Alai

Un scurt istoric al T. reesei

Practicile biotehnologice cele mai vechi care implică ciuperci pentru producerea berii, vinului și brânzei ar putea să dateze de câteva milenii, adică chiar de la începutul civilizației literare. În schimb, descoperirea ascomicetei mezofile filamentoase Trichoderma reesei (apoi Trichoderma viride) pentru potențialul său uimitor de a produce celuloză extracelulară a avut loc cu puțin peste 70 de ani în urmă. Inițial, potențialul distructiv al Trichoderma sp. original, izolat din echipamente putrezite ale armatei americane în Insulele Solomon în timpul celui de-al Doilea Război Mondial, a fost considerat destul de problematic. Cu toate acestea, nu a trecut mult timp până când cercetătorii de la Natick Army Research Laboratories, conduși de Mary Mandels și Elwyn T. Reese, cercetătorul care i-a dat numele, au căutat să transforme acest potențial problematic în produse intenționate . În cadrul unei examinări a 14.000 de mucegaiuri din colecția Quartermaster, Trichoderma sp. QM6a a demonstrat o capacitate remarcabilă de a degrada celuloza cristalină nativă. A rămas denumirea „QM6a” pentru ultimul izolat original de Trichoderma rămas, care l-a identificat ca fiind a șasea din cele șase culturi ale ciupercii stocate la Quartermaster Collection din Natick. Această tulpină particulară nu numai că este considerată tulpina de referință a T. reesei, dar este, de asemenea, singura tulpină din care au fost derivate toate mutantele utilizate astăzi în industrie.

Atunci și acum, cercetarea asupra T. reesei a fost propulsată de ideea că celulozele secretate de aceasta ar putea avea un impact care să schimbe jocul în lupta de 200 de ani pentru a produce în mod economic combustibili din biomasa lignocelulozică regenerabilă . De atunci, cercetarea T. reesei a fost un pionier al conceptului de sacarificare enzimatică a celulozei printr-o combinație sinergică a diferitelor activități celulozice și a pus bazele înțelegerii noastre actuale a reglementării enzimelor implicate . Principala sa cellobiohidrolază CBH1 (CEL7a) a fost, de asemenea, prima celulază eucariotă care a fost clonată și prima celulază a cărei structură a fost rezolvată . Un pas important către aplicarea industrială a celulozei T. reesei a fost dezvoltarea unor proceduri eficiente de mutageneză a tulpinii și de screening în anii 1970. În următoarele două decenii, titrul de proteină extracelulară produsă de tulpina originală QM6a a putut fi mărit de până la 20 de ori prin programe de mutageneză la Natick și Rutgers University. Acesta din urmă a culminat cu izolarea tulpinii RUT-C30 (unde „RUT” vine de la Rutgers). Deși standardul de aur pentru producția de celuloză în industrie a fost raportat ca fiind mai mare de 100 g/L, această tulpină este încă prototipul hiperproducătorului de celuloză disponibil în domeniul public, cu titruri de proteină extracelulară care ating 30 g/L pe lactoza ca substrat inductor de celuloză.

La început, însă, au fost dezvoltate și alte aplicații comerciale pentru celuloză, deoarece a devenit clar că sacarificarea eficientă și completă a biomasei lignocelulozice în zaharuri fermentabile necesită mult mai multe activități enzimatice decât se anticipase inițial. Din nou, cercetările în care a fost implicat T. reesei au continuat să deschidă noi drumuri în enzimologia degradării celulozei și hemicelulozei și continuă să o facă și astăzi. Microscopia de forță atomică de mare viteză a vizualizat acum, de asemenea, degradarea celulozei, demonstrând modul în care principala cellobiohidrolază CBH1/CEL7A alunecă unidirecțional de-a lungul suprafeței celulozei . La începutul anilor 1990, au devenit disponibile tehnici de transformare care facilitează ingineria genetică a T. reesei . Pe parcursul deceniului următor, aceste tehnologii au contribuit la obținerea de noi informații despre reglarea enzimelor sale și la modificarea profilului enzimatic secretat de ciupercă . La acea vreme, T. reesei a fost, de asemenea, printre primele gazde pentru exprimarea proteinelor de mamifere, așa cum a fost exemplificat prin exprimarea chimozinei de vițel sub semnalele de expresie cbh1 (cel7a) .

Până la sfârșitul anilor 1990, Kuhls et al. au descoperit că Hypocrea jecorina este, de fapt, forma sexuală a T. reesei, motiv pentru care o serie de publicații ulterioare au folosit H. jecorina ca nume de specie în loc de T. reesei. Un studiu mai detaliat asupra dezvoltării sexuale a condus la ipoteza că tulpina QM6a este, de fapt, sterilă din punct de vedere feminin, ceea ce ar putea fi ulterior legat de o mutație în gena ham5 care codifică scheletul MAP-kinazei.

La începutul mileniului, care, în cazul geneticii, poate fi privit ca o întoarcere de la studiul genelor și căilor izolate către studiul genomurilor întregi, a văzut sosirea T. reesei în așa-numita eră genomică. Prima abordare globală pentru a studia expresia genetică a T. reesei în 2003 a fost un studiu transcriptomic realizat de Foreman și colab. , care au construit microplăci de ADN bazate pe ADNc care corespundeau la peste 5 000 de transcripte diferite din genomul T. reesei. Cinci ani mai târziu, secvențierea și analiza genomului izolatului original de T. reesei QM6a a pus bazele aplicării pe scară largă a studiilor la nivel de genom. În anii următori, analiza genomică comparativă a unui număr de tulpini hiperproducătoare și neproducătoare de celuloză a dus la descoperirea unor noi factori potențiali implicați în hiperproducția de celuloză, cum ar fi transportul nucleocitoplasmatic, traficul proteic vacuolar și rotația ARNm. Aceste analize comparative au beneficiat de faptul că toate tulpinile de T. reesei utilizate în mediul academic și în industrie sunt derivate din tulpina QM6a. La șaizeci și cinci de ani de la studiile inițiale ale lui Elwyn Reesei privind degradarea celulozei de către T. reesei , capacitatea de producție de biocombustibil celulozic instalată la nivel mondial este în prezent de 480,5 milioane de litri pe an (MMLY) de etanol, din care 380,5 MMLY (sau aproximativ 80 %) sunt produse utilizând formulări enzimatice T. reesei, cum ar fi Accellerase și Cellic (Fig. 1a). Fără îndoială, acest efort a necesitat o maturizare a tehnologiei de bază la mai multe niveluri, inclusiv ingineria procesului și pretratarea substratului. Cu toate acestea, producția și optimizarea formulărilor enzimatice pentru etapa de sacarificare a biomasei a fost și rămâne unul dintre factorii cheie care determină performanța costurilor proceselor de obținere a etanolului celulozic . În plus, producția de enzime cu ajutorul T. reesei nu se limitează în niciun caz la producția de enzime de biorafinare. De fapt, aproximativ 11 % din toate formulele enzimatice tehnice înregistrate de Asociația producătorilor și formulatorilor de produse enzimatice sunt produse folosind T. reesei ca gazdă de expresie (Fig. 1b, c). Nu în ultimul rând, T. reesei își menține în continuare importanța în cercetare, exemplificată de peste 100 de articole de cercetare care tratează ciuperca sau enzimele sale publicate în fiecare an (Fig. 1d).

The T. reesei biomass enzyme mix: new insights and limitations

În natură, deconstrucția lignocelulozei este rareori realizată de un singur organism. Ea se realizează mai degrabă prin ordinea secvențială și efortul colectiv al mai multor organisme care produc mai multe enzime active pe bază de carbohidrați (CAZime) pentru a degrada diferiți polimeri. Prin urmare, nu este surprinzător faptul că amestecul de cellaze secretate de T. reesei a trebuit să fie adaptat în mod semnificativ pentru a oferi o formulare enzimatică competitivă din punct de vedere al costurilor pentru o sacarificare completă a lignocelulozei. La început, cercetătorii și-au dat seama că formulările de T. reesei nu aveau suficientă activitate β-glucozidazică, deoarece cea mai mare parte a activității este legată de peretele celular al ciupercii. În consecință, creșterea activității β-glucozidazei a îmbunătățit degradarea celulozei, deoarece contracarează inhibarea produsului prin intermediul cellobiozei, care, la rândul său, este eliberată prin acțiunea cooperantă a endoglucanazelor și a cellobiohidrolazelor . În caz contrar, acest mecanism de reacție încetinește serios sacarificarea celulozei. De asemenea, xilo- și mannooligozaharidele derivate din hemiceluloză inhibă cellobiohidrolazele din T. reesei, ceea ce indică în mod clar faptul că sunt necesare activități suficiente de β-xilozidază și β-mannosidază pentru a degrada eficient lignoceluloza. În 2003, Foreman et al. au descris două proteine care sunt coinduși cu celulozele majore și le-au numit proteinele 1 și 2 induse de celuloză (CIP1 și CIP2). De atunci, s-a demonstrat că acestea sunt importante pentru degradarea eficientă a lignocelulozei . Rezultatele recente arată că CIP1 are asemănări structurale cu lipazele, deși nu a putut fi demonstrată activitatea de lipază, și că CIP2 este o glucuronoylesterază din familia CE15 . O altă proteină secretată importantă este swollenina SWO1, care conține un modul de legare a carbohidraților (CBM) legat de un domeniu asemănător expansinei . În ciuda activității de întrerupere a celulozei, SWO1 îmbunătățește sinergic activitatea endoxilanazei, mai degrabă decât a endoglucanazei sau a cellobiohidrolazei, în timpul hidrolizei enzimatice a trestiei de porumb pretratate. Un mod de acțiune propus este acela că face ca porțiunea de xilan din lignoceluloză să fie mai accesibilă pentru degradarea de către xilanaze și, astfel, promovează indirect acțiunea celulozelor. Se poate spune că cea mai mare revoluție din ultimii ani în domeniul degradării celulozei a fost descoperirea monooxigenazelor polizaharidice litice (LPMO). Aceste enzime au introdus un nou mecanism oxidativ de degradare a polizaharidelor. În degradarea celulozei, se presupune că LPMO acționează la suprafața fibrilelor cristaline de celuloză, făcându-le astfel mai accesibile celulozelor . În mod curios, aceste enzime pot obține electronii necesari pentru acest proces de la lignina din peretele celular al plantei prin transfer de electroni pe distanțe lungi, întorcând astfel mecanismele de apărare ale plantei împotriva acesteia . Alternativ, oxidoreductazele GMC sau cellobioza dehidrogenazele pot funcționa ca donatori de electroni . Această constatare ar putea explica foarte bine modul în care T. reesei își alimentează LPMO-urile, deoarece s-a demonstrat anterior că mai multe astfel de GMC oxidoreductaze sunt într-adevăr induse de paiele de grâu . Cu toate acestea, acest mecanism oxidativ nu se limitează în niciun caz la depolimerizarea celulozei. Demonstrat inițial pentru chitină , LPMOs joacă, de asemenea, un rol în degradarea xiloglucanului și a amilozei . În baza de date CAZy, enzimele aparținând acestui grup au fost reclasificate la „activități auxiliare” (AA), spre deosebire de clasificarea lor anterioară ca hidrolaze glicozidice (de exemplu, GH61) și se regăsesc în familiile AA 9-11 și 13 . După cum s-a subliniat anterior, activitățile hemicelulitice sunt importante pentru sacarificarea completă a lignocelulozei (analizate de Harris și colab. ). Sunt necesare cantități diferite de activități individuale în funcție de tipurile de hemiceluloză prezente în substrat . Prin urmare, este demn de remarcat faptul că repertoriul enzimatic al T. reesei are unele limitări clare pentru anumite tipuri de legături specifice hemicelulozei. Una dintre aceste activități care lipsește este α-xilozidaza. Adăugarea de α-xilozidază la o formulă enzimatică comercială de T. reesei a îmbunătățit eliberarea de xiloză și glucoză din stopul de porumb pretratat. În mod similar, adăugarea unei celulaze din familia GH 5 cu activitate împotriva glucomananului și xilanului a îmbunătățit semnificativ un preparat enzimatic sintetic de T. reesei . Alte activități care sunt absente sau foarte limitate în amestecul de celuloză T. reesei includ endoarabinaza și mai multe activități pectinazice . Suplimentarea amestecurilor de cellaze comerciale cu aceste activități enzimatice a îmbunătățit în consecință sacarificarea diferitelor substraturi . O altă întrebare la care nu s-a răspuns încă este funcția in vivo a oxidazelor multicopperice secretate asemănătoare lacazei, codificate în genomul T. reesei.

Îmbunătățirea T. reesei ca gazdă pentru producția de proteine

După faptul că celulozele și majoritatea celorlalte enzime de degradare a lignocelulozei sunt exprimate în mod coordonat și condiționat, reglarea transcripțională a acestora reprezintă o țintă logică de inginerie pentru îmbunătățirea producției de celuloză de către ciupercă. Unul dintre regulatorii principali este factorul de transcripție de tip C2H2 CRE1, care mediază reprimarea catabolitelor de carbon. CRE1 oprește transcrierea genelor sale țintă atunci când sunt prezente surse de carbon mai favorabile, cum ar fi glucoza. Trunchierea acestuia este una dintre principalele cauze ale îmbunătățirii producției de cellază obținute prin programe de mutageneză aleatorie a T. reesei QM6a, care au condus la tulpina RUT-C30, care prezintă atât un nivel bazal mai ridicat, cât și un nivel indus de producție de cellază. În mod similar, înlocuirea motivelor de legare CRE1 din regiunea promotoare a cellobiohidrolazei majore cel7a cu cele ale unui activator cunoscut al cellazei reduce reprimarea catabolitului de carbon și crește transcrierea cel7a în condiții de activare și de reprimare . În plus, transcrierea cellazei, a xilanazei și a unui număr de alte gene care codifică enzimele implicate în degradarea lignocelulozei depinde strict de activatorul transcripțional de tip Zn(II)2Cys6 XYR1 . Acest lucru este în contrast cu alte ciuperci, inclusiv Sordariomicetele Neurospora crassa și Fusarium fujikuroi, unde ortologul XYR1 modulează exclusiv expresia genei xilanazei . S-a constatat că o mutație care duce la o formă trunchiată a XYR1 provoacă fenotipul negativ la cellază al tulpinii QM9136, care provine din programul de mutageneză de la Natick. În consecință, mutanții supraproducători și hiperproducători de celuloză au niveluri ridicate de ARNm pentru activatorii transcripționali xyr1 . S-a dovedit, de asemenea, că supraexprimarea XYR1 duce la o expresie mai mare a celulozelor și abolește reprimarea cataboliților acestora în prezența glucozei . Mai mult, o mutație punctiformă în cadrul unei regiuni de reglementare putative a XYR1 duce la un model de expresie la fel de dereglementat . Pe lângă XYR1 și CRE1, trei factori de transcripție ACE1, ACE2 și ACE3 reglează expresia celulozei și a xilanazei în T. reesei . În mod similar cu CRE1, ACE1 este un represor C2H2 cu deget de zinc și, prin urmare, suprimarea sa îmbunătățește producția atât de celuloză, cât și de xilanază . ACE2 și ACE3, la fel ca XYR1, sunt activatori de transcripție de tip Zn(II)2Cys6 . Atunci când ace2 este absent, transcrierea celulozei și a xilanazei este redusă în mod corespunzător, deși inducerea celulozei de către soforoză aparent nu este afectată. Eliminarea ace3 abolește complet transcrierea cellazelor, dar o reduce doar pe cea a xilanazelor. În timp ce supraexprimarea ACE2 nu a fost încă încercată, supraexprimarea ACE3 duce la creșterea activităților ambelor tipuri de enzime, la fel ca și supraexprimarea altor șase regulatori necaracterizați până în prezent. Aceștia includ alți doi factori de transcripție de tip Zn(II)2Cys6, precum și două proteine WD40, o proteină cu bromodomain și o acetiltransferază legată de gcn5. Toți cei trei activatori de transcripție de tip Zn(II)2Cys6 (XYR1, ACE2 și ACE3) se aseamănă cu proteina Gal4 bine caracterizată din S. cerevisiae. Este bine stabilit faptul că Gal4 recrutează complexul SAGA care conține Gcn5 și, astfel, promovează transcrierea genelor sale țintă prin acetilarea histonelor și formarea eucromatinei. De fapt, ortologul Gcn5 din T. reesei este indispensabil pentru expresia celulozei și este implicat în acetilarea histonelor în promotorul cbh1. În ultimii ani, a apărut o imagine care arată că transcrierea celulozei și a CAZimelor înrudite din ciuperci este guvernată de o combinație de mulți factori de transcripție care reprezintă o rețea complexă de reglementare transcripțională influențată de activatori și represori care se contracarează. La Penicillium oxalicum, de exemplu, douăzeci de factori de transcripție modulează activarea sau reprimarea genelor celulozei. Printre aceștia, ClrB a fost identificat ca integrator cheie al tuturor celorlalți regulatori cu genele lor țintă. Homologii acestor regulatori se găsesc în T. reesei, dar, având în vedere diversitatea adaptărilor în reglarea peretelui celular al plantelor, este de așteptat ca alți regulatori diferiți să joace, de asemenea, un rol important. Un alt actor cheie în reglarea cellazei este ortologul din T. reesei al enigmaticului Aspergillus LaeA, care este implicat în reglarea grupurilor de gene de metaboliți secundari în diferite ciuperci . În timp ce deleția acestei proteine metiltransferază putativă duce la o puternică reducere a diferitelor gene ale cellazei și ale altor gene CAZyme, supraexprimarea sa poate promova puternic expresia acestora . Efecte similare au fost găsite pentru proteina VEL1 din complexul VELVET care interacționează cu LAE1 .

Majoritatea studiilor menționate mai sus oferă informații fundamentale despre reglarea formării celulozei. Deoarece majoritatea acestor studii au fost efectuate fie în izolatul original de T. reesei QM6a, fie în tulpina moderat supraproducătoare QM9414, rămâne neclar dacă și în ce măsură aceste efecte pot fi implementate în tulpinile hiperproducătoare. În aceste tulpini, procese cum ar fi traducerea, secreția și reînnoirea enzimelor secretate, mai degrabă decât transcripția, ar putea limita o creștere suplimentară a producției de cellază. Va fi interesant de văzut dacă mai multe dintre modalitățile raportate de îmbunătățire a expresiei genei cellazei pot fi suprapuse sau nu și cum ar funcționa astfel de tulpini în comparație cu hiperproducătorii obținuți prin mutageneză aleatorie.

Simpla intensificare a transcripției genei de interes nu duce întotdeauna la o mai bună formare a produsului, în special în cazul proteinelor care nu sunt fungice. O strategie de succes pentru a ocoli formarea scăzută a produsului este abordarea genei de fuziune care utilizează, pe lângă regiunea de promotor și terminator a unei gene puternic exprimate, și proteina codificată ca intensificator de expresie. În cazul T. reesei, aceasta este cellobiohidrolaza care codifică cel7A, care este cea mai puternic exprimată proteină în condiții de inducție a celulozei. Se crede că aceste fuziuni de gene cresc, în general, stabilitatea ARNm, importul în ER și trecerea prin calea secretorie. În acest scop, structura modulară a CEL7A, care constă într-un modul catalitic, un liant și un CBM, este adesea exploatată, înlocuind astfel CBM-ul C-terminal cu gena de interes. În prezent, sunt disponibile variații ale acestei abordări de fuziune a genelor, care direcționează proteina către ER pentru o pliere corectă, formarea punților disulfidice și glicozilarea, dar care, ulterior, urmăresc acumularea proteinei intracelulare pentru a evita degradarea produsului dorit de către proteazele extracelulare. O astfel de strategie utilizează hidrofobine cu un semnal de retenție ER atașat ca suport. Aceste proteine de fuziune se autoasamblează în structuri de tip micelă și pot fi purificate cu ajutorul unui sistem bifazic apos pe bază de agenți tensioactivi . O altă strategie de direcționare a proteinelor către ER utilizează peptida γ-zeină (ZERA) derivată din proteina de depozitare a porumbului. În mod analog, aceste proteine de fuziune care se autoasamblează formează corpuri proteice înconjurate de membrana ER care le protejează de proteoliză . Dezvoltarea ciupercilor ca gazde eficiente de producție pentru proteinele mamiferelor necesită, de asemenea, inactivarea proteazelor frecvent întâlnite în bulionul de fermentare. Într-un studiu sistematic au fost identificate diferite proteaze secretate legate de degradarea produselor biofarmaceutice, inclusiv anticorpi, interferon α 2b și factor de creștere asemănător insulinei, iar câteva dintre acestea au fost inactivate. Acest lucru a dus nu numai la o reducere drastică a activității proteazei, ci și la o creștere puternică a stabilității tuturor celor trei proteine recombinante, anticorpul prezentând cel mai pronunțat efect. Deși ingineria modelului de N-glicozilare pentru producerea de proteine terapeutice de mare valoare a fost încercată anterior, crearea unui model autentic de glicozilare umană într-o gazdă de expresie fungică nu pare fezabilă în acest moment. Prin urmare, este discutabil dacă astfel de produse biofarmaceutice vor fi produse de fabricile de celule fungice în viitor, mai ales având în vedere dezvoltarea rapidă a celulelor CHO .

Hidrofobinele menționate mai sus sunt un alt grup de proteine care au primit o atenție considerabilă datorită proprietăților lor tensioactive . Aceste proteine mici, extracelulare, se autoasamblează în straturi proteice la interfețele hidrofobe/hidrofile datorită proprietăților lor amfifile și fac suprafețele hidrofobe umectabile sau suprafețele hidrofile hidrofobe. Acestea au un potențial larg în aplicațiile alimentare și medicale pentru a dispersa materialele hidrofobe, a stabiliza spumele sau a direcționa diferite molecule către suprafețe. Cerato-plataninele sunt un alt grup de proteine mici, secretate, cu patru cisteine conservate. Acestea se leagă de oligozaharidele de chitină și N-acetilglucozamină și posedă proprietăți de autoasamblare la interfețele hidrofobe/hidrofile. Spre deosebire de hidrofobine, cerato-plataninele sporesc mai degrabă proprietățile de polaritate/apolaritate ale suprafețelor. O funcție de direcționare este, de asemenea, atribuită CBM-urilor prezente în diferite CAZime. Acestea pot îmbunătăți activitatea hidrolitică a domeniului catalitic de care sunt atașate și pot conduce la un pH și o temperatură optime mai favorabile . Proprietățile lor de legare a carbohidraților pot fi, de asemenea, exploatate pentru purificarea prin afinitate a proteinelor de fuziune folosind, de exemplu, coloane de celuloză . Gama largă de alte aplicații ale CBM-urilor recombinante a fost recent analizată în altă parte.

Trichoderma reesei pentru bioprocesare consolidată și cataliză cu celule întregi

Bioprocesarea consolidată (CBP) este înțeleasă în mod clasic ca fiind integrarea etapelor de producere a enzimelor celulozice, de hidroliză enzimatică și de fermentare a unui proces de producere a etanolului celulozic într-o singură operațiune. Prin urmare, ar fi de dorit un singur organism cu bune proprietăți celulolitice și cu o cale eficientă de fermentare a etanolului. Cu toate acestea, utilizarea consorțiilor microbiene a primit, de asemenea, o anumită atenție. Din nefericire, în prezent nu este disponibil niciun organism unic care să îndeplinească ambele cerințe (Fig. 2). În consecință, au fost depuse eforturi pentru a crea etanologeni care să devină celulolitici sau organisme celulolitice care să devină etanologene. În contextul primului scenariu, T. reesei a servit adesea drept donator de gene CAZyme, în special pentru cel5a și cel7b, care codifică două dintre endoglucanazele sale, și pentru cele două cellobiohidrolaze cel6a și cel7a (tabelul 1). În toate studiile publicate, capacitatea de secreție relativ scăzută a S. cerevisiae a limitat conversia substratului de către CAZimele CAZi heterologe secretate sau ancorate în membrană. Prin urmare, obținerea unor randamente ridicate de etanol cu substraturi celulozice realiste a necesitat suplimentarea cu cocktailuri enzimatice comerciale din T. reesei. Cu toate acestea, în timp ce eforturile de îmbunătățire a capacității de secreție și de afișare la suprafață a tulpinilor modificate de S. cerevisiae sunt în curs de desfășurare, tulpinile care afișează cellaze disponibile în prezent au deja potențialul de a conduce la reduceri substanțiale ale încărcăturilor enzimatice necesare pentru sacarificarea biomasei. În contextul celui de-al doilea scenariu, chiar T. reesei reprezintă un organism țintă promițător. Dar, deși această ciupercă posedă în mod natural capacitatea de a metaboliza toate zaharurile legate de biomasă și de a le transforma în etanol, randamentele sunt scăzute și se formează acid acetic ca produs secundar nedorit . Pe de altă parte, regimurile de fermentare la scară largă pentru T. reesei sunt bine stabilite datorită aplicării sale pe scară largă în producția comercială de enzime, iar instrumentele moleculare pentru ingineria sa genetică sunt, de asemenea, foarte bine dezvoltate . Una dintre marile provocări rămase în ceea ce privește utilizarea T. reesei ca organism CBP este faptul că mai multe dintre genele sale celulozice și glicolitice sunt reprimate de hipoxie , care este necesară pentru producția de etanol. În plus, reprimarea transcripțională a celulozelor în prezența etanolului reprezintă o altă provocare care trebuie depășită. Cu toate acestea, tulpina hiperproducătoare de cellaze RUT-C30 are o toleranță mai mare la etanol în comparație cu tulpina QM9414 din descendența Natick și, prin urmare, reprezintă o tulpină platformă perfectă pentru a dezvolta T. reesei ca organism CBP, mai ales că aceasta este, de asemenea, reprimată de cataboliții de carbon. Mai mult, în prezența unei paste lignocelulozice, RUT-C30 prezintă o morfologie asemănătoare unei pelete în timpul primelor etape ale fermentației, care poate fi obținută în mod independent de creștere prin adăugarea agentului tensioactiv Triton X-100 și care conduce apoi, de asemenea, la o producție mai mare de enzime. Acest lucru este important, deoarece, până în prezent, capacitatea slabă de amestecare și densitatea maximă scăzută a celulelor, ca urmare a creșterii filamentoase, au împiedicat utilizarea T. reesei ca organism CBP. În termeni mai generali, bioprocesarea consolidată ar putea fi utilizată și pentru a descrie alte procese integrate în care substratul nu este neapărat biomasa lignocelulozică, ci un alt biopolimer, cum ar fi chitina sau amidonul, iar produsul nu este etanolul, ci orice alt metabolit . În acest scop, o serie de studii recente au vizat supraproducția de diferiți metaboliți prin intermediul ingineriei de T. reesei (tabelul 2). Cu toate acestea, randamentele care au putut fi obținute au fost, în majoritatea cazurilor, departe de comercializare, necesitând, prin urmare, o optimizare suplimentară.

Unelte pentru proiectarea și ingineria celulară

În timp ce două recenzii cuprinzătoare privind setul de instrumente moleculare ale T. reesei și ale altor specii de Trichoderma au fost prezentate doar recent , dorim să le actualizăm cu cele mai recente progrese din domeniu. Ingineria selectivă a tulpinilor în vederea îmbunătățirii producției de celuloză sau a ingineriei metabolice necesită metode eficiente pentru a introduce modificări genetice dirijate în organism. Eficiența în general scăzută a direcționării genelor a reprezentat pentru mult timp o provocare majoră pentru obținerea unui număr rezonabil de transformanți prin integrarea omologă a unei casete de deleție sau de expresie. Această problemă a fost rezolvată, în principal, prin inactivarea unor componente ale căii de reparare a ADN, cum ar fi tku70 sau tmus53 . Tulpinile cu deleție Tku70 prezintă o mai bună direcționare a genelor, deși eficiența integrării omoloage în aceste tulpini poate varia în funcție de locusul vizat și, prin urmare, poate scădea până la 30 %. Pe baza acestei îmbunătățiri, au fost dezvoltate o serie de abordări noi pentru a insera casete de expresie într-o regiune genomică definită, evitându-se astfel efectele pleiotropice cauzate de integrarea lor aleatorie. Folosind un fond tku70, Jorgensen et al. au dezvoltat o platformă de expresie care utilizează locusul ade2, ușor de depistat, ca loc de integrare preferat. În urma integrării casetei de expresie în acest locus, ade2 este distrus, iar transformanții rezultați dezvoltă o pigmentare roșie distinctă. Într-un alt studiu, au fost aleși locii pyr4 și asl1 pentru a dezvolta o tulpină cu auxotrofie de uridină și l-arginină care permite integrarea dirijată la aceste locații. Ouaedraogo et al. au urmat o strategie diferită și au exprimat meganucleaza I-SceI din S. cerevisiae în T. reesei. I-SceI generează rupturi dublu-catenare artificiale la un situs de recunoaștere I-SceI care a fost introdus în prealabil la un locus predefinit și a îmbunătățit atât eficiența transformării, cât și a integrării omoloage. Într-un studiu de urmărire, rupturile dublu catenar mediate de I-SceI au fost combinate cu o deleție tku70 . În acest caz, incapacitatea de a repara rupturile de dublu catenar prin NHEJ favorizează integrarea casetei, ceea ce duce la randamente de recombinare omologă de până la 100 %. O revoluție pentru ingineria genetică sau editarea genomului a fost introdusă cu sistemul CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 . Subliniind atât necesitatea unei astfel de tehnologii, cât și importanța crescândă ca producător de enzime, acest sistem a fost testat pentru prima dată pentru ciupercile filamentoase în T. reesei . Acesta introduce rupturi specifice ale ADN-ului dublu catenar pentru a stimula direcționarea genelor și depinde numai de o nuclează Cas9 (asociată CRISPR) care utilizează un singur ARN ghid chimeric pentru direcționare. Direcționarea precisă a acestui Cas9 ghidat de ARN către o secvență specifică de ADN este realizată de secvența protospațială a ARN ghid prin intermediul unei simple împerecheri de baze. Utilizând regiuni flancate de 200 bp în amonte și în aval pentru construcția de deleție a genei, au putut fi atinse frecvențe HR mai mari de 90 %. Delețiile duble și triple au apărut la o frecvență de 45 % și, respectiv, 4 %, în urma unei singure runde de transformare. În timp ce în acest studiu, ARN-uri ghid transcrise in vitro au fost cotransformate cu caseta de deleție într-un T. reesei care exprimă Cas9, Nødvig și colab. au utilizat două secvențe ribozimetrice flancate pentru a elibera ARN-uri ghid dintr-un transcript mai mare care codifică, de asemenea, enzima Cas9 în diferite Aspergilli. Un alt instrument esențial necesar atât în exprimarea proteinelor recombinate, cât și în ingineria tulpinilor sunt promotorii care permit exprimarea genelor într-un mod controlabil. Deși sunt disponibili o serie de promotori inductibili și represibili cu diferite regiuni de promovare a celulozei, aceștia prezintă, de obicei, dezavantaje, deoarece expresia lor este legată de metabolismul gazdei, iar activatorii ar putea fi limitativi din cauza efectelor de titrare a promotorului. Printre alternativele utile se numără un set de gene T. reesei reprimabile cu l-metionină cu putere de expresie bazală diferită. S-a demonstrat că unul dintre acești promotori poate conduce expresia reprimabilă a diferitelor gene reporter pe mai multe surse de carbon, inclusiv paie de grâu. Într-un studiu similar, promotorul unei gene a permeazei de cupru din T. reesei a fost utilizat pentru a controla expresia principalului regulator al celulozei și hemicelulozei xyr1 în absența cuprului. Cu toate acestea, având în vedere faptul că enzimele care conțin cupru din familia AA 9 sunt componente importante ale amestecului de celuloză din T. reesei , este, totuși, îndoielnic dacă acest sistem poate fi aplicat într-un scenariu de producție de celuloză.

În afară de aceste instrumente moleculare interesante, sunt acum disponibile și unele trucuri mai vechi din genetica clasică. Dezvoltarea tulpinilor de T. reesei a fost mult timp împiedicată de faptul că se credea că ciuperca este asexuată, împiedicând încrucișarea tulpinilor. O piatră de hotar în această privință a fost descoperirea faptului că QM6a are un locus MAT1-2 de tip de împerechere și poate fi ușor de încrucișat cu anumite izolate T. reesei de tip sălbatic MAT1-1 . Dar atunci când locusul MAT1-2 din QM6a a fost înlocuit cu omologul său MAT1-1, nu s-a format nicio stromata la confruntarea cu tulpina originală MAT1-2 QM6a. În consecință, a fost imposibil să se exploateze împerecherea pentru ingineria tulpinilor în diferitele tulpini academice și industriale de T. reesei derivate din QM6a. Cu ajutorul unei abordări biologice sistemice, gena lipsă responsabilă de sterilitatea feminină a fost identificată ca fiind ham5 . La N. crassa, ham-5 codifică pentru o proteină care servește ca o schelă de MAP kinază în timpul fuziunii celulare. Reintroducerea unei ham5 funcționale restabilește formarea stromei în tulpina QM6a și permite restabilirea fertilității feminine în alte tulpini provenite din medii QM6a. Această constatare este deosebit de importantă, deoarece încrucișarea cu izolatele de H. jecorina menționate mai sus poate duce la descendenți aneuploizi segmentari . Cu acest instrument la îndemână, se pun bazele pentru identificarea mutațiilor relevante care duc, de exemplu, la hiperproducția de celuloză. Acest lucru este important, deoarece abordările tradiționale de completare pentru identificarea genei (genelor) care cauzează fenotipuri mutante au fost în mare parte nereușite la specii precum T. reesei. Și, deși secvențierea de mare randament și analiza comparativă a genomului pot identifica cu ușurință mutațiile în linia de tulpini QM6a de hiperproducători și nuliproducători de celuloză, numai în câteva cazuri acest lucru a dus deja la stabilirea unei legături între o mutație și un anumit fenotip. Dar în cazurile în care a fost găsit un număr mare de mutații sau mutațiile au afectat gene cu funcție necunoscută, analiza comparativă a secvențelor nu a dezvăluit natura genelor țintă dorite . Prin urmare, mai mulți cercetători au aplicat cu succes analiza segregării în masă în combinație cu secvențierea de generație următoare pentru a identifica mutațiile relevante. În această abordare, mutantul este încrucișat cu o tulpină de referință, iar ADN-ul genomic al segreganților care prezintă fenotipul dorit este pus în comun și secvențiat. Compararea genomului acestui grup de ADN secvențiat cu genomurile tulpinilor parentale poate dezvălui apoi mutațiile conservate relevante pentru fenotip. Mutațiile care nu au legătură cu fenotipul vor fi subreprezentate. Deși nu se poate aștepta ca această abordare să ducă la identificarea unei singure mutații, deoarece mutațiile apropiate de mutația relevantă sunt, de obicei, co-segregate, numărul de ținte pentru investigații ulterioare este redus considerabil.

.