HCoV-229E (VR-740) și HCoV-OC43 (VR-1558) au fost propagate în fibroblastele pulmonare diploide umane MRC-5 (CCL-171) și WI-38 (CCL-75), respectiv (toate de la ATCC, Manassas, VA). Ambele linii celulare umane au fost cultivate în MEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamină, 100 U/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, SUA). Mediul de infecție virală a constat din MEM sau RPMI-1640 plus 2% FBS inactivat termic pentru HCoV-229E și, respectiv, HCoV-OC43. Tulpinile virale au fost propagate prin inocularea de flacoane conținând celule gazdă vechi de 24 de ore, care erau confluente în proporție de 80-90%. După o oră de incubare, monocapa celulară a fost spălată și incubată în mediu de infecție proaspăt timp de trei sau patru zile la 35 °C pentru HCoV-229E și la 33 °C pentru HCoV-OC43. Supernatantul care conține stocul viral de lucru a fost apoi colectat prin centrifugare (300 g timp de 15 minute). Titrul virusului a fost determinat cu 50 % din doza infecțioasă de cultură tisulară TCID50 prin evaluarea efectelor citopatice (CPE), care au fost marcate la un microscop cu câmp luminos (10×) ca vacuolizare a citoplasmei, rotunjire și descuamare a celulelor.
Camera de iradiere a aerosolilor de pe masă
Camera dinamică de iradiere a aerosolilor/virusurilor, cu un singur pasaj, a fost utilizată pentru a genera, expune și colecta eșantioane de aerosoli, așa cum a fost descrisă anterior23. Aerosolii virali au fost generați prin adăugarea unei soluții de virus într-un nebulizator de terapie respiratorie cu aerosoli extinși cu debit ridicat (Westmed, Tucson, AZ) și care funcționează cu ajutorul unei pompe de aer cu un debit de intrare de 11 L/min. Virusul a pătruns în cameră și a fost amestecat cu aer uscat și umidificat pentru a menține umiditatea între aproximativ 50-70%. Umiditatea relativă, temperatura și distribuția dimensiunii particulelor de aerosoli au fost monitorizate pe tot parcursul funcționării. Aerosolul a fost expus la lumina UV îndepărtată și, în cele din urmă, a fost colectat cu ajutorul unui BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
Lama UV îndepărtată a fost poziționată la aproximativ 22 cm distanță de camera de expunere la UV și a fost îndreptată spre fereastra de plastic de 26 cm × 25,6 cm × 254 μm care transmite UV (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). În concordanță cu experimentele noastre anterioare care au utilizat această cameră23, debitul prin sistem a fost de 12,5 L/min. Volumul regiunii de expunere la UV a fost de 4,2 L, astfel încât fiecare aerosol a fost expus timp de aproximativ 20 de secunde în timp ce traversa fereastra. Întreaga cameră de iradiere a fost conținută într-o cabină de biosecuritate de nivel 2, iar toate intrările și ieșirile de aer au fost echipate cu filtre HEPA (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) pentru a preveni intrarea sau ieșirea contaminării nedorite din sistem.
Performanța camerei de iradiere
Camera de iradiere personalizată a simulat transmiterea virușilor aerosolizați produși prin tuse și respirație umană. Camera a funcționat la o umiditate relativă medie de 66% și la o temperatură medie de 24 °C în toate rulările. Distribuția medie a dimensiunilor particulelor a fost de 83 % între 0,3 μm și 0,5 μm, de 12 % între 0,5 μm și 0,7 μm și de 5 % >0,7 μm (tabelul 3). Virusurile aerosolizate au fost transmise în mod eficient prin sistem, după cum reiese din martorul (expunere zero) care prezintă o integrare clară a virusului (figurile 2 și 3, panourile din stânga sus).
Lampa Far-UVC și dozimetria
Sursa Far-UVC utilizată în acest studiu a fost un modul de lampă excimera KrCl de 12 W 222-nm fabricat de USHIO America (articol nr. 9101711, Cypress, CA). Lampa este echipată cu o fereastră de filtrare optică brevetată pentru a reduce emisiile lămpii în afara vârfului de emisie KrCl de 222 nm. Lampa a fost poziționată la 22 cm distanță de fereastra camerei de expunere și a fost orientată spre centrul ferestrei. Măsurătorile puterii optice au fost efectuate cu ajutorul unui fotodetector de siliciu îmbunătățit cu UV de mică putere 818-UV/DB cu un aparat de măsură a puterii optice 843-R (Newport, Irvine, CA). Dozimetria a fost efectuată înainte de începerea unui experiment pentru a măsura fluența în interiorul camerei la poziția aerosolului.
Distanța dintre lampă și camera de iradiere a permis ca o singură lampă să iradieze uniform întreaga suprafață a ferestrei de expunere. Măsurătorile efectuate cu ajutorul fotodetectorului de siliciu au indicat o intensitate de expunere de aproximativ 90 μW/cm2 în întreaga zonă de expunere. Camera este echipată cu o suprafață reflectorizantă din aluminiu în fața ferestrei de expunere. Ca și în lucrările noastre anterioare cu această cameră23, reflectivitatea acestei suprafețe a fost de aproximativ 15 %. Prin urmare, am estimat în mod prudent că intensitatea pe întreaga suprafață de expunere este de 100 μW/cm2. Cu lampa poziționată la 22 cm de fereastră și având în vedere cele 20 de secunde necesare pentru ca o particulă de aerosol să traverseze fereastra de expunere, am calculat doza totală de expunere la o particulă ca fiind de 2 mJ/cm2. Am utilizat foi suplimentare de ferestre din plastic care transmit UV pentru a reduce uniform intensitatea în întreaga regiune de expunere, pentru a crea diferite condiții de expunere. În timp ce în lucrările noastre anterioare cu aceste foi am măsurat o transmisie mai apropiată de 65%23, pentru aceste teste am măsurat transmisia de 222 nm a fiecărei foi ca fiind de aproximativ 50%. Această scădere a transmisiei se datorează probabil fotodegradării plasticului în timp4. Adăugarea uneia sau a două foi de plastic care acoperă fereastra de expunere scade doza de expunere la 1 și, respectiv, 0,5 mJ/cm2.
Protocol experimental
Așa cum a fost descris anterior23, soluția de virus din nebulizator a constat din 1 ml de mediu modificat Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) conținând 107-108 TCID50 de coronavirus, 20 ml de apă deionizată și 0,05 ml de soluție salină echilibrată Hank cu calciu și magneziu (HBSS++). Camera de iradiere a fost pusă în funcțiune cu particule de virus aerosolizate care circulă prin cameră și prin canalul de bypass timp de 5 minute înainte de fiecare eșantionare, pentru a se stabili valoarea RH dorită. Colectarea probelor a fost inițiată prin schimbarea fluxului de aer din canalul de bypass către BioSampler cu ajutorul setului de supape cu trei căi. BioSamplerul a fost umplut inițial cu 20 ml de HBSS++ pentru a capta aerosolul. În timpul fiecărui timp de prelevare a probelor, care a durat 30 de minute, interiorul camerei de iradiere a fost expus la lumina UVC îndepărtată de 222 nm care intra prin fereastra de plastic. Variația dozei de UV-UVC îndepărtată administrată particulelor de aerosoli a fost realizată prin inserarea unor folii de plastic suplimentare transparente la UV, așa cum s-a descris mai sus, furnizând astfel cele trei doze de testare de 0,5, 1,0 și 2,0 mJ/cm2. Studiile de control al dozei zero au fost efectuate cu lampa excimer oprită. După încheierea perioadei de eșantionare, soluția din BioSampler a fost utilizată pentru testele de infecțiozitate a virusului.
Sesizări de infecțiozitate a virusului
TCID50
Am utilizat testul dozei infecțioase de 50% din cultura de țesuturi pentru a determina infecțiozitatea virusului28. Pe scurt, 105 celule gazdă au fost plasate în fiecare puț al plăcilor cu 96 de puțuri cu o zi înainte de experiment. Celulele au fost spălate de două ori în HBSS++ și diluții seriale 1:10 în mediu de infecție ale virusului expus de la BioSampler au fost suprapuse pe celule timp de două ore. Celulele au fost apoi spălate de două ori în HBSS++, acoperite cu mediu de infecție proaspăt ș i incubate timp de trei sau patru zile la 34 °C. Efectele citopatice (CPE) au fost marcate la un microscop cu câmp luminos (10×) ca vacuolizare a citoplasmei, rotunjire și descuamare a celulelor. TCID50 a fost calculată prin metoda Reed și Muench28,38. Pentru a confirma scorurile CPE, probele au fost fixate în metanol 100% timp de cinci minute și colorate cu cristal violet 0,1%. Rezultatele sunt raportate ca estimare a unităților formatoare de plăci (PFU)/ml folosind conversia PFU/ml = 0,7 TCID50 prin aplicarea distribuției Poisson29.
Imunofluorescență
Pentru a evalua dacă dozele crescânde de lumină de 222 nm au redus numărul de celule infectate, am efectuat un protocol standard de imunocolorare fluorescentă pentru a detecta un antigen viral în celulele umane gazdă23. Pe scurt, 2 × 105 celule gazdă (celule MRC-5 pentru HCoV-229E și WI-38 pentru HCoV-OC43) au fost plasate în fiecare puț al plăcilor cu 48 de puțuri cu o zi înainte de experiment. După ce s-a trecut prin camera de iradiere timp de 30 de minute, 150 μl de suspensie virală colectată din BioSampler au fost suprapuse pe monostrat de celule gazdă. Celulele au fost incubate cu virusul timp de o oră, apoi au fost spălate de trei ori cu HBSS++ și incubate peste noapte în mediu de infecție proaspăt. Celulele infectate au fost apoi fixate în metanol 100% rece la gheață la 4 °C timp de 5 minute și marcate cu glicoproteina de vârf a coronavirusului uman (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 în HBSS++ conținând 1% albumină serică bovină (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, SUA) la temperatura camerei timp de o oră, cu agitare ușoară. Celulele au fost spălate de trei ori în HBSS++ și au fost marcate cu un antimouse de capră Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 în HBSS++ care conține 1% BSA, la temperatura camerei timp de 30 de minute în întuneric, cu agitare ușoară. După trei spălări în HBSS++, celulele au fost colorate cu Vectashield conținând DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) și au fost observate cu obiectivul de 10× al unui microscop fluorescent Olympus IX70 echipat cu o cameră digitală de înaltă rezoluție și de înaltă eficiență Photometrics PVCAM și cu software-ul Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Pentru fiecare doză de 222 nm și gen de virus, rezultatele reprezentative au fost repetate de două ori. Pentru fiecare probă, au fost achiziționate până la zece câmpuri de vizualizare a imaginilor fuzionate cu DAPI și Alexa Fluor-488.
Analiza datelor
Fracțiunea supraviețuitoare (S) a virusului a fost calculată prin împărțirea fracțiunii PFU/ml la fiecare doză UV (PFUUV) la fracțiunea la doza zero (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Valorile de supraviețuire au fost calculate pentru fiecare experiment repetat și au fost transformate în log natural (ln) pentru a apropia distribuția erorilor de cea normală39. S-a efectuat o regresie liniară robustă cu ajutorul programului IWLS (iterated re-weighted least squares)40,41 în software-ul R 3.6.2 folosind aceste valori ln normalizate ca variabilă dependentă și doza de UV (D, mJ/cm2) ca variabilă independentă. Folosind această abordare, supraviețuirea virusului a fost descrisă prin cinetica de ordinul întâi conform ecuației4:
unde k este constanta ratei de inactivare UV sau factorul de susceptibilitate (cm2/mJ). Regresia a fost realizată cu termenul de interceptare setat la zero, reprezentând definiția unei supraviețuiri relative de 100% la o doză zero de UV, separat pentru fiecare tulpină de virus studiată. Datele la doza zero, care prin definiție reprezintă ln = 0, nu au fost incluse în regresie. Incertitudinile (intervale de încredere de 95 %, IC) pentru parametrul k pentru fiecare tulpină de virus au fost estimate prin bootstrap pentru fiecare metodă de regresie, deoarece bootstrap poate duce la estimări mai realiste ale incertitudinii, în comparație cu aproximația analitică standard bazată pe normalitatea asimptotică, în seturi de date mici, cum ar fi cele utilizate aici (n = 3 HCoV-229E și n = 4 pentru HCoV-OC43). Bunătatea de potrivire a fost evaluată prin coeficientul de determinare (R2). Analiza reziduurilor pentru autocorelație și pentru heteroskedasticitate a fost efectuată cu ajutorul testului Durbin-Watson42 și, respectiv, al testului Breusch-Pagan (implementat de pachetul R lmtest)43 . Estimările parametrilor (k) pentru fiecare tulpină de virus au fost comparate între ele pe baza IC de 95% și direct prin testul t, utilizând dimensiunile eșantioanelor, valorile k și erorile standard ale acestora. Secțiunea transversală de inactivare a virusului, D90, care reprezintă doza de UV care inactivează 90 % din virusul expus, a fost calculată ca D90 = – ln/k. Alte valori D au fost calculate în mod similar.
.