Alai

Coronavirusurile au provocat două pandemii de amploare în ultimele două decenii, SARS și sindromul respirator din Orientul Mijlociu (MERS)8,9. În general, s-a considerat că SARSr-CoV – care se găsește în principal la lilieci – ar putea provoca o viitoare epidemie de boală10,11. Aici raportăm o serie de cazuri cauzate de un focar neidentificat de pneumonie în Wuhan, provincia Hubei, China centrală. Acest focar de boală – care a pornit de la o piață locală de fructe de mare – a crescut substanțial, ajungând să infecteze 2.761 de persoane în China, este asociat cu 80 de decese și a dus la infectarea a 33 de persoane din alte 10 țări până la 26 ianuarie 202012. Simptomele clinice tipice ale acestor pacienți sunt febră, tuse uscată, dificultăți de respirație (dispnee), dureri de cap și pneumonie. Debutul bolii poate duce la insuficiență respiratorie progresivă din cauza leziunilor alveolare (așa cum se observă prin imaginile de tomografie computerizată toracică transversală) și chiar la deces. Medicii au stabilit că boala a fost cauzată de o pneumonie indusă de un virus, în funcție de simptomele clinice și de alte criterii, inclusiv creșterea temperaturii corporale, scăderea numărului de limfocite și de globule albe (deși nivelurile acestora din urmă erau uneori normale), noi infiltrate pulmonare pe radiografia toracică și nicio ameliorare evidentă după tratamentul cu antibiotice timp de trei zile. Se pare că cele mai multe dintre primele cazuri au avut antecedente de contact cu piața inițială de fructe de mare; cu toate acestea, boala a progresat acum pentru a fi transmisă prin contact de la om la om.

Eșantioane de la șapte pacienți cu pneumonie severă (dintre care șase sunt vânzători sau curieri de la piața de fructe de mare), care au fost internați la unitatea de terapie intensivă a spitalului Wuhan Jin Yin-Tan la începutul epidemiei, au fost trimise la laboratorul Institutului de Virologie din Wuhan (WIV) pentru diagnosticarea agentului patogen cauzal (Extended Data Table 1). În calitate de laborator care investighează CoV, am folosit mai întâi primeri PCR pan-CoV pentru a testa aceste probe13, având în vedere că focarul a avut loc iarna și într-o piață – același mediu ca și infecțiile SARS. Am constatat că cinci probe au fost pozitive la PCR pentru CoV. Un eșantion (WIV04), colectat din lichidul de lavaj bronhoalveolar (BALF), a fost analizat prin analiză metagenomică folosind secvențierea de generație următoare pentru a identifica potențialii agenți etiologici. Din totalul de 10 038 758 de citiri – dintre care 1 582 de citiri totale au fost reținute după filtrarea citirilor din genomul uman – 1 378 (87,1 %) de secvențe au corespuns secvenței SARSr-CoV (Fig. 1a). Prin asamblare de novo și PCR direcționată, am obținut un genom CoV de 29 891 de perechi de baze care avea o identitate de secvență de 79,6 % cu SARS-CoV BJ01 (număr de acces GenBank AY278488.2). O acoperire ridicată a genomului a fost obținută prin refacerea citirilor totale la acest genom (Extended Data Fig. 1). Această secvență a fost transmisă la GISAID (https://www.gisaid.org/) (număr de acces EPI_ISL_402124). Urmând denumirea dată de Organizația Mondială a Sănătății (OMS), îl numim în mod provizoriu noul coronavirus 2019 (2019-nCoV). Alte patru secvențe complete ale genomului 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 și WIV07) (numere de acces GISAID EPI_ISL_402127-402130), care au fost identice între ele în proporție de peste 99,9 %, au fost obținute ulterior de la alți patru pacienți prin secvențiere de generație următoare și PCR (Extended Data Table 2).

Genomul virusului este format din șase cadre deschise de citire (ORF) majore care sunt comune coronavirusurilor și o serie de alte gene accesorii (Fig. 1b). O analiză suplimentară indică faptul că unele dintre genele 2019-nCoV au avut o identitate de secvență nucleotidă mai mică de 80 % cu SARS-CoV. Cu toate acestea, secvențele de aminoacizi ale celor șapte domenii conservate ale replicazei din ORF1ab, care au fost utilizate pentru clasificarea speciilor de CoV, au fost identice în proporție de 94,4 % între 2019-nCoV și SARS-CoV, ceea ce sugerează că cele două virusuri aparțin aceleiași specii, SARSr-CoV.

Am constatat apoi că o regiune scurtă a ARN-polimerazei ARN-dependente (RdRp) de la un coronavirus de liliac (BatCoV RaTG13) – care a fost detectat anterior la Rhinolophus affinis din provincia Yunnan – a prezentat o identitate de secvență ridicată cu 2019-nCoV. Am efectuat secvențierea în lungime completă a acestui eșantion de ARN (număr de acces GISAID EPI_ISL_402131). Analiza Simplot a arătat că 2019-nCoV era foarte asemănător în întregul genom cu RaTG13 (Fig. 1c), cu o identitate globală a secvenței genomului de 96,2 %. Utilizând secvențele aliniate ale genomului 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV și SARSr-CoV de liliac raportate anterior, în genomul 2019-nCoV nu a fost detectată nicio dovadă de evenimente de recombinare. Analiza filogenetică a genomului complet și a secvențelor genice ale RdRp și spike (S) a arătat că – pentru toate secvențele – RaTG13 este cea mai apropiată rudă a 2019-nCoV și formează o linie distinctă față de alți SARSr-CoV (Fig. 1d și Extended Data Fig. 2). Proteina spike de legare a receptorului codificată de gena S a fost foarte divergentă față de alte CoV (Extended Data Fig. 2), cu mai puțin de 75 % identitate de secvență nucleotidă cu toate SARSr-CoV-urile descrise anterior, cu excepția unei identități de 93,1 % nucleotidă cu RaTG13 (Extended Data Table 3). Genele S ale 2019-nCoV și RaTG13 sunt mai lungi decât ale altor SARSr-CoV-uri. Diferențele majore în secvența genei S a 2019-nCoV sunt cele trei inserții scurte în domeniul N-terminal, precum și modificări în patru din cinci reziduuri cheie din motivul de legare la receptor, comparativ cu secvența SARS-CoV (Extended Data Fig. 3). Este necesar să se studieze în continuare dacă inserțiile din domeniul N-terminal al proteinei S a 2019-nCoV conferă o activitate de legare a acidului sialic, așa cum se întâmplă în cazul MERS-CoV. Relația filogenetică apropiată cu RaTG13 oferă dovezi că 2019-nCoV ar putea proveni de la lilieci.

Am dezvoltat rapid o metodă de detecție bazată pe qPCR pe baza secvenței domeniului de legare a receptorului din gena S, care a fost cea mai variabilă regiune a genomului (Fig. 1c). Datele noastre arată că primerii ar putea diferenția 2019-nCoV de toate celelalte coronavirusuri umane, inclusiv SARSr-CoV WIV1 de liliac, care are o identitate de 95 % cu SARS-CoV (Extended Data Fig. 4a, b). Dintre probele obținute de la cei șapte pacienți, am constatat că șase probe de BALF și cinci probe de tampoane orale au fost pozitive pentru 2019-nCoV în timpul primei prelevări de probe, așa cum au fost evaluate prin qPCR și PCR convențională. Cu toate acestea, nu am mai putut detecta probe pozitive la virus în tampoanele orale, tampoanele anale și probele de sânge prelevate de la acești pacienți în timpul celei de-a doua prelevări (Fig. 2a). Cu toate acestea, recomandăm utilizarea altor ținte qPCR, inclusiv a genelor RdRp sau a genelor de înveliș (E), pentru detectarea de rutină a 2019-nCoV. Pe baza acestor constatări, propunem că boala ar putea fi transmisă pe cale aeriană, deși nu putem exclude alte posibile căi de transmitere, deoarece sunt necesare investigații suplimentare, incluzând mai mulți pacienți.

Pentru detectarea serologică a 2019-nCoV, am utilizat o proteină nucleocapsidă (N) dezvoltată anterior din SARSr-CoV Rp3 de liliac ca antigen pentru testele imunoenzimatice (ELISA) IgG și IgM, deoarece această proteină a împărtășit 92% identitate de aminoacizi cu proteina N a 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) și nu a prezentat reactivitate încrucișată față de alte coronavirusuri umane, cu excepția SARSr-CoV7. Am reușit să obținem doar cinci probe de ser de la cei șapte pacienți cu infecții virale. Am monitorizat nivelul anticorpilor virali la un pacient (ICU-06) la 7, 8, 9 și 18 zile de la debutul bolii (Extended Data Table 2). S-a observat o tendință clară în ceea ce privește titlurile IgG și IgM, care au crescut în timp, cu excepția faptului că titlul IgM a scăzut în ultima probă (Fig. 2b). Ca o a doua analiză, am testat probele de la 5 dintre cei 7 pacienți pozitivi la virus în jurul a 20 de zile de la debutul bolii pentru prezența anticorpilor virali (Extended Data Tables 1, 2). Toate probele pacienților – dar nu și probele de la persoane sănătoase – au fost puternic pozitive pentru IgG virale (Fig. 2b). Au existat, de asemenea, trei probe pozitive la IgM, ceea ce indică o infecție acută.

Apoi am izolat cu succes virusul (denumit 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) atât din celulele Vero E6, cât și din celulele Huh7, folosind proba de BALF a pacientului ICU-06. S-au observat efecte citopatogene clare în celule după incubare timp de trei zile (Extended Data Fig. 6a, b). Identitatea tulpinii WIV04 a fost verificată în celulele Vero E6 prin microscopie cu imunofluorescență cu ajutorul anticorpului N viral reactiv încrucișat (Extended Data Fig. 6c, d) și prin secvențiere metagenomică, majoritatea citirilor fiind asociate cu 2019-nCoV, iar analiza qPCR a arătat că încărcătura virală a crescut din ziua 1 până în ziua 3 (Extended Data Fig. 6e, f). Particulele virale din secțiunile ultrasubțiri ale celulelor infectate au prezentat o morfologie tipică de coronavirus, așa cum a fost vizualizată prin microscopie electronică (Extended Data Fig. 6g). Pentru a confirma în continuare activitatea de neutralizare a probelor virale IgG-pozitive, am efectuat teste de seroneutralizare în celule Vero E6 folosind cele cinci seruri de pacienți care au fost IgG-pozitive. Demonstrăm că toate probele au fost capabile să neutralizeze 100 TCID50 (50 % din doza infecțioasă de cultură tisulară) de 2019-nCoV la o diluție de 1:40-1:80. De asemenea, arătăm că acest virus ar putea fi neutralizat în mod încrucișat de serul anti-SARS-CoV de cal (cadou de la L.-F. Wang) la diluții de 1:40; cu toate acestea, potențialul de reactivitate încrucișată cu anticorpii anti-SARS-CoV trebuie confirmat cu ser anti-SARS-CoV de la oameni (Extended Data Table 4).

Se știe că ACE2 este un receptor celular pentru SARS-CoV14. Pentru a determina dacă 2019-nCoV utilizează, de asemenea, ACE2 ca receptor de intrare celulară, am efectuat studii de infectivitate a virusului folosind celule HeLa care au exprimat sau nu proteinele ACE2 de la oameni, lilieci chinezi cu potcoavă, civet, porci și șoareci. Am arătat că 2019-nCoV este capabil să utilizeze toate proteinele ACE2, cu excepția ACE2 de șoarece, ca receptor de intrare pentru a intra în celulele care exprimă ACE2, dar nu și în celulele care nu au exprimat ACE2, ceea ce indică faptul că ACE2 este probabil receptorul celular prin care 2019-nCoV intră în celule (Fig. 3). De asemenea, arătăm că 2019-nCoV nu utilizează alți receptori de coronavirus, cum ar fi aminopeptidaza N (APN) și dipeptidil peptidaza 4 (DPP4) (Extended Data Fig. 7).

Studiul oferă un raport detaliat despre 2019-nCoV, agentul etiologic probabil responsabil pentru epidemia actuală de sindrom respirator acut din China și din alte țări. La toți pacienții testați a fost observată seroconversia nucleotidă-pozitivă specifică virusului și sero-proteină virală și oferă dovezi ale unei asocieri între boală și prezența acestui virus. Cu toate acestea, există încă multe întrebări urgente la care trebuie să se răspundă. Asocierea dintre 2019-nCoV și boală nu a fost verificată prin experimente pe animale care să îndeplinească postulatele lui Koch pentru a stabili o relație cauzală între un microorganism și o boală. Nu cunoaștem încă rutina de transmitere a acestui virus între gazde. Se pare că virusul devine din ce în ce mai transmisibil între oameni. Ar trebui să monitorizăm îndeaproape dacă virusul continuă să evolueze pentru a deveni mai virulent. Din cauza lipsei de tratamente specifice și având în vedere înrudirea 2019-nCoV cu SARS-CoV, unele medicamente și vaccinuri preclinice împotriva SARS-CoV ar putea fi probabil utilizate pentru a trata acest virus. În cele din urmă, având în vedere răspândirea largă a SARSr-CoV în rezervoarele lor naturale, cercetările viitoare ar trebui să se concentreze asupra supravegherii active a acestor virusuri pentru regiuni geografice mai largi. Pe termen lung, ar trebui să se pregătească medicamente antivirale cu spectru larg și vaccinuri pentru bolile infecțioase emergente care sunt cauzate de acest grup de virusuri în viitor. Cel mai important, ar trebui implementate reglementări stricte împotriva domesticirii și consumului de animale sălbatice.

Nota adăugată în probă: De când această lucrare a fost acceptată, ICTV a desemnat virusul ca fiind SARS-CoV-215; în plus, OMS a publicat numele oficial al bolii cauzate de acest virus, care este COVID-1916.

.