Alai

Fibroblastele RTT prezintă o activare defectuoasă a autofagiei în condiții de înfometare

Pentru a verifica ipoteza privind autofagia defectuoasă la pacienții cu RTT, am analizat activarea autofagiei în condiții de înfometare în fibroblastele primare de piele izolate de la pacienții RTT (n = 4) și de la subiecți sănătoși (n = 4)17,19.

Am definit mai întâi viabilitatea în timp a fibroblastelor sănătoase și RTT cultivate în mediu de înfometare atât prin testele de excludere MTT, cât și prin testul de excludere cu albastru Trypan. În ceea ce privește viabilitatea fibroblastelor RTT cultivate în mediu standard, viabilitatea fibroblastelor RTT a scăzut după 4 h de înfometare (20 ± 3,3% de celule muribunde, p < 0,05); acest procent a crescut considerabil după 6-8 h de înfometare (60 ± 5,1% de celule muribunde, p < 0,05) (Fig. 1a). În schimb, fibroblastele sănătoase au fost încă pe deplin viabile după 4 h de înfometare, cu doar o reducere foarte mică a viabilității după 6-8 h (10 ± 1,2 % de celule muribunde, p < 0,01) în ceea ce privește viabilitatea fibroblastelor cultivate în mediu standard (Fig. 1a). Astfel, ca urmare a unei comparații directe a viabilității celor două linii celulare la fiecare punct de timp, a reieșit că viabilitatea fibroblastelor RTT a fost grav compromisă începând cu timpul 4 h (a se vedea detalii în legendele figurii, p < 0,05). Mai mult, o analiză prin Western blotting (WB) a evidențiat faptul că în fibroblastele RTT care au fost înfometate timp de 4 h, o bandă corespunzătoare fragmentului p25 al poli(ADP-riboză)polimerazei-1 (PARP) a fost mult crescută (96 ± 4 %, p < 0,001) în comparație cu detecția slabă de la timpul 0. Acest fragment este eliberat prin degradarea dependentă de caspază a proteinei în timpul fazei timpurii de inducție a apoptozei (Fig. 1b)35. Fragmentul p25 a fost aproape nedetectabil în fibroblastele sănătoase în aceleași condiții experimentale.

Aceste date au confirmat faptul că fibroblastele RTT nu au tolerat creșterea într-un mediu de înfometare și au suferit rapid apoptoză. Prin urmare, am investigat în continuare fluxul autofagic prin monitorizarea clearance-ului markerului LC3B-II în prezența și în absența unui inhibitor al lizozomului, cum ar fi clorochina (CQ)24,25,26,26,27,27,28,28,29,30.

După ce am exclus un efect citotoxic legat de CQ (Fig. Suplimentară S1), fibroblastele sănătoase și RTT au fost cultivate fie în medii de repaus, fie în medii de inaniție timp de 2 h în prezența sau absența a 20 µM de CQ pentru a cuantifica raportul LC3B-II/GAPDH prin WB (Fig. 2a). Modelul raportului LC3B-II/GAPDH (sau orice alt control intern care nu este modulat de autofagie) în condiții de activare a autofagiei și în prezența și în absența CQ (sau a oricărui alt inhibitor lizozomal) este considerat o strategie valabilă pentru monitorizarea fluxului de autofagie.

În fibroblastele sănătoase, cultivate în mediu standard, LC3B-I a fost clar imunodetectată, în timp ce LC3B-II a fost slabă. Raportul LC3BII/GAPDH al fibroblastelor sănătoase cultivate în mediu standard în absența și în prezența CQ a fost comparabil (Fig. 2a, panoul din stânga). Această observație sugerează că autofagia bazală a fost aproape nedetectabilă în fibroblastele sănătoase (Fig. 2a, panoul din stânga).

Când aceste celule au fost cultivate în mediu de înfometare și în absența CQ timp de 2 h, raportul LC3B-II/GAPDH a crescut (60 ± 4.8%, p < 0,05) în comparație cu cel al fibroblastelor sănătoase cultivate în mediu standard, fie în absența, fie în prezența CQ (care a fost, așa cum s-a menționat anterior, identic) (Fig. 2a, panoul din stânga și din dreapta). Acest comportament, într-adevăr, indică faptul că LC3-I a suferit de fapt o lipidare pentru a forma LC3B-II, care este un marker timpuriu al activării autofagiei24,25,26,26,27,28,28,29,30. Pentru a testa prezența acestei activări a autofagiei, am cultivat celulele într-un mediu de înfometare în prezența CQ timp de 2 h și acestea au prezentat o creștere suplimentară a raportului LC3B-II/GAPDH (94 ± 5,5 %, p < 0,001) în raport cu fibroblastele sănătoase cultivate în mediu standard (Fig. 2a, panoul din stânga și din dreapta).

În plus, diferența dintre raportul LC3B-II/GAPDH al fibroblastelor sănătoase cultivate în mediu de înfometare în absența și în prezența CQ a fost semnificativă din punct de vedere statistic (p < 0,05, Fig. 2a, panoul din stânga)

Astfel, în conformitate cu interpretarea standard a modelului LC3B-II prin analiza WB, rezultatul general indică faptul că, în absența nutrienților, fibroblastele sănătoase stimulează formarea de autofagosomi care suferă o acumulare în prezența CQ. Acest comportament este compatibil cu un flux autofagic normal24,25,26,26,27,27,28,28,29,30. În mod interesant, în cazul fibroblastelor RTT cultivate în mediu standard, în timp ce LC3B-I a fost clar imunodetectată, LC3B-II a fost foarte slabă în celule atât în absența, cât și în prezența CQ (Fig. 2a, panoul din stânga). În condiții de înfometare și în absența CQ, apariția unei benzi slabe corespunzătoare LC3B-II în fibroblastele RTT numai după o expunere îndelungată a filtrului a sugerat că a avut loc cel puțin o lipidare minimă a LC3B-I (Fig. 2a, panoul din stânga). Prin urmare, raportul LC3B-II/GAPDH între fibroblastele RTT cultivate în mediu de înfometare în absența CQ a crescut (93 ± 5,5 %, p < 0,001) în raport cu cel al fibroblastelor RTT cultivate în mediu standard în absența CQ (Fig. 2a, panoul din dreapta).

Cu toate acestea, administrarea de CQ la fibroblastele RTT cultivate în mediu de înfometare nu a crescut și mai mult raportul LC3B-II/GAPDH, care a fost crescut (95 ± 3,5%, p < 0,001) dacă se compară cu cel al celulelor cultivate în mediu standard în absența CQ, dar nu a fost semnificativ crescut în raport cu raportul LC3B-II/GAPDH al fibroblastelor RTT cultivate în mediu de înfometare în absența CQ (Fig. 2a, panoul din stânga). Această constatare a sugerat că nu are loc o acumulare de autofagosomi în celulele RTT, iar analiza WB a susținut un blocaj, la un anumit nivel, al fluxului de autofagie24,25,26,27,28,29,30,31.

Pentru a consolida și mai mult ipoteza noastră privind un posibil flux autofagic defectuos, am verificat degradarea a două substraturi recunoscute ale reporterilor de autofagie în fibroblastele sănătoase și RTT înfometate timp de 2 și 4 h în absența CQ, și anume: (i) proteina p62/SQSMT1, care ajută la eliminarea agregatelor proteice poli-ubiquitinate și care este la rândul ei degradată de hidrolazele lizozomale36; (ii) proteazomul 20 S, care este rapid degradat în condiții de înfometare37,38. În ceea ce privește nivelul bazal al celor două proteine (adică timpul 0), s-a observat o scădere în timp a raportului p62/tubulină (44 ± 10 % după 4 h, p < 0,001) și a raportului PSMA-3/GAPDH (adică subunitatea α7 a proteazomului 20 S) (45 ± 3,1 % după 2 h, 11 ± 5,2 % după 4 h, în ambele cazuri p < 0,001) în fibroblastele sănătoase (Fig. 2b, panoul superior).

În cazul fibroblastelor RTT, scăderea raportului p62/tubulină în timp nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic nici măcar după 4 h (89 ± 9%), în timp ce scăderea raportului PSMA3/GAPDH la 2 h (81 ± 4,4%, p < 0,05) și 4 h (78 ± 5,1%, p < 0,05) a fost semnificativ diferită dacă se compară cu nivelul bazal al proteinei (adică timpul 0) (Fig. 2b, panoul inferior). Cu toate acestea, diferențele dintre grupurile sănătoase și RTT au fost semnificative din punct de vedere statistic în cazul raportului p62/tubulină doar la 4 h (p < 0,05), în timp ce raportul PSMA3/GAPDH a fost semnificativ diferit între grupurile experimentale atât la 2 h (p < 0.05), cât și la 4 h (p < 0,001) (Fig. 2b, panoul inferior).

În mod interesant, modelele β-tubulină și GAPDH, utilizate ca și controale interne pentru colorarea p62 și, respectiv, pentru colorarea PSMA3, nu au fost modificate pe parcursul a 4 h de înfometare în fibroblastele sănătoase. Cu toate acestea, intensitatea benzii de β-tubulină, precum și cea a benzii GAPDH, a scăzut semnificativ în fibroblastele RTT înfometate timp de 4 h în comparație cu ceea ce s-a observat la timpul 0 sau la timpul 2 h pentru aceste celule (Fig. 2b, panoul superior). Această reducere s-a datorat probabil numărului mai mic de fibroblaste RTT vii recoltate la acest moment (în concordanță cu viabilitatea slabă a fibroblastelor RTT la 4 h de înfometare raportată în Fig. 1a) și nu datorită unei reglări în jos a β-tubulinei în timp. În ansamblu, s-a constatat că fibroblastele RTT nu au degradat în mod eficient aceste substraturi reporter de autofagie, susținând ipoteza unei autofagii defectuoase.

Pentru a face mai multă lumină asupra caracteristicilor acestui blocaj, am efectuat o analiză de imuno-fluorescență utilizând anticorpul LC3B. Am analizat fibroblastele sănătoase și RTT cultivate în mediu standard în absența CQ (stare de repaus) și în mediu de înfometare timp de 2 h în prezența sau absența a 20 µM CQ (Fig. 2c). În concordanță cu rata metabolică lentă a celulelor primare, am constatat că fibroblastele sănătoase și RTT în repaus au prezentat o colorare slabă și difuză LC3B+ cu un procent scăzut de celule care prezintă mai mult de 10 puncte (adică autofagosomi) (8 ± 5% și, respectiv, 1 ± 0,5%), ceea ce indică faptul că, prin imunofluorescență, autofagia bazală a fost slab detectabilă, în concordanță cu datele raportate în Fig. 2a.

În ceea ce privește celulele cultivate în mediu standard, procentul de fibroblaste sănătoase cultivate în mediu de înfometare (în absența CQ) care prezintă cel puțin 10 autofagozomi LC3B+ a crescut semnificativ (82 ± 10%, p < 0,005), în timp ce fibroblastele RTT cultivate în mediu de înfometare au prezentat o ușoară creștere (17 ± 8%, p < 0,001). De fapt, procentul de fibroblaste sănătoase cultivate în mediu de înfometare care prezintă cel puțin 10 autofagosome a fost semnificativ mai mare decât cel al fibroblastelor RTT cultivate în aceleași condiții experimentale (p < 0,005). Autofagozomii au fost localizați în principal în regiunea perinucleară. În prezența CQ, s-a observat în continuare o colorare difuză și intensă LC3B+ așteptată, chiar dacă, în acest caz, colorarea difuză nu a permis cuantificarea precisă a numărului de puncte.

Administrarea de CQ a fost ineficientă în fibroblastele RTT, indicând în mod clar o biogeneză autofagozomală sever afectată (Fig. 2c).

Datorită relevanței afectării presupuse asupra biogenezei autofagozomale, a fost adoptată o abordare suplimentară pentru a confirma această observație. Atât fibroblastele sănătoase, cât și cele RTT, înfometate timp de 2 h în absența CQ, au fost colorate cu un colorant specific (Cyto-ID) pentru membrana autofagosomală și analizate prin imuno-fluorescență. Chiar și în acest caz, în timp ce în fibroblastele sănătoase s-au detectat efectiv mai mulți autofagosomi, în fibroblastele RTT s-a observat doar un număr limitat de vezicule mici și izolate (Fig. Suplimentară S2). Diferența în ceea ce privește procentul de celule care prezintă cel puțin 5 puncte pozitive Cyto-ID între fibroblastele sănătoase și cele RTT a fost marcant de semnificativă (80 ± 4 % vs. 8 ± 6 %, respectiv, p < 0,001). Prin urmare, analiza globală a furnizat dovezi că în fibroblastele primare RTT are loc o biogeneză autofagosomală defectuoasă.

RBC-urile mature ale pacienților RTT purtători ai mutației MeCP2 R255X păstrează mitocondriile

Am căutat apoi să determinăm dacă semne suplimentare de autofagie defectuoasă pot fi observate ex vivo la pacienții RTT. Datorită faptului că eliminarea mitocondriilor este un mecanism clasic bazat pe autofagie care are loc în reticulocitele circulante în stadiul final de maturare în hematii32,33,34 , am extins investigația noastră și la hematii umane ex vivo pentru a verifica dacă mitocondriile sunt reținute în aceste celule.

În consecință, hematii de la pacienții RTT (n = 15) și de la donatori sănătoși (n = 11) au fost analizate prin microscopie electronică de transmisie (TEM). Investigația TEM a evidențiat prezența unor structuri asemănătoare mitocondriilor (SRM) în hematii de formă biconcavă izolate de la majoritatea pacienților cu RTT (11 din 15). Dintre acești 11 pacienți cu RTT, trei dintre ei au prezentat cea mai severă cohortă de simptome și, de asemenea, o frecvență ridicată de RBC-uri (20 ± 4 %) (Fig. 3a-h). Așa cum era de așteptat, MRS au fost nedetectabile în hematii sănătoase (Fig. 3I). Diferențele dintre subiecții sănătoși și cei cu RTT au fost semnificative din punct de vedere statistic (p < 0,0004; Fig. 3, panoul inferior).

Cu toate acestea, severitatea simptomelor s-a bazat pe evaluarea clinică și, în consecință, acei trei pacienți cu cele mai severe simptome purtau toți mutația R255X a genei MeCP2, care este asociată cu un prognostic sever39.

În consecință și având în vedere faptul că nu am avut posibilitatea de a înrola un număr mai mare de subiecți care purtau alte mutații cu o frecvență scăzută sau nulă a hemoragiei cu conținut mitocondrial, ne-am concentrat atenția asupra analizei acelor trei pacienți. Analiza TEM a documentat, în acele trei cazuri menționate mai sus, prezența unor structuri asemănătoare mitocondriilor intacte sau parțial digerate (fie cu densitate electronică, fie lucitoare), care aveau o formă normală sau de halteră (alungită) și, în general, erau mici, cu criste slabe (Fig. 3a-h). De fapt, s-a constatat că dimensiunea și forma generală a acestor structuri sunt în concordanță cu cele ale mitocondriilor reținute în globulele roșii mature în modelele murine non-RTT de macroautofagie defectuoasă (de exemplu, șoarecii Ulk1-/-) sau mitofagie (de exemplu, șoarecii Nix-/-) raportate de alți autori32,33. În mod interesant, alterările morfologice ale mitocondriilor pe care le-am observat, cum ar fi dimensiunea redusă, structura alungită (adică în formă de halteră) și, în special, prezența cristei slabe au fost deja descrise în mușchi și în cerebelul pacienților cu RTT20,21. Pentru a confirma identitatea mitocondrială a MRS, am colorat hematii de la donatori sănătoși și de la acești pacienți RTT cu simptome severe cu un anticorp anti-COX-IV (citocrom c oxidază). Un număr semnificativ din punct de vedere statistic de hematii de la cei trei pacienți cu RTT în comparație cu hematii de la subiecții sănătoși (35 ± 5% vs 0,2 ± 0,01%, respectiv, p < 0,005) au prezentat un model punctat COX-IV+ care a sugerat reținerea mitocondriilor (Fig. 4). Conținutul mediu de mitocondrii per celulă a fost calculat ca fiind de 1,2 ± 0,2 organite per RBC la pacienții cu RTT și de 0,002 ± 0,0002 la subiecții sănătoși (p < 0,005) (Fig. 4) (p < 0,005) (Fig. 4). Diferențele în ceea ce privește procentul de hematii care prezintă mitocondrii între investigațiile TEM și cele IF pot fi puse pe seama faptului că posibilitatea de a detecta organitele prin TEM este strict dependentă de secțiunea subțire a celulei, care poate împiedica prezența acestora, în timp ce abordarea IF nu este limitată în acest fel.

Pentru a confirma în continuare aceste rezultate, am efectuat o analiză citofluorimetrică a hematiilor atât la subiecții sănătoși, cât și la cei trei pacienți cu RTT, utilizând un anticorp anti-CD71 (receptor de transferrină) și anticorpi anti-COX-IV. Frecvența pozitivității CD71, un marker al globulelor roșii imature, nu a fost semnificativ diferită la pacienții sănătoși și la pacienții cu RTT (1,34 ± 0,13 % față de 1,03 ± 0,3 %; Fig. suplimentară S3). Trebuie subliniat faptul că pacienții cu RTT incluși în studiu au prezentat parametri hematologici normali și, chiar dacă indicele reticulocitar a fost, cel puțin la câțiva subiecți, mai mic decât cel constatat la subiecții sănătoși, diferențele generale dintre cele două grupuri de pacienți nu au fost semnificative din punct de vedere statistic (tabelul 1). În schimb, o populație COX-IV+ foarte slabă a fost observată în hematii sănătoase, în timp ce o frecvență mai mare de celule COX-IV+ a fost detectată în hematii RTT (0,056 ± 0,004% vs 1,15 ± 0,19%, respectiv, p < 0,01). Aceste rezultate au fost confirmate în continuare prin utilizarea colorației Mitotracker Green (MT) (Fig. Suplimentară S3), care a documentat o creștere a numărului de hematii MT+ la un pacient RTT (purtător al mutației MeCP2 R255X) față de un pacient sănătos (0,37% vs 0,16%), similar cu cel observat cu anticorpul COX-IV descris anterior.

Pentru a valida în continuare identitatea MRS, un număr egal de hematii a fost lizat și analizat prin WB în condiții denaturante și reducătoare. Filtrele au fost colorate cu anticorpi împotriva sirtuinei-3, o dezacetilază exprimată în mod specific în matricea mitocondrială40. Sirtuin3 a fost ales ca marker mitocondrial în această abordare deoarece, spre deosebire de COX-IV și de alți markeri mitocondriali, greutatea sa moleculară nu se suprapune cu cea a lanțurilor de hemoglobină sau a oligomerilor de hemoglobină în tiparul electroforetic. La cei trei pacienți cu RTT examinați, s-a observat o creștere semnificativă din punct de vedere statistic a raportului sirtuin-3/GAPDH pentru fiecare pacient în parte, în raport cu același raport în lizații de hematii sănătoase (p < 0. 001) (Fig. suplimentară S4).

Acești trei pacienți, toți purtători ai mutației MeCP2 (adică R255X), au prezentat cel mai rău fenotip, cu un procent foarte mare de hematii care prezentau cel puțin 1 mitocondrie. Cu toate acestea, numărul foarte limitat de pacienți pe care l-am avut la dispoziție a făcut dificilă formularea unei concluzii semnificative din punct de vedere statistic cu privire la posibilitatea existenței unei relații între gravitatea bolii și gradul de retenție a mitocondriilor în interiorul globulelor roșii mature. Un alt aspect, care pare a fi demn de menționat, este faptul că retenția mitocondriilor în interiorul eritrocitelor mature în modelele murine Ulk1-/- și Nix-/-, citate anterior, a condus la anemie sau la alte patologii ale sângelui determinate probabil de eliminarea crescută a acestor eritrocite anormale de către macrofagele din splină32,33. La pacienții cu RTT înrolați în acest studiu, s-a înregistrat doar o scădere foarte limitată și nesemnificativă din punct de vedere statistic a valorilor hematologice, iar aceștia nu păreau să fie anemici sau să sufere de alte patologii ale sângelui. Discrepanța dintre rezultatele noastre și cele din modelele murine s-ar putea datora faptului că blocarea genelor macroautofagiei sau mitofagiei (adică șoarecii Ulk1-/- și, respectiv, Nix-/-) induce un procent foarte ridicat de globule roșii care rețin mitocondrii și reținerea mai multor organite în interiorul globulelor roșii, ceea ce reprezintă un defect considerabil mai grav în comparație cu cel documentat la pacienții cu RTT32,33. Chiar dacă am observat un număr semnificativ ridicat de hematii care rețin mitocondrii la pacienții purtători ai mutației R255X (Fig. 4), numărul de organite din fiecare celulă a fost foarte scăzut în hematii RTT (Fig. 4). Acest lucru ar putea să nu fie suficient pentru a determina alterări morfologice și funcționale majore în RBC-uri. Merită menționat faptul că, deși retenția mitocondrială în interiorul RBC-urilor ar putea fi cel puțin un factor care să determine dezechilibrul redox sever observat în RTT RBCs în asociere cu o schimbare semnificativă a stării energetice și a metabolismului (i.e, raportul ATP/ADP și NADH/NAD), studii recente au raportat că cinetica de legare a oxigenului de hemoglobină și de difuzie a oxigenului aproape se suprapune cu cea a pacienților sănătoși16,17,23,41.

Discrepanța aparentă dintre rezultatele noastre și cele derivate din modelele murine și-ar putea găsi o explicație și în faptul că sindromul RTT este o afecțiune legată de cromozomul X care afectează aproape exclusiv sexul feminin, iar inactivarea uneia dintre cele două copii ale cromozomului X (XCI) este un fenomen aleatoriu care apare în timpul embriogenezei, așa cum este documentat pe scară largă42,43. Astfel, în cazul sindromului RTT, ar fi de așteptat ca XCI aleatoriu să producă, în celulele somatice, un mozaicism cu jumătate din celule exprimând alela de tip sălbatic, iar cealaltă jumătate exprimând alela mutantă a genei MeCP2. În mod interesant, posibilitatea ca cel puțin unele mutații MeCP2 să fie asociate cu un XCI nealeatoriu în țesutul neuronal este în concordanță cu variabilitatea fenotipică a pacienților cu RTT (și, de asemenea, pentru cazurile familiare de RTT), o caracteristică care a fost documentată pe larg42,43. Teoretic, dacă jumătate dintre progenitorii hematologici din măduva osoasă păstrează cromozomul X purtător al mutației MeCP2, doar jumătate dintre globulele roșii mature circulante ar purta alela patologică, limitând astfel numărul de globule roșii circulante care păstrează mitocondrii. Cu toate acestea, s-a observat o prevalență crescută a XCI nealeatorie în favoarea alelei de tip sălbatic în leucocitele circulante la pacienții cu RTT sporadic42,43. În ceea ce privește acest aspect, ar fi foarte dificil să se stabilească dacă pacienții care prezintă sau nu un număr scăzut de globule roșii care conțin mitocondrii prezintă, de asemenea, o afectare mai puțin semnificativă a mitofagiei sau a XCI nealeatoare, ceea ce ar duce la selectarea pozitivă a progenitorilor hematologici care poartă alela MeCP2 de tip sălbatic.

În consecință, având în vedere complexitatea patologiei RTT, preferăm să afirmăm că pacienții cu RTT, împreună cu pacienții afectați de sindromul Pearson, ar putea reprezenta primele cazuri de retenție a mitocondriilor în hematii mature umane44.

Evidența autofagiei defectuoase în cerebelul șoarecilor Mecp2-null

Din moment ce RTT este o tulburare de neurodezvoltare, pentru a susține și mai mult rezultatele noastre care indică o autofagie defectuoasă sistemică, am efectuat analize imuno-histochimice pentru p62 și ubiquitină din cerebel (i.adică un organ în care au fost observate alterări ale mitocondriilor și alte anomalii histologice majore)21,45 de la șoareci de tip sălbatic în vârstă de 9 săptămâni și de la șoareci Mecp2 -/y în vârstă de 5 săptămâni (asimptomatici) și 9 săptămâni (simptomatici). Pentru fiecare condiție experimentală, a fost analizat organul izolat de la trei animale. Comparativ cu wt, cerebelul RTT a prezentat o creștere a intensității colorării p62 (Fig. 5a) și Ub (Fig. 5b) în toate straturile (adică granule, Purkinje și straturile corticale), care a fost liniară cu vârsta animalelor. Mai mult, structurile hipercolorate semănau cu agregatele intracelulare. Conform evaluării semicantitative a intensității colorării fie a p62/SQSTM1, fie a Ub, diferențele dintre cerebelul animalelor de 5 săptămâni față de cel al animalelor sănătoase și al animalelor de 9 săptămâni față de cele de 5 săptămâni au fost semnificative din punct de vedere statistic (p < 0.05).

Diferența histologică dintre animalele asimptomatice și cele simptomatice sugerează că alterarea autofagiei ar putea fi absentă sau slabă la naștere, în timp ce aceasta se intensifică progresiv în primele săptămâni de viață (și posibil atunci când activitatea MeCP2 atinge un vârf), dând naștere la simptome.