arătat că proteinele de 28-34 kDa codificate de ORF0 sunt supresori puternici ai PTGS local și sistemic pentru polero- și enamovirusuri. Genomurile luteovirusurilor sunt lipsite de ORF0, dar produsul ORF4 la luteovirusuri funcționează pentru a suprima PTGS sistemic.
Proteinele codificate de ORF1 ale enamo- și polerovirusurilor conțin VPg și o serin protează asemănătoare cu chimotripsina care este responsabilă de procesarea proteolitică a poliproteinelor codificate de ORF1. Proteaza scindează proteina ORF1 în interior pentru a elibera VPg, care este atașată covalent la ARN genomic. Proteina exprimată de ORF8 a PLRV este necesară pentru replicarea virusului. ORF2 ale luteoviridelor au o capacitate de codificare de 59-67 kDa pentru proteine care sunt foarte asemănătoare cu RdRps cunoscute și, prin urmare, reprezintă probabil porțiunea catalitică a replicazei virale.
Pentru luteo- și poleroviridele ORF3a produce proteine foarte conservate de 4,8-5,3 kDa care sunt esențiale pentru deplasarea pe distanțe lungi. ORF3 codifică principalul CP al luteovirusurilor, a cărui dimensiune variază între 21 și 23 kDa. ORF5 are o capacitate de codificare de 29-56 kDa. Cu toate acestea, ORF5 este exprimat doar ca o fuziune translațională cu produsul ORF3 atunci când, în aproximativ 10 % din timp, traducerea nu se oprește la sfârșitul ORF3 și continuă până la sfârșitul ORF5. Porțiunea ORF5 a acestei proteine readthrough a fost implicată în transmiterea afidelor și în stabilitatea virusului. Experimentele cu PLRV și BYDV-PAV au arătat că regiunea N-terminală a proteinei de citire ORF5 determină capacitatea particulelor de virus de a se lega de proteinele produse de bacteriile endosimbiotice ale vectorilor afidei. Interacțiunile particulelor de virus cu aceste proteine par a fi esențiale pentru persistența virusurilor în afide. Modificările secvenței de nucleotide din ORF5 a PEMV-1 anulează transmisibilitatea la afide. Porțiunile N-terminale ale proteinelor ORF5 sunt foarte conservate între luteoviride, în timp ce C-terminalele sunt mult mai variabile.
Genomurile luteo- și polerovirusurilor posedă un ORF4 care este conținut în ORF3 și codifică proteine de 17-21 kDa. Virusurile care conțin mutații în ORF4 sunt capabile să se reproducă în protoplachete de plante izolate, dar sunt deficitare sau întârziate în mișcarea sistemică în plante întregi. Prin urmare, produsul ORF4 pare să fie necesar pentru deplasarea virusului în interiorul plantelor infectate. Această ipoteză este susținută de observația că enamovirozele nu au ORF4. În timp ce luteo- și polerovirusurile sunt limitate la floem și la țesuturile asociate, enamovirusul PEMV-1 este capabil să se deplaseze sistemic prin alte țesuturi vegetale în prezența PEMV-2, care, în condiții naturale, coexistă invariabil cu PEMV-1.
Câteva genomuri de luteo- și polerovirusuri conțin mici ORF-uri în interiorul și/sau în aval de ORF5. La luteovirusuri, nu au fost detectați produse proteice din aceste ORF-uri în celulele infectate. Genomurile BYDV-PAV care nu exprimă ORF6 sunt încă capabile să se reproducă în protoplaste. Dimensiunile preconizate ale proteinelor exprimate de ORF-urile 6 și 7 ale PLRV sunt de 7,1 și, respectiv, 14 kDa. Pe baza studiilor de mutație, s-a propus ca aceste regiuni ale genomului să reglementeze transcripția târziu în timpul infecției.
.