8.3 Teste chimice
Vizualizarea componentelor PHG-urilor pe plăcile TLC este posibilă prin utilizarea reactivilor generali pentru fenoli; clorură ferică, vanilină și acid clorhidric (dau o gamă de culori roz cu derivați de resorcinol sau cloroglucinol), sau prin utilizarea unor teste mai specifice cu 2,4-dinitrofenilhidrazină (detectează aldehidele). Reactivul Folin-Ciocalteu este, de asemenea, util pentru detectarea fenolilor cu nuclee de catecol sau de hirochinonă (apar pete albastre imediat după pulverizarea plăcii TLC) sau pentru alți fenoli, care prezintă pete albastre până la gri atunci când placa este umezită cu vapori de amoniac. Reactivul Gibbs (2% 2,6-diclorochinonă cloroimidă în cloroform) urmat de vaporizarea plăcii cu NH4OH 2M oferă o varietate de culori (de exemplu, este capabil să distingă acidul vanilic – culoare roz – și acidul izovanilic – albastru). Derivații acidului cinamic dau o fluorescență caracteristică albastru deschis atunci când sunt examinați în UV (366 nm). Izomerii cis și trans ai acizilor cinamici sunt prezentați pe plăcile TLC atunci când extractul este cromatografiat în solvenți apoși în două direcții (2D-TLC). Metodele spectrofotometrice pentru estimarea conținutului de fenoli sunt utilizate frecvent, de exemplu, metoda cu reactivul lui Arnow sau reactivul Folin-Ciocalteu menționat anterior .
Câteva teste calitative indică prezența cumarinelor în extractele de plante, de ex, testul inelului lactonic (cumarinele hidrolizate de un alcalin diluat formează o soluție galbenă de săruri de acid O-cumaric, care poate fi inversată după acidificare sau saturație cu CO2); sau testul de cuplare azoică (se dezvoltă culoarea roșie datorită reacției cu acidul sulfanilic de diazotizare într-o soluție alcalină). Cumarinele sunt ușor de detectat la lumină UV (365 nm), deoarece dau o fluorescență caracteristică de culoare (cu excepția cumarinelor simple nesubstituite, care nu au fluorescență). Ele sunt detectate prin culorile lor albastru, violet, maro, verde sau galben. O soluție de 10% de KOH în metanol sau o soluție de 20% de clorură de antimoniu în cloroform poate intensifica culoarea. Hidroxicumarinele nu prezintă deplasări spectrale batocromice în soluție alcalină . În analiza HPLC cu detecție cu matrice de diode, diferite spectre UV ale cumarinelor permit identificarea rapidă a compușilor .
Cumarinele reacționează în soluții alcaline pentru a da O-hidroxi-β-dicetone fără regenerarea inelului γ-pironic și, de asemenea, compuși colorați cu acid concentrat și alcalin concentrat. Cromonele sunt, de asemenea, vizibile în lumină UV (fluorescență albastră, galbenă, galben-verzuie, maro la 365 nm).
Prezența inelului fenil activ (cromofor) în flavonoide le face ușor de detectat în lumină UV. Spectrele lor UV sunt deosebit de informative, oferind informații structurale care pot distinge tipul de fenol și modelul de oxidare. Sunt posibile diferite reacții chimice prin pulverizarea cromatogramelor TLC; de exemplu, vizualizarea în prezența vaporilor de amoniac (chalconele și auronele devin portocalii și, respectiv, roșii) sau pulverizarea cu Naturstoff Reagenz A (soluție de 1% de ester de 2-aminoetanol și acid difenilboric) și suprapulverizarea cu 5% de soluție metanolică de polietilenglicol 4000 (PEG 4000), care sporește sensibilitatea acestei reacții. După derivatizare, compușii au putut fi observați în lumină UV (fluorescență de la galben deschis la verde). Alte teste includ pulverizarea cu clorură ferică, acid sulfanilic diazotizat (ambele sunt reacții pentru fenoli) și reacția specifică; cianidină cu pulbere de magneziu în prezența acidului clorhidric (indică prezența flavanonelor și dihidroflavanolilor) . Pentru estimarea colorimetrică cantitativă a flavonoidelor, se utilizează reacția cu clorură de aluminiu (AlCl3) (absorbția se măsoară la 425 nm). Flavonoidele dizolvate în soluții alcaline dau o culoare galbenă intensă, care scade după adăugarea de acid. Spectrele UV ale compușilor flavonoizi prezintă două benzi principale (maxime de absorbție): banda I la o lungime de undă mai mare (atribuită părții de cinnamoil din structura flavonoidelor) și banda II la o lungime de undă mai mică (datorată părții de benzoil). Banda I este în mod normal la 304-350 nm pentru flavone (H la C-3 în inelul C), la 352-385 nm pentru flavonoli (grup OH la C-3) și la 328-357 nm pentru flavonoli 3-substituiți (O-substituție la C-3). Banda II pentru majoritatea structurilor este la aproximativ 250-280 nm. O grupare fenol suplimentară (-OH) în inelul A determină deplasarea batocromică (deplasarea spre lungimi de undă mai mari) în banda II, iar o grupare -OH suplimentară în inelul B generează un efect similar în banda I .
Majoritatea antrachinonelor sau a glicozidelor lor formează cristale galbene sau roșu-portocalii și pot prezenta fluorescență în funcție de pH . Principala reacție de culoare este testul lui Bornträger, care se realizează prin dizolvarea chinonei în mediu apos alcalin. Reacția de culoare variază de la roșu-portocaliu la purpuriu-violet (în funcție de structura și de substituenții chinonei). Antrachinonele dau o culoare roșie prin această reacție. Pentru 1,8-dihidrochinone, se folosește, de asemenea, reacția cu acetat de magneziu. Antrachinonele pot fi detectate pe plăcile TLC după pulverizarea cu o soluție de KOH metanolică 10%. Culorile inițiale galben sau galben-maroniu se schimbă în roșu, violet, verde sau violet . Pulberea de rubarbă ar putea fi examinată în lumină UV pentru a detecta prezența raponticinei (glicozid stilbenoid, care este toxic). În rubarba originală (Rheum palmatum) apare o fluorescență brun-roșiatică, dar nu se observă pete strălucitoare de culoare albastru-violet (ca în cauza rubarbei rapontice-Rheum rhaponticum).
După cum s-a menționat anterior, saponinele sunt compuși activi de suprafață (modifică tensiunea superficială) și au proprietăți emulsionante. Pentru o verificare calitativă rapidă dacă o plantă are SPG-uri, se folosește de obicei un test de spumare prin agitarea materialului vegetal cu apă. Saponinele au proprietăți de permeabilizare a membranelor. Concentrațiile scăzute de saponine sunt capabile să distrugă membranele eritrocitelor (care pot precipita colesterolul existent în membranele globulelor roșii), provocând hemoliza sângelui in vitro. Această capacitate a dus la utilizarea pe scară largă a hemolizei (indice hemolitic-IH) ca metodă de determinare a activității biologice. IH se definește ca fiind cantitatea de suspensie izotonică 2% de sânge bovin (în ml), care suferă hemoliză atunci când este tratată cu 1 g de material vegetal testat (sau extractul testat). Ca referință s-a utilizat amestecul de saponine Gypsophila paniculata (IH=30.000) sau Saponin Album (Merck) (IH=15.000). După cum au descris Hostettmann și Marston , activitatea hemolitică a saponozidelor variază considerabil în funcție de structura părții glicozidice. Saponinele monodesmosidice (cu excepția acilglicozidelor și a glicirrizinei) sunt puternic hemolitice. Nicio reacție de culoare nu este deosebit de specifică pentru SPG-uri. Cu toate acestea, există reacția Lieberman (cu anhidridă acetică în prezența acidului sulfuric), unde culorile diferă în funcție de tipul de agliconă (triterpenă – roz spre roșu – sau steroid – albastru-verde) .
Reacțiile chimice de identificare a CRG-urilor din materialul vegetal pot fi datorate agliconelor sau zaharurilor. Testul lui Liebermann și Salkoviski indică o fracțiune steroidică, prin urmare nu este specific pentru CRG-uri. Testele Keller Kiliani și Xanthidrole, ambele indică dezoxi-azaharuri (digitoxoză sau cicaroză). Reacția Kedde sau Baljet este mai specifică, deoarece este legată de prezența inelului lactonic α,β-nesaturat. Reacția fluorescentă a CRG-urilor este, de asemenea, posibilă, de exemplu, grupul hidroxil al digoxinei la C-14 și C-16 elimină apa cu H2SO4 cu formarea a două duble legături suplimentare. Rezultă astfel un sistem conjugat (cu o legătură dublă în inelul lactonă) care face ca digoxina să fie fluorescentă în lumină UV. Reacția Jensen (după pulverizarea cu acid tricloroacetic în etanol) este utilizată pentru a vizualiza CRG-urile pe cromatogramele TLC .
Măsurarea directă a HCN-ului total prin hidroliza acidă a glicozidelor cianogenice prezente în alimente, precum și prin descompunerea cianohidrinelor intermediare în HCN are avantajul de a fi aplicabilă tuturor tipurilor de probe, deși este probabil ca nu tot HCN-ul potențial al glicozidelor cianogenice să fie disponibil in vivo. Vizualizarea prezenței acestor compuși în plante este posibilă pe hârtie de filtru impregnată cu reactivi, cum ar fi acid picric/carbonat de sodiu sau benzidină/acetat de cupru. Acești reactivi sunt capabili să dea reacții de culoare cu HCN eliberat din țesutul vegetal zdrobit. Hârtia impregnată se plasează într-un tub peste materialul vegetal zdrobit și se lasă la incubat la 40°C timp de 2 ore. O schimbare de culoare de la galben la maro-roșcat indică eliberarea enzimatică de HCN. Hârtia pictată nu este în întregime specifică pentru cianogen (izotiocianații volatili din speciile Brassica răspund, de asemenea, la această reacție). Prin urmare, se folosește și un alt test care utilizează un amestec (1:1) de soluții proaspăt preparate de 4,4-tetrametildiamină difenilamină 1% în cloroform (p/v) și acetoacetat de etil cupru 1% în cloroform (p/v). Reacția de culoare se transformă de la albastru-verde slab la un verde strălucitor. O altă metodă posibilă necesită distilarea țesutului vegetal în apă acidă și titrarea HCN-ului eliberat cu nitrat de argint. Metodele cromatografice, cum ar fi HPLC/MS sau GC/MS ale derivaților de trimetilsililil sunt eficiente pentru analiza glicozidelor cianogene individuale sau a cianohidrinelor și asigură caracterizarea chimică, precum și cuantificarea compușilor .
Din cauza diversității produselor formate în plante din glucosinolați (în funcție de structura agliconei sale) estimarea izotiocianaților prin metoda spectrofotometrică (în care produșii de culoare 1,3-benzoditiol-2-tione sunt formați prin condensarea izotiocianatului cu 1,2-benzen-ditiol) poate fi insuficientă pentru a determina conținutul de glucozinolați din plante .
.