Alai

Stabilirea intervalului de temperatură

Condițiile de laborator utilizate în mod obișnuit pentru culturile de Macrostomum lignano sunt următoarele: temperatură de 20 °C, umiditate 60% și ciclu lumină/întuneric de 14 h/10 h. Aceste condiții au fost alese în principal pentru că sunt optime pentru creșterea diatomeei Nitzschia curvilineata, care este principala sursă de hrană pentru viermi . Pentru a evalua condițiile de temperatură care pot fi utilizate în cadrul experimentului, am stabilit mai întâi intervalul de temperatură în care viermii supraviețuiesc. În timp ce înghețarea viermilor s-a dovedit a fi letală, aceștia au putut supraviețui dacă au fost ținuți la 4 °C timp de cel puțin două săptămâni. Cu toate acestea, deoarece diatomeea nu se dezvoltă în aceste condiții, am decis să excludem 4 °C din experimentele ulterioare. Alte temperaturi sub 20 °C au fost, de asemenea, excluse din experiment, deoarece obiectivul principal al studiului a fost acela de a găsi condiții care să accelereze creșterea și dezvoltarea. De cealaltă parte a spectrului de temperaturi, viermii se dizolvă atunci când sunt ținuți la 42 °C timp de două ore și mor după o săptămână de cultură la 37 °C. Prin urmare, am decis să folosim 20 °C, 25 °C, 30 °C și 35 °C ca și condiții experimentale pentru a studia efectele temperaturii pe termen lung asupra M. lignano (Fig. 1).

Răspunsul la șocul termic

Pentru a investiga ce temperaturi induc răspunsul la stres în viermi, am monitorizat activitatea promotorului șocului termic 20 (Mlig-hsp20). În primul rând, am efectuat o RT-PCR cantitativă pentru a măsura nivelul de expresie al Mlig-hsp20 la 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C și 35 °C. Nu a existat nicio diferență semnificativă în ceea ce privește nivelul de expresie a Hsp20 între 20 °C și 25 °C (Fig. 2a). Cu toate acestea, s-a observat o creștere mică (de 2 ori), dar semnificativă (P = 0,027, testul t), a nivelului de expresie la 30 °C în comparație cu 20 °C (Fig. 2a). O creștere de peste zece ori a nivelului de expresie a fost observată la 33 °C, care a crescut la peste 100 de ori la cea mai ridicată temperatură testată, 35 °C (Fig. 2a). În cadrul celui de-al doilea test, am creat o linie transgenică care exprimă proteina mScarlet-I sub controlul promotorului Mlig-hsp20 (Fig. 2b) și am măsurat nivelul de fluorescență la 24 de ore după o incubare de 2 ore la diferite temperaturi cuprinse între 20 °C și 37 °C (Fig. 2c, d). S-a observat o creștere de peste două și de zece ori a fluorescenței la 34 °C și, respectiv, 37 °C (Fig. 2c).

Viteza de dezvoltare embrionară

Potrivit lui Morris și colab. , este nevoie de aproximativ 120 h (cinci zile) pentru ca ouăle de Macrostomum să se dezvolte complet atunci când ouăle sunt păstrate la 20 °C. Pentru a investiga modul în care temperatura afectează viteza de dezvoltare embrionară și de ecloziune, am cules embrioni proaspăt puși și am monitorizat dezvoltarea lor până la ecloziune la diferite temperaturi. Pentru a investiga eventualele diferențe datorate fondului genetic, am folosit două linii de M. lignano care sunt utilizate în prezent în majoritatea studiilor privind M. lignano, liniile DV1 și NL10. Aceste linii sunt derivate în mod independent din populații de tip sălbatic din aceeași locație geografică și diferă printr-o duplicare de cromozomi întregi, dar în rest se comportă foarte asemănător în condiții de laborator. Am studiat mai întâi efectul temperaturii scăzute. La 4 °C, dezvoltarea ouălor este oprită și acestea pot fi păstrate timp de cel puțin o lună, reluându-și dezvoltarea odată ce sunt readuse la temperaturi mai ridicate. Apoi, am studiat cât de repede se dezvoltă ouăle la temperaturi cuprinse între 20 °C și 35 °C. După cum se arată în Fig. 3, atunci când au fost păstrate în condiții standard (20 °C), ouăle au început să eclozeze după șase zile. Creșterea temperaturii a dus la o dezvoltare embrionară proporțional mai rapidă și la o ecloziune mai rapidă, care a fost de două ori mai rapidă la 35 °C în comparație cu 20 °C și a durat doar trei zile. De remarcat că aproximativ 10 % dintre ouă rămân neeclozate după opt zile de incubație la 20 °C, în comparație cu mai puțin de 5 % la temperaturi mai ridicate, ceea ce sugerează că nici măcar cea mai ridicată temperatură testată, de 35 °C, nu are efecte dăunătoare asupra supraviețuirii embrionilor.

Reproducere

Rata de reproducere este un factor foarte important pentru un organism model, deoarece animalele cu un timp de generare mai scurt permit generarea mai rapidă de date în experimentele genetice. În plus, dacă animalele produc un număr mare de descendenți, datele generate vor avea, în cele mai multe cazuri, o putere statistică mai mare.

Pentru a evalua impactul temperaturii asupra ratei de reproducere a M. lignano, am comparat numărul de descendenți generați pe parcursul a cinci săptămâni de către viermii ținuți în diferite condiții de temperatură. Experimentul a fost început cu puii eclozați pentru a încorpora în studiu dezvoltarea postembrionară și au fost utilizate atât linia DV1, cât și linia NL10. A fost nevoie de trei săptămâni pentru ca puii eclozați ai ambelor linii să crească și să producă prima progenitură la 20 °C, în timp ce la 25 °C s-au observat puii eclozați în două săptămâni pentru linia NL10, dar nu și pentru DV1. La 30 °C și 35 °C, ambele linii au produs descendenți deja după două săptămâni (Fig. 4). De la trei săptămâni încolo, numărul de eclozoare produse pe săptămână a crescut de la mai puțin de 200 la 20 °C la peste 300 la temperaturi de peste 20 °C; numărul de eclozoare a fost cel mai mare pentru viermii ținuți la 30 °C. Acest lucru a fost valabil pentru ambele medii genetice și nu am observat diferențe semnificative între liniile DV1 și NL10 (Fig. 4).

Deși temperaturile de 30 °C și mai mari au dus la mai mulți pui eclozionați, aceasta activează, de asemenea, un răspuns de șoc termic (Fig. 2). Pentru a investiga efectul pe termen lung al temperaturii ridicate și potențialul stres pe care îl poate avea asupra viermilor, am păstrat viermii la temperaturile selectate și am monitorizat aberațiile morfologice după trei și șase luni de cultivare. Viermii ținuți la 25 °C nu au prezentat modificări morfologice la ambele puncte de control, în comparație cu viermii ținuți la 20 °C (Fig. 5). Cu toate acestea, atât pentru condițiile de temperatură de 30 °C, cât și pentru cele de 35 °C, s-au observat diverse aberații în morfologia generală. După trei luni, un număr crescut de chisturi, țesut deteriorat și testicule mărite au fost prezente în mod obișnuit atât la liniile DV1, cât și la NL10 (Fig. 5). Niciunul dintre viermii ținuți la 35 °C nu a supraviețuit până la punctul de control de șase luni, iar toți viermii care au supraviețuit la 30 °C au prezentat aberații morfologice (Fig. 5). Prin urmare, expunerea prelungită la temperaturi de peste 30 °C este dăunătoare pentru M. lignano.

Timp de regenerare

Din moment ce principala atracție a M. lignano ca organism model este capacitatea sa de regenerare, am studiat în continuare modul în care temperatura influențează regenerarea. Este de obicei acceptat faptul că o temperatură mai ridicată duce la creșterea activității metabolice globale . Pentru a evalua influența temperaturii asupra timpului necesar pentru ca un vierme să-și regenereze complet corpul după amputarea deasupra regiunii testiculare, am urmărit regenerarea testiculelor și apariția spermatozoizilor în vezicula seminală utilizând o linie transgenică NL22 stabilită anterior, care exprimă GFP sub controlul promotorului ELAV specific testiculelor și spermatozoizilor . Utilizarea unui astfel de marker transgenic oferă o mai mare precizie, consecvență și eficiență în evaluarea gradului de regenerare. Într-adevăr, nu am observat nicio variație semnificativă atunci când am evaluat timpul de apariție a semnalului GFP după amputare la toate temperaturile testate (tabelul 1).

Cum era de așteptat, viteza de regenerare a crescut odată cu temperatura (tabelul 1). Dacă luăm timpul de regenerare la 20 °C ca viteză standard, atunci pentru regenerarea testiculelor, coeficienții de temperatură calculați sunt Q10 = 4 la 25 °C și Q10 = 3 pentru 30 °C și 35 °C. Acest lucru arată că cel mai mare efect se obține la creșterea temperaturii până la 25 °C, iar cea mai rapidă regenerare are loc la 30 °C, fără ca creșterea temperaturii să aducă beneficii suplimentare asupra timpului de regenerare. Prin urmare, temperaturile de 25 °C și 30 °C ar trebui să fie luate în considerare în experimentele de regenerare la M. lignano, deoarece scurtează durata unui experiment de două până la trei ori (tabelul 1).

Interferența ARN

Reducerea expresiei genelor prin interferență ARN (RNAi) este în prezent principala abordare pentru studiile de pierdere a funcției la M. lignano . În această abordare, animalele sunt îmbibate cu ARN bicatenar împotriva genei țintă și, adesea, sunt necesare tratamente prelungite timp de câteva săptămâni pentru a observa un fenotip . Am testat modul în care temperatura influențează viteza de dezvoltare a fenotipului în urma tratamentului cu RNAi. Pentru a face acest lucru, am eliminat Mlig-ddx39, o genă cunoscută pentru funcția sa în proliferarea celulară la M. lignano și un fenotip letal robust knockdown . În mod similar cu testul de reproducere, am utilizat liniile DV1 și NL10 pentru acest experiment (tabelul 2). La 20 °C, a fost nevoie de aproximativ 20 de zile pentru ca toate animalele să moară în urma eliminării Mlig-ddx39. Atunci când viermii au fost ținuți la temperaturi mai ridicate, moartea a survenit mai repede: la 11 și 8 zile pentru viermii ținuți la 25 °C și, respectiv, 30 °C. Nu a existat nicio diferență vizibilă între cele două tulpini utilizate pentru experiment (tabelul 2). În continuare, am investigat dacă creșterea observată a vitezei de manifestare a fenotipului ddx39 RNAi la temperaturi mai ridicate este atribuită unei eficiențe mai mari a eliminării genei prin RNAi sau altor factori. Pentru aceasta, am măsurat prin qRT-PCR abundența transcripțiilor Mlig-ddx39 la diferite momente de timp după începerea experimentului RNAi la diferite temperaturi (Fig. 6). Animalele tratate cu dsRNA împotriva gfp au fost utilizate ca și controale de referință. La toate temperaturile testate nu au fost observate variații semnificative ale nivelurilor de expresie ale Mlig-ddx39 între probele de control pe parcursul experimentului (Fig. 6). În același timp, pentru animalele tratate cu ARNdb Mlig-ddx39 s-a observat o scădere de ~ 80 % a nivelului de transcripți ddx39 deja după o zi de tratament la 20 °C sau 25 °C, și chiar o scădere mai mare de ~ 90 % la 30 °C. Cu toate acestea, în zilele următoare, nivelurile de knockdown s-au stabilizat la aproximativ 95% la toate temperaturile. Astfel, concluzionăm că cinetica RNAi în sine nu este afectată în mod semnificativ de temperatură. În schimb, scurtarea observată a timpului de manifestare a fenotipului RNAi Mlig-ddx39 la temperaturi mai ridicate poate fi explicată prin creșterea ratei de reînnoire a celulelor.

Pentru a testa dacă accelerarea dezvoltării fenotipurilor RNAi la temperaturi ridicate poate fi generalizată la alte gene, am investigat gena Mlig-sperm1, a cărei knockdown duce la morfologie anormală a spermei și testicule mărite . Acesta este un fenotip RNAi lent, care are nevoie de 2-3 săptămâni pentru a se dezvolta la 20 °C . Pentru a cuantifica amploarea fenotipului la diferite temperaturi, în ziua 4 de tratament RNAi am numărat fracțiunea de animale cu testicule mărite până la punctul în care se atingeau unul de celălalt. (Fig. 7). Similar cu rezultatele obținute cu RNAi Mlig-ddx39, temperaturile mai ridicate au dus la o dezvoltare mai rapidă a fenotipului și, în timp ce nu s-au observat testicule suficient de mărite după patru zile de tratament cu dsRNA la 20 °C, 25 și 85 % dintre animale au dezvoltat testicule mărite la 25 °C și, respectiv, 30 °C (tabelul 2). Prin urmare, similar cu regenerarea, fenotipurile ARNi pot fi accelerate odată cu temperatura la M. lignano, iar temperaturile mai ridicate pot fi utilizate pentru a scurta durata experimentelor.

.