Alai

Medicina de laborator a făcut progrese semnificative în ultimele două decenii. Testele de încărcare virală au evoluat de la testele nested PCR la amplificarea mediată de transcripție la PCR în timp real și continuă să evolueze cu metode precum PCR digitală. Aceste progrese au dus la teste de încărcare virală mai sensibile, cu un interval dinamic mai larg, ceea ce permite medicilor o mai bună înțelegere a răspunsului pacientului la terapie și a evoluției bolii.

Un exemplu de îmbunătățire a managementului pacienților odată cu progresul diagnosticului molecular a fost managementul pacienților cu HIV-1. Conform ghidurilor de tratament actuale, succesul tratamentului este definit ca fiind o concentrație de ARN HIV-1 sub 75 de copii/mL.1 Definiția eșecului tratamentului variază în funcție de ghidurile globale, naționale și specifice fiecărei țări, dar este de obicei definită ca fiind o concentrație de ARN HIV-1 între 50-1000 de copii/mL.1-3

Aceste limite de tratament se află la capătul inferior al intervalului dinamic al testelor PCR în timp real, unde precizia și reproductibilitatea pot fi puse la încercare. Factorii care ar putea influența performanța testelor de determinare a încărcăturii virale sunt platforma automatizată, chimia de extracție a acidului nucleic, selecția și designul amorselor/sondei PCR, condițiile de amplificare PCR și strategia de calibrare a testelor. Aici vom trece în revistă diferite abordări de proiectare și impactul lor potențial asupra performanței testului și a rezultatelor clinice. (Figura 1)

Procesul de extracție

Unitatea trebuie să ia în considerare cu atenție tipul de probă și analitul atunci când selectează chimia de extracție. De exemplu, în cazul HIV-1, Departamentul de Sănătate și Servicii Umane (DHHS) recomandă ca ARN-ul HIV-1 să fie utilizat ca marker al viremiei HIV-1.1

Distincția dintre ARN-ul HIV-1 și ADN proviral este importantă, deoarece acesta din urmă nu este un marker al replicării virale active, ci mai degrabă al eliberării rezervorului latent din virus, care a fost deja integrat în celule. O chimie de extracție care purifică atât ARN-ul HIV-1, cât și ADN-ul proviral nu ar oferi medicului o reprezentare exactă a replicării virale reale; prin urmare, în cazul acestui virus, ar trebui să se utilizeze doar chimia de extracție care purifică în mod specific ARN-ul HIV-1 pentru a exclude ADN-ul proviral din cuantificarea din aval.

În mod alternativ, utilizarea chimiei de extracție a acidului nucleic total (TNA) pentru cuantificarea HIV-1 ar putea duce potențial la rezultate fals pozitive sau la o cuantificare inexactă, ceea ce ar avea efecte adverse asupra managementului pacientului. Chimia de extracție TNA poate fi utilizată pentru tipuri de probe mai dificile, cum ar fi urina sau scaunul, sau pentru testele care trebuie să detecteze ambele ținte ARN/ADN.

Selecția țintei

Diversitatea virală extremă întâlnită în rândul tulpinilor HIV, VHB și VHC reprezintă o preocupare extremă pentru a se asigura că testele de diagnostic molecular (MDx) dau rezultatul corect, indiferent de tulpina (tulpinile) prezentă (prezente) într-o probă.

Pentru a aborda această preocupare, proiectarea optimă a testului ar trebui să înceapă cu selectarea primerului/țintei sondei într-o regiune conservatoare din punct de vedere genetic, unde diversitatea virală va avea cel mai mic impact potențial. Regiunile conservatoare din punct de vedere genetic pot fi determinate numai prin compararea secvențelor din diverse tulpini virale.

Pentru a răspunde acestei necesități, un program de supraveghere globală este esențial pentru a evalua în mod cuprinzător diversitatea virală existentă în circulație pentru tulpinile HIV, VHB și VHC.4 Într-un program de supraveghere, secvențele generate din tulpini colectate în regiuni diverse din punct de vedere geografic sunt utilizate pentru a determina ce regiuni ale unui genom viral sunt cele mai bine conservate și se pretează la detectarea printr-un test de diagnostic molecular. Prin utilizarea secvențelor virale circulante pentru a informa proiectarea testelor, riscul ca tulpinile să fie ratate de un test este redus semnificativ.

Proiectarea sondei și condițiile de ciclizare a PCR

În plus față de selectarea regiunii țintă, proiectarea sondei și condițiile de ciclizare a PCR sunt critice atunci când căutăm să asigurăm o cuantificare precisă a încărcăturii virale. Proiectarea sondei trebuie să fie tolerantă la polimorfismele care apar în mod natural și, la rândul lor, la potențialele nepotriviri care pot apărea în regiunea țintă dată. De-a lungul timpului, tehnologia sondei a evoluat, la fel ca și metodologia PCR. Gama mai largă de aplicații MDx bazate pe tehnologia PCR, dincolo de cuantificarea virală, necesită utilizarea unor modele de sonde diferite. Sondele de legare a șanțurilor minore sunt utilizate de obicei pentru genotiparea și detectarea polimorfismului nucleotidic unic.

Sondele TaqMan sunt adesea utilizate în testele în care regiunile țintă au un grad ridicat de conservare. Sondele parțial bicatenare, care tolerează mai bine nivelurile ridicate de eterogenitate genetică, în principal din cauza lungimii sondei și a condițiilor de legare, sunt utilizate în zonele în care există un grad ridicat de eterogenitate.5

În plus față de proiectarea sondei, condițiile de ciclare fac adesea obiectul optimizării proiectării, pentru a atinge cerința de performanță (de exemplu, toleranța la potențiale nepotriviri.) Ciclarea cu potrivire de fază este o abordare care încorporează cicluri la o temperatură mai scăzută pentru a reduce stringența inițială, care este urmată de cicluri la temperaturi ridicate pentru a păstra specificitatea. Această abordare atenuează efectul advers asupra cuantificării probei prin potențialele nepotriviri ale amorselor. În cazul în care este dificil de evitat impactul semnificativ al polimorfismelor rare, detectarea unei a doua ținte poate fi încorporată în proiectarea analizei. Atunci când diversitatea secvenței afectează detectarea unei regiuni a genomului viral, detectarea unei a doua regiuni asigură obținerea unui rezultat precis. Având în vedere complexitatea testelor moleculare și nivelul ridicat de diversitate virală, la proiectarea testelor moleculare ar trebui să se ia în considerare o abordare cuprinzătoare de utilizare a supravegherii globale și de proiectare a sondei specifice unei ținte. Simpla adaptare a unei strategii, cum ar fi cea cu dublă țintă, poate oferi un fals sentiment de siguranță.

Strategia de calibrare

Strategia de calibrare este o componentă integrantă a proiectării testelor moleculare și este esențială pentru asigurarea reproductibilității pe un interval dinamic larg. Majoritatea metodologiilor cantitative pentru managementul terapiei utilizează în prezent o curbă de calibrare externă pentru a determina concentrația unui analit.

În aceste teste, semnalul analitului din proba unui pacient este comparat cu un set de probe cu o concentrație cunoscută și se utilizează o regresie liniară simplă (y=mx+b) pentru a calcula încărcătura virală. Această abordare utilizează de obicei calibratori care sunt procesați ca și probele pacientului prin întregul proces, permițând calibrarea atât a reactivilor de extracție și de amplificare, cât și a instrumentelor.

Alternativ, ar putea fi utilizați calibratori care nu sunt procesați prin extracție, însă această abordare prezintă riscul ca diferența de recuperare sau o schimbare în compoziția reactivului să nu fie luată în considerare, ceea ce ar putea duce la diferențe în cuantificare.

O altă strategie mai puțin frecvent utilizată este un etalon cantitativ intern. Această aplicație utilizează o linie de regresie polinomială de ordinul 3 (y = ax3 + bx2 + cx + d) pe tot intervalul liniar, cu o diferență maximă admisibilă față de liniaritate. Studii anterioare au sugerat că diferența admisibilă acceptabilă față de liniaritate pentru unele dintre teste a fost de ± 0,2 Log10.6 Această diferență admisibilă față de liniaritate și abordarea de calibrare explică, de asemenea, părtinirea adesea observată între metodologii, precum și imprecizia mai mare la capătul inferior al intervalului dinamic, unde se iau adesea decizii clinice.

Concluzie

Performanța exactă și precisă a testelor moleculare este esențială pentru gestionarea adecvată a terapiei. Rezultatele inexacte ale încărcăturii virale ar putea duce la un management necorespunzător, iar pacientul poate fi lăsat pe o terapie nereușită. Acest diagnostic greșit are implicații mult mai largi decât managementul unui singur pacient, deoarece ar putea duce, de asemenea, la o creștere a transmiterii tulpinii virale rezistente. Din perspectiva gestionării terapiei, un virus cu mutații asociate cu rezistența este mai dificil de tratat cu opțiuni terapeutice mai restrânse. În plus, ratele fals-pozitive pot adăuga costuri inutile pentru repetarea testelor sau teste de rezistență mai costisitoare, precum și anxietate pentru pacient și medic.

1. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV elaborat de Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Accesat în septembrie 2019.
2. Societatea Clinică Europeană SIDA (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
3. National Department of Health, South Africa, aprilie 2015, accesat la 2 august 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
4. Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development. Jurnalul de virologie medicală. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
5. Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Sonde de ADN liniar parțial bicatenar: design nou pentru detectarea sensibilă a țintelor polimorfe din punct de vedere genetic. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
6. Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Dezvoltarea unei a doua versiuni a testului cantitativ Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan pentru virusul hepatitei C cu o incluziune îmbunătățită a genotipurilor. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.

Recunoaștere: Autorul ar dori să recunoască și să le mulțumească lui Mary Rodgers și Shihai Huang pentru revizuirea acestui articol.