Alai

Abstract

Artrita reumatoidă (AR) este o boală autoimună. Veninul de viespe (WV), care este considerat ca fiind un medicament popular tradițional în naționalitatea Jingpo din Yunnan, China, ameliorează artrita reumatoidă. Studiul actual a avut ca scop investigarea efectului veninului de viespe care ameliorează simptomele artritei reumatoide la șobolanii experimentali. Am stabilit un model de artrită indusă de colagen de tip II (CII-) la șobolani SD și am examinat inhibarea inflamației și a răspunsului autoimunitar. Efectele antiartritice ale WV au fost evaluate prin intermediul umflăturii labei piciorului, iar scorul histopatologic și modificările histopatologice ale labei afectate au fost evaluate. Efectele antiinflamatorii au fost analizate prin nivelul de IL-6, TNF-α, IL-1β și numărul de celule inflamatorii din sângele periferic. Modificarea raportului subsetului de celule T în splina șobolanilor a fost detectată prin citometrie în flux și, în același timp, au fost evaluate indicele visceral și nivelurile de imunoglobulină serică. Rezultatele au sugerat că diferite doze de WV (0,125, 0,25 și 0,5 mg/kg) au atenuat în mod semnificativ umflarea labei piciorului și scorul de artrită la șobolanii CIA față de controlul netratat (). WV (0,25 și 0,5 mg/kg) a ameliorat leziunile țesutului sinovial al articulațiilor gleznei și scorurile histopatologice ale hiperplaziei sinoviocitelor și ale infiltrației celulelor inflamatorii cu grupul vehicul (). În ceea ce privește reglarea imunologică, 0,5 mg/kg WV a scăzut nivelul imunoglobulinei serice () și am constatat, de asemenea, că WV (0,5 mg/kg) a suprimat răspunsul imunitar al celulelor Th, în timp ce a îmbunătățit în mod semnificativ funcțiile celulelor Tc și ale celulelor Treg din celulele splinei (). Acțiunea imunosupresoare a WV afișată a fost analogă cu efectul său inhibitor asupra nivelurilor IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 și PGE2 în serul de șobolan. În concluzie, aceste constatări au demonstrat că WV a prezentat o activitate antiartritică, care ar putea fi asociată cu efectele lor inhibitoare asupra imunoregularității și acțiunii antiinflamatorii.

1. Introducere

Artrita reumatoidă (AR) este o boală autoimună cronică care poate evolua spre complicații sistemice, dizabilități fizice și chiar moarte precoce . Hiperplazia celulelor sinoviale, inflamația cronică a sinovialei și distrugerea cartilajului și a oaselor sunt principalele caracteristici ale AR. În plus, efectele sinergice ale celulelor T, ale celulelor B și ale citokinelor proinflamatorii joacă, de asemenea, roluri-cheie în procesul fiziopatologic . Atunci când celulele T CD4+ sunt activate, acestea produc citokine proinflamatorii care sporesc răspunsul imunitar prin stimularea altor celule mononucleare, a fibroblastelor sinoviale, a condrocitelor și a osteoclastelor. Eliberarea acestor citokine proinflamatorii, în special TNF-α, IL-6 și IL-1β, poate contribui la sinovită .

În prezent, medicamentele de tratament clinic utilizate pentru tratarea AR se concentrează în principal pe reducerea mediatorilor inflamatori, cum ar fi medicamentele antiinflamatorii nesteroidiene (AINS), medicamentele antireumatice modificatoare de boală (DMARD) și agenții biologici. De exemplu, metotrexatul (MTX), un analog al folatului, ca AINS, a fost aprobat de FDA pentru AR în 1988 . În plus, acesta a devenit cel mai utilizat pe scară largă în tratamentul RA datorită activității sale imunosupresoare, efectului antiinflamator și costului redus . Cu toate acestea, MTX nu este un agent terapeutic ideal pentru efectele sale secundare nedorite asupra sistemului neuronal, gastrointestinal și imunitar, la fel ca și alte medicamente . De aceea, un număr tot mai mare de persoane caută noi alternative pentru a rezolva ineficiența și siguranța acestor medicamente. În teoria medicinii tradiționale chineze (TCM), RA este considerată a fi unul dintre sindroamele de artralgii („Bi Zheng” în TCM), posibil cauzat de vânt exogen, umezeală și agenți patogeni de căldură sau frig . Aplicarea MTC în prevenirea și tratamentul bolilor are o istorie de mai multe secole, creșterea importanței în tratamentul AR fiind atribuită eficacității sale remarcabile, dar cu mai puține efecte secundare și costuri .

Terapia cu venin, ca o abordare de medicină complementară și alternativă, a fost utilizată timp de mai multe secole pentru a trata durerea, inflamația și artrita în medicina populară . Încă din perioada statelor războinice, în Canonul interior al Împăratului Galben („Huangdi Neijing” în chineză) este consemnat că „înțepătura de albine este terapeutică în ciuda riscului toxic suferit”. Conform cercetărilor medicale moderne, veninul de albine (BV) prezintă efecte antiartritice, antiinflamatorii și analgezice atribuibile activării inhibitorului central și modulării sistemului imunitar prin mecanisme multiple . Mai multe studii clinice au arătat, de asemenea, că BV ar putea ameliora simptomele legate de artrită .

Veninul de albine conține o varietate de constituenți biologic activi, inclusiv amine biogene, substanțe cu masă moleculară mare (cum ar fi enzime, alergeni și peptide bioactive) și toxine poliamină. Veninul de viespe a prezentat diverse efecte farmacologice în tratamentul durerii, al bolilor inflamatorii și al bolilor neurodegenerative . Vespa magnifica (Smith) este un tip de viespe socială, întâlnită în Yunnan, China . În ultimii ani, mulți compuși cu activități anticoagulante, antiplachetare, antiinflamatoare și imunosupresoare au fost separați din veninul lor . Pe baza efectului său remarcabil asupra artritei reumatoide, a devenit un obicei de a fi utilizat pe scară largă în Jingpo, o minoritate națională chineză . Cu toate acestea, din câte știm, au existat doar câteva rapoarte privind acțiunile antireumatismale ale veninului de viespe.

În lucrarea actuală, modelul de artrită indusă de colagen (CIA) a fost adoptat pentru a reproduce îndeaproape patogeneza AR. Modificările volumului labei piciorului au fost utilizate în mod clasic pentru evaluarea efectelor antiinflamatorii asupra RA ca de obicei . Mai mult, am evaluat efectul WV (venin de viespe de Vespa magnifica) în același model. În cele din urmă, eficacitatea WV asupra antiinflamării și imunomodulării au fost observate prin colorația H&E a țesutului articular, citometria în flux a subseturilor de celule T din splină, precum și ELISA a serului IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 și a factorilor reumatoizi (IgG, IgA și IgM).

2. Materiale și metode

2.1. Animale experimentale

Șobolani SD masculi (60 de șobolani, 180-220 g) au fost obținuți de la Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co. Animalele au fost adăpostite în cuști standard din polipropilenă căptușite cu coajă crudă (reînnoită după 48 h). Adăpostul pentru animale a fost menținut pe un ciclu lumină/întuneric de 12 ore, la o temperatură de aproximativ 22 ± 2°C și o umiditate relativă de 60-70%, iar animalele au avut acces liber la apă și hrană standard. Șobolanii au fost repartizați în mod aleatoriu în 8 martori și 52 de modele, iar apoi s-a acordat o perioadă minimă de 7 zile pentru adaptarea la fiecare experiment. Toate procedurile experimentale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (National Institutes of Health) și au fost aprobate de către Comitetul de etică al Universității Dali.

2.2. Modelul animal al CIA și protocolul de tratament

Șobolanii au fost dezinfectați cu alcool și injectați subcutanat la nivelul vola pedisului drept, pe spate și pe coadă cu 1 mg/ml de emulgator CCII (colagen de tip II de pui) pentru prima imunizare, care este alcătuit din CCII (C9301, Sigma) emulsionat 1 : 1 cu adjuvant Freund incomplet (F5506, Sigma). Ziua de inducție a fost concepută ca fiind ziua 0. Doza de rapel a fost injectată din nou la nivelul abdomenului, spatelui și cozii împreună cu 1 ml de emulsifiant CCII în ziua 8. Piciorul injectat a fost definit ca picior inflamator, în timp ce celălalt picior fără injecție a fost notat ca picior secundar. Apoi, șobolanii cu artrită indusă de colagen (CIA) au fost tratați în ziua 14 și s-au încheiat în ziua 28. După debutul CIA, șobolanii model au fost împărțiți aleatoriu în cinci grupuri în funcție de scorurile clinice. Grupul I: grupul model care a primit o injecție hipodermică (1 ml/kg) de soluție salină normală ca vehicul. Grupurile II-IV: șobolanii CIA au primit o injecție hipodermică de 0,125, 0,25 și 0,5 mg/kg WV (venin de viespe, de la Vespa magnifica (Smith) din Yunnan, China, pulbere liofilizată obținută din exsudatul glandelor cozii de viespe , diluată cu soluție salină normală), respectiv, ca grupuri de tratament. Grupul V: grupul de control pozitiv a primit TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, nr. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) de 9 mg/kg în același mod. În același timp, același volum de soluție salină normală singură a fost administrat șobolanilor normali din grupul de control. Șobolanii de mai sus au avut parte de o administrare zilnică timp de 14 zile.

2.3. Evaluarea de bază a artritei experimentale

Severitatea CIA a fost evaluată periodic pe baza umflăturii labei piciorului și a scorurilor de artrită. Șobolanii au fost cântăriți în zilele 0-28 ale studiului, iar grosimea și perimetrul gleznelor la nivelul piciorului inflamator (piciorul drept) și al piciorului secundar (piciorul stâng) au fost măsurate separat cu ajutorul unui calibru vernier și a unei benzi în zilele 0, 14 și 28. Scorul de artrită a fost evaluat pe baza observațiilor independente a trei cercetători. Fiecare laba piciorului a fost notată pe o scară de 0-4, ceea ce înseamnă că scorul total maxim pentru ambele articulații ale labei posterioare a fost de 8. Criteriile de evaluare au fost următoarele: 0 = nici un edem sau modificări vizuale; 1 = edem ușor și eritem limitat; 2 = edem ușor și eritem; 3 = edem evident și eritem semnificativ; și 4 = edem sever și eritem extins . În ziua 28, animalele au fost sacrificate, iar apoi serul și articulațiile secundare ale gleznei au fost colectate și prelucrate pentru analize ulterioare.

2.4. Histopatologia articulațiilor gleznei

Membrele posterioare stângi, fără sacrificarea țesuturilor învecinate, au fost imediat spălate cu PBS de 2-3 ori, fixate cu 10% formalină timp de 48 h și decalcifiate cu acid azotic 5% timp de 24 h până când cortexul osos a fost parcurs cu ușurință cu vârful unui ac. Probele au fost încorporate în secțiuni de parafină și tăiate în felii (5 μm) pentru colorarea de rutină cu hematoxilină-eozină (H&E). Modificările patologice ale articulațiilor au fost detectate cu un microscop optic (Olympus, Japonia) și fotografiate. Fotografiile au fost realizate la o mărire de 200x. Au fost detectate, de asemenea, modificări ale hiperplaziei sinoviocitelor și ale infiltrației celulelor inflamatorii. Modificările histopatologice au fost punctate, respectiv, folosind următoarele criterii: 0 = nicio modificare detectabilă; 1 = ușoară; 2 = moderată; 3 = severă .

2,5. Analiza indicelui de viscere

Racii au fost sacrificați și ficatul, splina și timusul complete au fost rezecate cu țesutul adipos și fascia înconjurătoare separate cu grijă. Masa umedă a ficatului, a splinei și a timusului a fost măsurată cu ajutorul balanței electronice, iar indicele viscerelor (inclusiv indicele ficatului, al splinei și al timusului) a fost calculat în conformitate cu următoarea formulă. Indicele viscerelor = masa organului (mg)/masa corpului (g) × 100%.

2,6. ELISA a indicilor biochimici serici

Serul de la șobolanii experimentali a fost colectat, iar concentrațiile de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 și PGE2 au fost detectate cu ajutorul kiturilor de analiză imunoenzimatică (ELISA) (Nanjing JianCheng, China), conform instrucțiunilor producătorului. Kiturile ELISA pentru detectarea nivelurilor de expresie a IgA (ERC015), IgG (ERC016) și IgM (ERC017) au fost achiziționate de la NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, China.

2.7. Citometria în flux a splinei cu artrită

Numărul de subseturi de celule T a fost detectat cu ajutorul citometriei în flux. Limfocitele au fost recoltate din celule de splină de șobolan, care au fost omogenizate prin trecere printr-o sită de nailon cu 200 de ochiuri. Celulele au fost filtrate în tampon PBS care conține 10% ser fetal bovin. Concentrația celulară a fost ajustată la aproximativ 2 × 106/ml și s-au adăugat 3 ml de tampon de liză a globulelor roșii (Solarbio, China) pentru a dizolva globulele roșii timp de mai puțin de 5 minute. Apoi, celulele au fost centrifugate la 1200 rpm timp de 5 minute, spălate de două ori cu tampon FBS-PBS care conține 10% ser fetal bovin și apoi centrifugate la 1200 rpm timp de 5 minute. Fiecare 100 μL de suspensie celulară a fost plasată în tuburi de centrifugare. Limfocitele au fost urmărite prin colorare cu anti-CD3-FITC (nr. 557354; BD, SUA), anti-CD4-APC (nr. 565432; BD, SUA), anti-CD8-PerCP (nr. 558824; BD, SUA) și anti-CD25-PE (nr. 554866; BD, SUA). Anticorpii monoclonali au fost adăugați în fiecare tub, amestecați din nou și lăsați la gheață timp de 30 de minute. Tamponul FBS-PBS (1 ml) a fost adăugat în fiecare tub de probă și centrifugat la 1200 rpm timp de 5 minute, iar supernatantul a fost abandonat. Etapa anterioară a fost repetată de două ori, astfel încât celulele care nu se leagă de anticorpii monoclonali să fie eluate complet. Celulele experimentale au fost amestecate cu 500 μL de tampon FBS-PBS. Rapoartele de celule T CD25+/CD4+ și CD4+/CD8+ au fost determinate cu ajutorul unui citometru de flux FACS Canto (BD, SUA) .

2.8. Analize statistice

Datele au fost analizate statistic cu ajutorul SPSS10.0. Datele au fost prezentate ca medie ± deviația standard a mediei (S.D.M). Semnificația diferențelor dintre fiecare grup a fost analizată prin ANOVA unidirecțională urmată de un test Tukey. În special, scorul de artrită și scorul histopatologic au fost analizate prin testul Wilcoxon rank sum. Valorile de au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic.

3. Rezultate

3.1. WV a ameliorat simptomul artritei la șobolanii CIA

Simptomele artritice au fost induse cu succes la șobolani prin injectarea colagenului de tip II conform instrucțiunilor, ceea ce s-a concretizat în semne macroscopice semnificative de roșeață severă și umflături în articulația secundară a labei piciorului și a gleznei șobolanilor CIA din Figura1(a), dacă se compară cu grupul de control sănătos. Grosimea și perimetrul articulației gleznei au fost aparent crescute la vehicule în ziua 14 [Figura 1(b)] în comparație cu cele de la martori; cu toate acestea, acestea au fost reduse în mod izbitor după TwHF și toate grupurile tratate cu WV în ziua 28, în comparație cu cele ale grupului model (toate ) [Figura 1(b)]. Atunci când am măsurat grosimea și perimetrul articulațiilor gleznei atât la piciorul inflamator, cât și la piciorul secundar, s-a evidențiat scăderea evidentă a umflăturii pe baza datelor (Figura 1(b)). Rezultatele gradului de umflătură au indicat faptul că WV ar putea controla edemul labei piciorului și ar putea ameliora inflamația secundară pe laba piciorului și articulația gleznei, corespunzător efectului TwHF.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figura 1

Efectul WV asupra simptomelor artrozice ale fiecărui grup. (a) Gradul de umflare a labei la toate grupurile. (b) Grosimea și perimetrul articulațiilor gleznei atât la piciorul inflamator, cât și la piciorul secundar în rândul tuturor grupurilor. (c) Comparația scorului de artrită între toate grupurile.

În plus, scorul de artrită a fost diminuat cu grade diferite prin tratamentul cu WV în funcție de cantitatea de doză, așa cum se arată în figura 1(c). Scorul de artrită al grupului vehicul a fost de 6,5 ± 1,0 în ziua 14 (față de ziua 0, ). Indicele a scăzut semnificativ în grupul tratat cu TwHF în ziua 28, prezentând 2,8 ± 0,8 (față de ziua 14, ). În mod similar, scăderea indicilor de către WV a fost semnificativă și dependentă de doză (3,2 ± 0,6 la 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 la 0,25 mg/kg și 5,6 ± 0,7 la 0,125 mg/kg) (sever față de ziua 14, ). Acest lucru a indicat că potența WV la 0,5 mg/kg a fost proporțională cu cea a grupului tratat cu TwHF.

3.2. WV a ameliorat modificările patologice ale articulațiilor la șobolanii CIA

H&E colorarea (Figura 2(a)) a arătat că membrana sinovială a articulațiilor gleznei de la șobolanii de control avea un aranjament celular regulat, fără hiperplazie sinovială, fără infiltrare de celule inflamatorii și cu o suprafață cartilaginoasă netedă. În comparație, arhitectura histologică a articulațiilor la șobolanii din grupul vehicul a fost marcant anormală, cu infiltrație de celule imune, hiperplazie sinovială, număr crescut de vase și eroziune a cartilajului și a osului. Articulațiile din grupurile TwHF și WV au fost semnificativ atenuate față de cele ale grupului vehicul și s-au apropiat de cele ale grupului de control. Scorurile histopatologice (Figura 2(b)) au indicat (grupul vehicul) celula de mucoasă sinovială anormală și infiltrarea de celule inflamatorii în articulațiile artritice; tratamentele TwHF și WV au redus semnificativ scorul histopatologic mediu și au restaurat cartilajul în comparație cu grupul vehicul ().

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Efectele WV asupra progresiei artritei și a histologiei articulare la șobolanii CIA. (a) Histopatologia secțiunilor de țesut articular ale șobolanilor CIA tratați cu diferite doze de WV și TwHF și ale șobolanilor normali prin colorație H&E. Mărire originală ×200. a, distrugere osoasă; b, infiltrare de celule imune; c, sinovială hipertrofică. (b) Scoruri histopatologice ale hiperplaziei sinoviocitelor și ale infiltrației celulelor inflamatorii în toate grupurile. , în comparație cu grupul de control; , în comparație cu grupul vehicul.

3.3. Efectele WV asupra indicelui de viscere și a nivelurilor de imunoglobulină serică la șobolanii CIA

În comparație cu grupul de control, indicele hepatic al grupului vehicul a scăzut semnificativ (), iar WV (0,25 și 0,5 mg/kg) a crescut semnificativ (). Comparativ cu grupul de control, indicele splinei și indicele timusului din grupul vehicul a crescut semnificativ (); TwHF și WV au jucat un efect inhibitor asupra acestora, care s-a reflectat în special în efectul dozei de 0,5 mg/kg de WV asupra indicelui timusului (Figura 3(a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

Efectele WV asupra indicelui viscerelor și a nivelului imunoglobulinei serice la șobolanii CIA. (a) Modificări ale indicelui splinei, timusului și ficatului în toate grupurile. (b) Expresia nivelurilor IgG, IgA și IgM în serul tuturor grupurilor. , în comparație cu grupul de control; , în comparație cu grupul vehicul.

Nivelurile de expresie IgG, IgA și IgM s-au îmbunătățit dramatic la șobolanii CIA () în comparație cu grupul de control, în timp ce acestea au devenit mai mici după prelucrarea TwHF (). Iar nivelurile de IgG serice au fost scăzute în grupul WV (0,5 mg/kg) în comparație cu grupul vehicul (). Această inhibiție s-a aplicat, de asemenea, la IgA și IgM în grupurile WV (0,25 și 0,5 mg/kg) (Figura 3(b)).

3.4. Efectele WV asupra subseturilor de celule T în splina șobolanilor CIA

Numărul de celule T CD4+ a crescut semnificativ în grupurile cu vehicul în comparație cu grupul de control (), în timp ce cele din grupurile TwHF și WV (0,5 mg/kg) au fost semnificativ mai mici decât cele din grupul cu vehicul (Figura 4(a)). În comparație cu grupul de control, numărul de celule T CD4+CD25+ în grupul vehicul a scăzut semnificativ (), în timp ce acestea au crescut semnificativ în grupurile TwHF și WV (0,5 mg/kg) (), dar nu au fost evidente în celelalte grupuri (Figura 4(a)). Comparativ cu grupul de control, reducerea în grupul vehicul a numărului de celule T CD8+ a fost remarcabilă, dar numai WV (0,125 și 0,25 mg/kg) a făcut ca numărul acestora să crească (, ) în Figura 4(b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

Numărul de subseturi de celule T în celulele splinei prin citometrie în flux. (a) Rezultatele FCM privind numărul de celule Th și de celule Tc (stânga); rezultatele FCM privind numărul de celule Treg (dreapta). (b) Graficul cu bare a indicat efectul negativ al WV și TwHF asupra celulelor Th și efectul pozitiv asupra celulelor Tc și Treg. , în comparație cu grupul de control; , în comparație cu grupul vehicul.

3.5. Citokine și mediatori serici reglați de WV la șobolanii CIA

Kitările ELISA (figura 5) au arătat că, în comparație cu grupul de control, nivelurile serice de IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 și IL-8 au fost semnificativ crescute în grupul vehicul și au fost restabilite în mod semnificativ de TwHF (9 mg/kg) și WV (0,5 mg/kg) (). Între timp, expresiile de IL-6 și PGE2 au fost suprimate de doza de 0,125 și 0,25 mg/kg de WV (). WV (0,125 și 0,25 mg/kg) a redus în mod similar expresia de COX-2 și IL-8 în comparație cu vehiculul (, ). Acest lucru a indicat că inflamația indusă de CCII a mediat probabil modificările patologice observate la șobolanii artrozici, iar WV ar putea atenua răspunsul inflamator.

Figura 5

Efectele WV asupra nivelurilor IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 și COX-2 în serul de șobolan CIA. , în comparație cu grupul de control; , în comparație cu grupul vehicul.

4. Discuție

AR este o boală autoimună cronică caracterizată prin durere, umflături și distrugerea treptată a articulațiilor, ceea ce duce la pierderea funcției . cDeși comprimatele de metotrexat (MTX) sunt offen considerate ca un medicament de tratament pentru artrita reumatoidă , acestea sunt de obicei asociate cu reacții adverse la medicamente (ADR) . Prin urmare, am căutat să evaluăm dacă veninul de viespe (WV) ar putea reprezenta un potențial medicament alternativ pentru AR.

Studiul actual a fost primul, după cunoștințele noastre, care a investigat rolul terapeutic al WV (din Vespa magnifica) în artrita indusă de colagen (CIA) indusă la șobolanii SD și a fost comparat cu efectul dovedit clinic al TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), cunoscut, de asemenea, sub numele de Lei Gong Teng în MTC, a fost utilizat pentru a trata AR timp de mulți ani în China, iar extractele de TwHF au demonstrat activități antiinflamatorii și imunosupresoare atât în studiile in vivo, cât și in vitro . Am stabilit modelul de șobolani CIA timp de 14 zile și am eliminat 12 incompetențe aparente care ar fi putut fi cauzate de eșecul injecției de la 52 de șobolani, adică șobolanii CIA au avut o rată de artrită de 77%. Grupul de control nu a prezentat semne nici de edem, nici de inflamație (figurile 1 și 5), iar constatările noastre sunt în concordanță cu studiile anterioare privind AR și CIA, care au raportat că emulsificatorul CCII a indus severitatea edemului și a leziunilor inflamatorii la nivelul articulațiilor . Apoi, simptomele îmbunătățite în grupul WV (0,5 mg/kg) au fost similare cu cele ale medicamentului pozitiv TwHF, despre care s-a raportat că inhibă răspunsul inflamator al RA , dar efectul dozei mici nu a fost semnificativ asupra reducerii umflăturii și inhibării IL-1β și TNF-α (figurile 1 și 5). Mai mult decât atât, am observat că șobolanii din grupul de vehicule aveau o blană mai aspră și o stare mentală mai slabă decât cei din grupul de control; aceste condiții s-au transformat cu atât mai bine în grupul de tratament.

Pentru a evalua în continuare eficacitatea terapeutică a WV, s-a efectuat colorarea H&E în eșantioane de țesut din articulațiile gleznei posterioare stângi pentru a analiza caracteristica patologică și am constatat că celulele sinoviale provoacă inflamație, proliferare și invazie a cartilajului și osului localizate în grupul vehicul (Figura 2), iar aceste modificări macroscopice sunt în concordanță cu rapoartele anterioare . Mai mult, TwHF și WV care tratează timp de 14 zile au redus semnificativ hiperplazia celulelor sinoviale și infiltrarea celulelor inflamatorii în comparație cu cele netratate (Figura 2). Sinovita cronică este baza patologică a AR . Inflamația sinovială este determinată de o interacțiune complexă între sinoviocite și celulele infiltrate ale sistemelor imune înnăscut și adaptativ . Prin urmare, în acest experiment a fost calculat indicele visceral al organelor imune, cum ar fi splina și timusul. Merită menționat faptul că nu am constatat diferența semnificativă de greutate între grupul vehicul și grupul de tratament; astfel, am utilizat indicele visceral reprezentativ pentru a reflecta starea generală de sănătate a șobolanilor. Am constatat că TwHF și WV ar putea diminua creșterea indicelui visceral al splinei și timusului la șobolanii CIA [Figura 3(a)]; acest lucru ar putea reflecta rolul lor în atenuarea îmbunătățirii imunitare cauzate de RA. Am observat, de asemenea, modificarea indicelui hepatic în timpul acestui proces; rezultatele noastre au arătat că TwHF nu a revigorat indicele hepatic, deși tratamentul său a fost eficient, ceea ce ne-a reamintit de toxicitatea sa pentru ficat în raportul anterior . Din fericire, acest lucru nu a fost constatat în grupul WV (Figura 3(a)). Cu excepția scăderii indicelui hepatic în grupul cu vehicul și în grupul TwHF, nu s-au observat efecte secundare la acești șobolani, ceea ce s-ar putea datora dozei mici pe care am folosit-o. În plus, am detectat, de asemenea, factorii reumatoizi (RF), ca marker de diagnostic pentru AR, incluzând în principal izotipurile IgG, IgA și IgM; are o rată de detecție ridicată la pacienții cu AR . Acest studiu a constatat că șobolanii CIA netratați au avut niveluri semnificativ mai mari de anticorpi IgG, IgA și IgM în ser decât cei din grupurile TwHF și WV [Figura 3(b)]; aceste rezultate au fost în concordanță cu datele clinice raportate. Astfel, s-a putut observa că TwHF și WV (0,5 mg/kg) ar putea reduce răspunsul autoimunitar excesiv al șobolanilor CIA la un nivel apropiat de cel normal. În schimb, efectul WV (0,125 și 0,25 mg/kg) nu a fost evident, în timp ce rămâne de văzut dacă o doză mai mare va îmbunătăți efectul mai degrabă decât să acționeze ca o otravă, așa că ne-am concentrat în continuare pe aceste trei doze pentru a explora efectul WV asupra RA în acest experiment.

Cercetarea anterioară a arătat că inflamația sinovială recrutează și activează celulele imune prin producerea de mediatori, iar celulele T joacă roluri vitale în reglarea RA . În ceea ce privește rolurile citokinelor proinflamatorii în autoimunitate, este esențial să se ia în considerare echilibrul dintre diferitele subseturi de celule T, împărțite în principal în două ipotipuri în funcție de funcția și fenotipurile lor: celula T ajutătoare (Th) CD4+ și celula T citotoxică (Tc) CD8+. Celulele Th și celulele Tc, caracterizate prin producerea de diverse citokine specifice, facilitează răspunsul imunitar adaptativ . În schimb, celulele T (Treg) CD4+CD25+ au o funcție centrală în menținerea toleranței imune prin controlul răspunsurilor inflamatorii și suprimarea activității celulelor imune menționate mai sus . În acest studiu, am constatat o concentrație mare de celule Th și Tc în celulele splenice și am observat, de asemenea, o funcție afectată a celulelor Treg la șobolanii CIA. Din fericire, echilibrul dintre subseturile de celule T a fost protejat cu tratamentul cu TwHF și WV (Figura 4). De remarcat, acumularea de celule imune este promotorul inflamației articulare locale, iar celulele imune activate eliberează o cantitate mare de citokine proinflamatorii, care apoi induc activarea și proliferarea celulelor sinoviale și agravează și mai mult progresia inflamației articulare . Studii anterioare au arătat că IL-6 este cea mai dominantă citokină în patogeneza PR , iar în lichidul sinovial al pacienților cu PR au fost găsite cantități excesive de IL-1β, precum și de TNF-α și IL-8 . Producția de COX-2 și PGE2 în urma stimulării cu IL-1β, de asemenea, a crescut, iar blocarea acestora a ameliorat semnificativ simptomele de PR . Constatări similare au fost observate în rezultatele noastre experimentale și am confirmat că TwHF și WV (0,5 mg/kg) ar putea reduce în mod eficient nivelurile de IL-6, IL-8, PGE2 și COX-2; de asemenea, concentrațiile crescute de IL-1β și TNF-α induse de RA au fost suprimate, cu excepția WV (0,125 și 0,125 și 0.25 mg/kg) (Figura 5) (Figura 5).

Aceste rezultate au sugerat că WV are funcțiile de ameliorare a umflăturii articulare, de inhibare a inflamației sinoviale, de suprimare a răspunsului imunitar excesiv și de protecție a homeostaziei imunitare, care pot îmbunătăți simptomele și pot deveni remedii eficiente pentru RA. S-a raportat că veninul de viespe conține o serie de molecule bioactive, inclusiv amine, peptide mici și chiar enzime, alergeni și toxine de masă moleculară mare . Ceea ce face ca WV să fie diferit de BV este faptul că BV are, în principal, efecte antiinflamatorii, antioxidative și analgezice asupra RA și conține o varietate de peptide diferite, inclusiv melitina, fosfolipază A2, apamină și așa mai departe . Mecanismele de tratare a RA cu aceste două veninuri pot fi diferite și merită să fie studiate în continuare. Deși nu au fost observate efecte secundare în intervalul de 0,125 până la 0,5 mg/kg WV, este necesară o evaluare suplimentară a ingredientelor active și a siguranței extractului de WV.

5. Concluzii

Veninul de viespe a atenuat hiperplazia sinovială și distrugerea cartilajului cauzate de CIA, posibil datorită reducerii factorului proinflamator și efectului de imunoreglare. Acest studiu a demonstrat că veninul de viespe ar fi putut fi o potențială alternativă terapeutică pentru AR. Pe lângă faptul că este o rețetă populară de mulți ani, VV merită studii suplimentare pentru a fi descoperit, explorat și recunoscut.

Disponibilitatea datelor

Datele utilizate pentru a susține concluziile acestui studiu sunt incluse în cadrul articolului și pot fi puse la dispoziție în mod liber.

Aprobare etică

Studiul a fost aprobat de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) al Universității Dali.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu există conflicte de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

Contribuții ale autorilor

YG a scris manuscrisul și a asistat la construirea și gruparea modelelor animale. WXY și HL au efectuat colorarea H&E și citometria de flux. XMD și LLN au fost responsabili pentru kiturile ELISA. ZBY, HRZ și HX au contribuit în mare măsură la redactarea manuscrisului. ZBY și CGZ au administrat și au supravegheat proiectul. Toți autorii au citit și aprobat manuscrisul final.

Recunoștințe

O parte din această lucrare a fost susținută de Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics. Prezentul studiu a fost finanțat de Fundația Națională de Științe Naturale a Chinei (granturile nr. 81360679 și 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (grantul nr. 2016FD074), Fundația de Științe Naturale a provinciei Yunnan (grantul nr. 2017FA050) și Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (grant nr. ZKLX2019101).

.