Alai

Aptaza vacuolară (V-ATPază) este o pompă de protoni cu mai multe subunități, condusă de ATP, care acidifică veziculele intracelulare și mediul extracelular și astfel este implicată într-un număr mare de funcții biologice. Analizele anterioare au descris în mod elegant structura și funcția V-ATPazei . Aici analizăm literatura recentă referitoare la funcția și contribuția V-ATPazei la diferite procese celulare în fiziologia normală, cu accent pe cancer. De asemenea, prezentăm în detaliu reglarea Notch și a altor căi de semnalizare de către V-ATPază, dezvăluind o funcție până acum mai puțin cunoscută a V-ATPazei în semnalizarea celulară.

Izoformele subunităților

Structural, V-ATPaza este un nanomotor rotativ alcătuit din mai multe subunități, fiecare cu mai multe izoforme . Subunitățile sunt dispuse în două domenii: un domeniu periferic V1, responsabil pentru hidroliza ATP și un domeniu membranar integral VO, care funcționează în translocarea protonilor. Structura V-ATPazei V a fost foarte bine conservată în toate celulele eucariote și este implicată în diverse funcții la toate speciile. La mamifere, domeniul V1 are opt subunități diferite (A, B, C, C, D, E, F, G și H), în timp ce domeniul VO este compus din șase subunități diferite (a, c, c, c’, c”, d, e) . Cerința diferențiată de acidificare în veziculele intracelulare și în mediul extracelular determină funcția și reglarea V-ATPazei. Pentru a reduce sau a crește eficiența pompei, V-ATPază controlează cuplarea dintre hidroliza ATP și pomparea protonilor. Acest proces este determinat de subunitatea „a” a V-ATPazei . În mod similar, direcționarea specifică celulei și compartimentului V-ATPază depinde, de asemenea, de izoformele subunității „a”. VOa este o proteină membranară integrală de 100 kDa, cu o coadă citosolică N-terminală și 9 domenii transmembranare. Au fost identificate patru izoforme ale subunității „a” (a1, a2, a3 și a4) cu distribuții veziculare și de tip celular distincte. VOa1 este exprimată pe veziculele sinaptice, iar VOa2 este exprimată pe veziculele intracelulare, cum ar fi golgi și endosomii timpurii. VOa3 este exprimată pe membrana plasmatică a osteoclastelor, în timp ce VOa4 este exprimată pe membrana plasmatică a celulelor intercalate renale. În plus, extremitatea N-terminală a subunității „a” este un motiv important care leagă domeniul V1 de membrană și a fost, de asemenea, raportat ca fiind un senzor unic de pH în lizozomi. Expresia și localizarea izoformă a subunității „a” este esențială pentru funcționarea V-ATPazei .

Funcția fiziologică a V-ATPazei

V-ATPazei este exprimată omniprezent și îndeplinește diverse funcții biologice în cadrul celulelor din majoritatea țesuturilor prin acidificarea veziculară, luminală și extracelulară . Pentru a realiza numeroase funcții celulare, V-ATPază facilitează concentrarea localizată a protonilor în veziculele acide din căile endocitară și exocitară .

Acidificarea veziculară

Endosomi și lizozomi

V-ATPază este cel mai bine cunoscută pentru rolul său în acidificarea veziculelor intracelulare precum endosomii și lizozomii. Pe suprafața endosomilor, V-ATPasa acidifică și modulează astfel procese celulare importante precum endocitoza receptorilor și traficul vezicular . Acidificarea endosomilor de către V-ATPază este crucială pentru internalizarea endocitică a complexelor de liganzi ai receptorilor. În urma inițierii semnalizării, pH-ul scăzut din endosomi eliberează ligandul, reciclându-l către membrana plasmatică . În lizozomi, V-ATPazele contribuie la menținerea pH-ului scăzut de 4,5 și sunt, de asemenea, importante pentru transportul hidrolazelor acide nou sintetizate de la Golgi la lizozomi. Mai mult, fagosomii și autofagosomii din macrofage și, respectiv, celulele tumorale, depind, de asemenea, de pH-ul acid menținut de V-ATPază pentru activitatea enzimelor de degradare din aceste compartimente .

Golgi

Sortarea mașinăriei exocitice și endocitice începe la nivelul complexului Golgi. Este important faptul că majoritatea proteinelor sunt supuse glicozilării, o modificare posttranslațională crucială în cadrul aparatului golgi . Mutațiile în subunitatea a2 a V-ATPazei au ca rezultat cutis laxa, un sindrom autozomal recesiv al pielii ridate în care se observă o glicozilare deficitară a proteinelor din matricea extracelulară . Deși V-ATPază a fost corelată genetic cu defectul de glicozilare, relația exactă dintre acidificarea golgi și maturizarea proteinelor nu a fost explorată.

Vesicule specializate

V-ATPază este o proteină majoră exprimată în compartimente specializate ale unor tipuri de celule specifice. În timpul neurotransmisiei, V-ATPază asigură forța motrice protonică crucială necesară pentru formarea veziculelor sinaptice și acumularea ulterioară de neurotransmițători . În celulele pancreatice, acidificarea dependentă de V-ATPază este importantă pentru exocitoza insulinei . V-ATPasa guvernează, de asemenea, echilibrul fisiune-fuziune al sistemului vezicular prin interacțiunea cu receptorul proteinei de atașare NSF solubilă (SNARE) și cu GTPaza .

Acidificarea luminoasă

V-ATPazele au fost inițial identificate pe veziculele intracelulare, dar importanța V-ATPazelor din membrana plasmatică a crescut enorm . În celulele epiteliale ale tubulului proximal al rinichiului, izoforma a4 a V-ATPazei menține echilibrul bazelor acide și acidificarea urinei (acidoză sistemică) . În mod similar, în celulele clare ale epididimului, membrana plasmatică V-ATPază acidifică compartimentul luminal și ajută la maturarea și stocarea spermatozoizilor . În osteoclastele osoase, V-ATPază lizozomală se translocă în membrana plasmatică în timpul resorbției osoase pentru a acidifica lacunele . V-ATPpaza plasmalemală este esențială pentru funcționarea celulelor interdentare ale urechii, a celulelor epiteliale ale nasului și a vederii . Disfuncția V-ATPazei este asociată cu stări patologice precum acidoza tubulară renală, surditatea, afectarea simțului olfactiv și osteoporoza O schemă care prezintă rolul V-ATPazei în acidificarea veziculară și luminală este prezentată în Fig. 1.

Rolul în cancere

Recent, V-ATPasa membranei plasmatice a fost studiată pe larg în cancer, unde ajută la menținerea unui mediu intracelular alcalin favorabil creșterii și a unui mediu extracelular acid favorabil invaziei . În tumori, s-a demonstrat că expresia V-ATPazei este mai mare spre marginea anterioară a celulelor canceroase proliferante din cancerul de sân, de prostată, pulmonar, ovarian, hepatic, pancreatic, melanom și esofagian . În mod specific, celulele canceroase mamare exprimă V-ATPază pe membrana plasmatică pentru a acidifica spațiul extracelular, iar expresia cantitativă a V-ATPazei se corelează cu invazivitatea și potențialul metastatic al liniei celulare . Contribuția exactă a V-ATPazei la creșterea tumorii se realizează prin influența sa asupra mecanismelor/căilor moleculare discutate mai jos.

Imunomodularea

Izoforma a2 a ATPazei vacuolare (VOa2 sau a2V) are un rol imunomodulator în sarcină și cancer. Studiile care implică a2V în biologia reproducerii au scos la iveală un rol necunoscut până acum pentru această moleculă în maturarea și producerea normală a spermatozoizilor, în plus față de implantarea embrionară . În micro-mediul tumoral, domeniul terminal N al a2V polarizează macrofagele în macrofagele asociate tumorii (tip M2) și stimulează diferite subseturi de monocite prin intermediul căii de endocitoză . În urma acestor constatări, s-a demonstrat în continuare că deficitul de a2V în celulele tumorale modifică populația de macrofage rezidente în micro-mediul tumoral și afectează creșterea tumorală in vivo . a2V este exprimat pe granulele primare ale neutrofilelor și ajută la menținerea pH-ului în calea exocitară în timpul activării neutrofilelor . Tratamentul neutrofilelor umane cu peptidul N terminal recombinant al a2V (a2NTD) a favorizat migrarea și polarizarea neutrofilelor . Împreună, aceste studii evidențiază rolul imunomodulator al V-ATPazei în declanșarea unor răspunsuri imune puternice.

Efectul Warburg

Un semn distinctiv al cancerului este efectul Warburg în care celulele trec de la fosforilarea oxidativă la glicoliza aerobă . Mai multe studii indică ipoteza că celulele canceroase depind de V-ATPază mai mult decât orice alt regulator de pH, cum ar fi schimbătorii de Na+H+, transportatorii de bicarbonat și simporatorii proton-lactat pentru a obține pH-ul intracelular alcalin favorabil și pH-ul extracelular acid . Alcalinizarea citosolului activează glicoliza, suprimând în același timp fosforilarea oxidativă . Mai mult, unele oncogene legate de glicoliză, cum ar fi Hypoxia Induced Factor (HIF-1), sunt reglementate de modificarea pH-ului indusă de V-ATPază .

Proteaze acide

Consecința acidificării extracelulare în tumori este activarea proteazelor acide, care sunt enzime care clivează matricea extracelulară în timpul invaziei tumorale. Aceste enzime aparțin clasei proteinazelor acide precum catepsinele , Matrix Metallo Proteinazele (MMP) și gelatinazele și sunt active la pH acid . Mai mult, activitatea enzimelor intracelulare, cum ar fi γ-secretaza, care sunt active la pH acid, este, de asemenea, îmbunătățită odată cu creșterea activității V-ATPazei în vezicule . Ulterior, acest lucru duce la dereglarea căilor oncogene cum ar fi Notch.

Rezistența la medicamente și inhibitorii V-ATPazei

Ph-ul modificat al micro-mediului tumoral poate influența sensibilitatea la medicamentele chimioterapeutice . Antraciclinele și alcaloizii au un pKa de 7-8 și sunt internalizați în compartimentul endosomal . Datele recente sugerează că utilizarea inhibitorilor V-ATPazei nu numai că provoacă modificări ale pH-ului citosolic care duc la moartea celulelor, ci și îmbunătățește absorbția medicamentelor, devenind astfel o componentă eficientă a tratamentului combinatoriu împotriva cancerului. În cazul cancerului ovarian, a2V este exprimată pe marginea de atac a celulelor canceroase și modulează activitatea MMP9. Mai mult, a2V contribuie la rezistența la medicamente mediată de cisplatin în cancerul ovarian, iar inhibarea selectivă a a2V ar putea fi o strategie eficientă pentru tratarea cancerului ovarian rezistent la chimioterapie. Inhibitorii V-ATPazei, bafilomicina și concanamicina, aparțin unei clase de pleomacrolide care vizează sectorul VO și inhibă eficient activitatea V-ATPazei. Recent, s-a raportat că apicularenii și arhazolidele sunt inhibitori puternici și specifici ai V-ATPazei . Cu toate acestea, toți inhibitorii cu molecule mici disponibili au o toxicitate semnificativă, având în vedere implicarea V-ATPazei în fiziologia celulară normală . Prin urmare, dezvoltarea de anticorpi neutralizanți specifici împotriva izoformei subunității „a”, care are o expresie specifică celulelor, ar putea fi o alternativă eficientă pentru a provoca o inhibiție directă a V-ATPazei, abordând în același timp și rezistența la mai multe medicamente în mod indirect prin utilizarea combinatorie .

Autofagia

Autofagia este procesul de degradare selectivă sau de reciclare a încărcăturilor livrate de autofagosomi către lizozomi . Celulele tumorale prezintă o dependență variată de autofagie pe măsură ce progresează de la tumora primară la tumora solidă puternic metastatică . Încărcătura celulară marcată pentru degradare este livrată către lizozomi prin procese autofagice. Activitatea de pompare a protonilor de către V-ATPază este responsabilă pentru activarea hidrolazelor acide lizozomiale care degradează încărcătura preluată de autofagozomi . Deși studiile indică faptul că autofagia necesită o V-ATPază funcțională, iar inhibitorul V-ATPază, Bafilomicina, este utilizat ca inhibitor clasic al autofagiei, rolul exact al V-ATPazei în dinamica membranară a fluxului autofagic nu este înțeles. Un studiu recent a raportat că tratamentul cu Bafilomicină, care inhibă atât activitatea V-ATPazei, cât și a pompei de Ca2+ și a pompei SERCA, a dus la blocarea fluxului autofagic, în timp ce lizozomii cu deficit de V-ATPază erau încă capabili să fuzioneze cu autofagozomii . Aceste rezultate sugerează implicarea V_ATPazei în degradarea încărcăturii autofagice în lizozomi decât în fluxul autofagic și evidențiază necesitatea dezvoltării unor inhibitori specifici și a unor tehnici de manipulare genetică pentru a studia rolul exact al V-ATPazei în diferite procese celulare importante.

Semnalizare

Calea endolizozomală este importantă atât pentru reglarea pozitivă cât și negativă a căilor de semnalizare . Primul raport cunoscut de implicare a V-ATPazei în semnalizare a provenit dintr-un studiu care a arătat că inhibarea V-ATPazei prin Bafilomicină a afectat internalizarea EGFR . De atunci, V-ATPasa a fost asociată cu transducția de semnal asociată cu m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β și reglarea semnalizării Notch.

Semnalizarea Notch

Poate cea mai bine studiată cale de semnalizare reglată de V-ATPasa este Notch. Acest lucru poate fi atribuit faptului că semnalizarea Notch depinde de calea endolizozomală pentru activarea, menținerea și degradarea mediatorilor cheie ai căii . V-ATPasa menține echilibrul pH-ului celular și joacă un rol important în endocitoză, activarea proteazei și degradarea proteinelor. În mod specific, a2V (subunitatea V-ATPază – VOa2) a fost localizată anterior în endosomii timpurii – locul de endocitoză a receptorilor . În urma legării ligandului, receptorul Notch ia calea endocitică și este scindat de proteaze pentru activare. Ulterior, receptorii sunt degradați în lizozom . La Drososphila, mutațiile în Vps25, o componentă a mașinăriei ESCRT care reglează sortarea endosomală a receptorilor de semnalizare, determină acumularea receptorului Notch în endosomi și îmbunătățește semnalizarea Notch . Într-un studiu care a analizat mutațiile Hrs din drosophila, o altă componentă a ESCRT, Notch se acumulează în endosomi, dar nu determină activarea ectopică a semnalizării Notch . Pierderea autofagiei duce la activarea semnalizării Notch în celulele foliculului ovarian din Drosophila datorită întreruperii degradării Notch. Contrar acestor rapoarte, un studiu independent a constatat că mutațiile în Rabconnection-3 perturbă activitatea de pompare a protonului de către V-ATPază și acumulează Notch în endosomii tardivi după clivarea S2, reducând astfel semnalizarea Notch în Drosophila și în celulele de mamifere . Aceste constatări au fost urmate de rapoarte la Drosophila indicând în continuare că, prin acidificarea căii endolizozomiale, V-ATPasa este necesară pentru activarea Notch în endosomi, precum și pentru degradarea Notch în lizozomi . În timpul dezvoltării mamiferelor, exprimarea unei subunități dominante negative a V-ATPazei în precursorii neuronali a redus semnalizarea Notch și a epuizat celulele stem neuronale, ducând la diferențierea neuronală . Recent, studiile asupra astrocitelor din retina șobolanilor cu mutație Nuc1 au arătat că acestea dereglează semnalizarea Notch. Reducerea semnalizării Notch s-a datorat mutării βA3/A1-cristalinului, care reglează activitatea V-ATPazei, ceea ce duce la o acidificare endosomală deficitară și la activitatea γ-secretazei, afectând astfel rata de procesare a receptorului Notch . Aceasta este o constatare interesantă având în vedere că rolul V-ATPazei în viziune este acum în curs de apariție . Împreună, aceste constatări indică faptul că reglarea semnalizării Notch de către V-ATPază poate avea rezultate atât pozitive, cât și negative, în funcție de localizarea celulară a activității V-ATPază afectate (endosomi vs. lizozomi) și de dependența procesării receptorilor Notch de calea endosomală . Cu toate că interacțiunea dintre V-ATPază și Notch a fost investigată în contextul acidificării endolizozomale dependente de V-ATPază care afectează semnalizarea Notch, un raport recent sugerează că reglementarea ar putea fi, de asemenea, inversă. În mod specific, autorii sugerează că Presinilin1 (PS1), o componentă a complexului enzimatic γ-secretază responsabil pentru scindarea receptorului Notch și a peptidei β-amiloide, interacționează fizic cu izoforma VOa1 a V-ATPazei și o direcționează din reticulul endoplasmatic către lizozomi . Studiile noastre au identificat faptul că V-ATPază reglează semnalizarea Notch în cancerul mamar și în dezvoltarea glandei mamare . a2V este exprimată pe suprafața celulelor epiteliale mamare proliferante și a celulelor cancerului mamar triplu negativ (TNBC), indicând rolul său în proliferarea celulară în timpul dezvoltării normale și al bolii. În TNBC, inhibarea a2V îmbunătățește semnalizarea Notch prin blocarea degradării lizozomale și autofagice a receptorului Notch . Pierderea a2V în glanda mamară de șoarece duce la o activare anormală a Notch și afectează morfogeneza ductală, provocând defecte de lactație . Semnalarea Notch este activată în timpul travaliului prematur indus de infecția cu PGN + poli (I:C), ceea ce duce la creșterea răspunsurilor proinflamatorii, iar inhibarea sa îmbunătățește supraviețuirea in-utero a fetușilor vii. Mai mult, în travaliul prematur indus de răspunsul inflamator la injecția de LPS, s-a observat o reglare în sus a inflamației legate de Notch și o reglare în jos a factorilor de angiogeneză . În ambele modele de infecție și de travaliu prematur inflamator, am reușit să salvăm fenotipul prin tratarea cu inhibitori de γ-secretază (GSI) . Acest lucru deschide calea pentru o direcție viitoare importantă, mai ales că GSI este un inhibitor eficient al semnalizării Notch și se află în prezent în studii clinice pentru mai multe tipuri de cancer. Prin urmare, se pare că interacțiunea dintre V-ATPază și Notch este importantă în timpul dezvoltării normale și în boli precum Alzheimers și diverse tipuri de cancer.

Semnalizarea Wnt

Calea de semnalizare Wnt joacă un rol major în menținerea, polaritatea și diferențierea celulelor și țesuturilor. La om, dereglarea semnalizării Wnt a fost implicată în cancer . Un exemplu clasic de dereglare a semnalizării Wnt este cancerul colorectal, în care pierderea Adenomatous Polyposis Coli (APC), un regulator negativ al semnalizării Wnt, declanșează tumorigeneza . În timpul semnalizării, liganzii Wnt acționează asupra celulelor țintă prin legarea la Frizzed, Fz și LRP (lipoproteina de joasă densitate), un complex de receptori de suprafață celulară care duce la dezasamblarea Glicogen Sintetazei Kina (GSK-3) și eliberarea ulterioară a β-cateninei. β-catenina este principalul mediator din aval al căii Wnt, care a activat genele oncogene țintă Wnt, cum ar fi c myc și cyclinD1 . Receptorul (P) RR, Pro Renin Receptor, numit și ATP6ap2, acționează ca o moleculă adaptoare între V-ATPază și complexul receptor Wnt LRP 5/6 . La Xenopus și Drosophila, s-a demonstrat că V-ATPasa interacționează cu complexul de receptori LRP 5/6 și că atât eliminarea genetică, cât și inhibarea farmacologică a V-ATPasei interferează cu transducția semnalului și reduc semnificativ răspunsul celular la semnalizarea Wnt . Mai mult, s-a demonstrat că V-ATPază reglează indirect mediatorul de semnalizare Wnt β-catenin și mediatorul Notch NICD prin autofagie.

Semnalizare TSF-β

Mutațiile în gena a2V cauzează sindromul Autosomal recesiv Cutis Laxa (ACL), în care pacienții prezintă o cantitate scăzută de proteine matriciale extracelulare, cum ar fi colagenul, rezultând un fenotip de piele ridată. În sprijinul acestor constatări, o investigație mecanică a mutațiilor responsabile de cutis laxa la om a identificat mutația a2P405L ca fiind instabilă și defectuoasă în traficul golgi în comparație cu tipul sălbatic. Mai mult, rapoartele indică un defect de glicozilare în ACL care are ca rezultat o promovare ridicată a semnalizării factorului de creștere transformant-beta (TGF-β) la acești pacienți cu mutații a2V . V-ATPasa promovează tranziția epitelială-mesenchimală indusă de TGF-β a celulelor epiteliale tubulare proximale de șobolan . În plus față de efectul său asupra semnalizării Notch, inhibarea a2V a activat calea Wnt în TNBC și calea TGF-β în celulele epiteliale mamare . Acest lucru sugerează că rolul a2V în modularea mediatorilor de semnalizare nu este exclusiv Notch. Mai mult, acești șoareci au prezentat, de asemenea, o reducere a colagenului total din cauza glicozilării deficitare .

Semnalizare mTOR

În semnalizarea mTOR, serin treonină kinaza mTOR și alte componente ale complexului mTOR 1 (mTORC1) detectează disponibilitatea aminoacizilor stresul celular și modulează creșterea .La stimularea cu aminoacizi, V-ATPază activează activitatea factorului de schimb de guanină (GEF) al Ragulator față de RagA, care la rândul său promovează hidroliza GTP a RagC . RagA legat de GTP și RagC încărcat cu GDP recrutează împreună mTORC1 la suprafața lizozomală . Activarea mTORC1 răspunde la semnalizarea factorului de creștere și controlează comutarea regulatoare de la moartea celulară la proliferare . Un raport recent a sugerat implicarea regulatorului pompei de protoni a osteoclastelor Atp6v1c1 în creșterea creșterii cancerului de sân prin activarea căii mTORC1 și a metastazelor osoase prin creșterea activității V-ATPazei .

.