În scopul acestui articol de blog (vor urma mai multe despre diferitele tipuri de fixatori…), ne vom concentra în principal pe utilizarea paraformaldehidei/formaldehidei, denumită în mod obișnuit PFA, care este cel mai frecvent utilizat fixator în citometria în flux. PFA se referă în mod specific la forma solidă, polimerică a formaldehidei (și se dizolvă în formaldehidă monomerică în soluție apoasă), astfel încât ceea ce se numește de obicei în mod canonic „fixare PFA” este de fapt utilizarea soluției de formaldehidă monomerică. În acest caz, PFA și formaldehida sunt sinonime și interschimbabile.
O soluție variind de la 1-4% PFA este utilizată de obicei pentru fixarea probelor pentru citometria de flux. În cazul dezinfecției probelor infecțioase, concentrații de până la 0,37% pot dezinfecta eficient probele de la pacienții infectați cu HIV1. Incubarea timp de până la 45-60 de minute cu 1% PFA și 15-20 de minute cu 4% PFA (de exemplu, tamponul BioLegend) este suficientă pentru fixarea completă a celulelor, iar celulele pot fi utilizate pentru procesare în aval (permeabilizare pentru ținte intracelulare) sau pot fi stocate pentru analize viitoare în acest stadiu.
În timpul unei proceduri de rutină de colorare prin citometrie în flux care implică colorarea markerilor de suprafață, există mai multe etape în care puteți decide să vă fixați probele – fixați după colorarea markerilor de suprafață sau fixați înainte.
În unele cazuri, decizia privind momentul în care puteți fixa este… fixată. De exemplu, dacă analizați țintele fosfo-ținte, legarea anumitor antigene de suprafață de către anticorpi poate modifica căile de semnalizare intracelulară la scurt timp după contact, conducând astfel la un artefact în rezultatele dvs. de fosforilare. În acest caz, ar trebui să fixați celulele înainte de adăugarea anticorpilor de suprafață (acesta este motivul pentru care protocolul pe care îl recomandăm să îl folosiți pentru tamponul nostru True-Phos™ Perm Buffer pentru analiza țintelor de fosforilare intracelulară este conceput astfel încât etapa de fixare să preceadă alte proceduri). Fiecare are propriile beneficii și dezavantaje, dar iată câteva lucruri la care trebuie să fiți atenți în fiecare caz.