Discusión
Un parámetro importante en HELM es el ángulo α del haz con respecto al eje óptico, que determina la frecuencia espacial de excitación u. En la Fig. 4, se puede ver que la elección de u requiere negociar la frecuencia de corte máxima a lo largo de los ejes kx y ky frente a la anisotropía de la banda pasante resultante.
El valor elegido (55°) es un buen compromiso y, además, permite la observación directa del patrón de interferencia con objetivos de inmersión.
Debido a la banda pasante no isotrópica, las imágenes de las cuentas muestran cierta anisotropía y un rebasamiento cerca de los bordes de las cuentas; lo más notable son las zonas oscuras en las direcciones diagonales en la Fig. 2A. Este efecto podría evitarse en gran medida utilizando seis u ocho rayos láser orientados en múltiplos de 60° o 45°, respectivamente.‡
En comparación con CFM, la relación señal-ruido de la imagen HELM es superior, a pesar de que la potencia láser integrada en el tiempo fue más de 100 veces mayor para la imagen CFM en la Fig. 2C. Una razón fundamental para esta mejora radica en el hecho de que la mejora de la resolución de CFM en comparación con la microscopía de fluorescencia estándar sólo puede lograrse utilizando un pequeño agujero de alfiler en la trayectoria de la luz de emisión (5, 13, 14). Esta disposición requiere un equilibrio entre el nivel de ruido y la resolución. Por el contrario, en HELM, todos los fotones que entran en las lentes pueden ser recogidos por la cámara.
Para los estudios de objetos dinámicos, la velocidad de la imagen es de gran importancia. La limitación fundamental de la velocidad de imagen en la microscopía de fluorescencia viene dada por la tasa de emisión máxima de los fluoróforos causada por el tiempo de vida finito del estado excitado («saturación del colorante»; ref. 15). En HELM, aproximadamente la mitad de los fluoróforos son iluminados por el patrón de interferencia a la vez, mientras que en la CFM de punto único común, sólo una pequeña fracción de los fluoróforos es iluminada a la vez (≈1 por millón para una imagen de 1.024 × 1.024 píxeles). Como consecuencia, el flujo total de fotones del espécimen está limitado a valores que son varios órdenes de magnitud menores para la operación secuencial de CFM que para la paralela de HELM. Dado que se requiere un número mínimo de fotones por imagen para un determinado nivel de señal-ruido, HELM tiene el potencial de adquirir datos de imagen mucho más rápido que CFM. Además de esta consideración fundamental, HELM reduce los problemas de velocidad ligados a los mecanismos de escaneo mecánico, ya que sólo se realizan cinco escaneos por imagen en contraste con CFM, donde se requiere un escaneo por línea. Sin embargo, tanto el problema de la saturación del colorante como las dificultades de escaneo mecánico de CFM pueden reducirse con los nuevos escáneres multipunto.
Las ventajas en el campo de la velocidad de las imágenes también pueden verse en nuestros datos experimentales. El tiempo total de adquisición de las cinco imágenes necesarias para HELM (Fig. 2A) fue de 1,6 s en comparación con los 6,5 s de la imagen confocal (Fig. 2C). Teniendo en cuenta la mayor relación señal-ruido de la imagen HELM que se consigue con una cámara CCD de grado industrial no refrigerada, la diferencia es clara.
Un punto de interés práctico es la estabilidad requerida del patrón de interferencia durante la medición. Hemos comprobado que los errores de desplazamiento de fase de 1/10 del espacio nodal (20 nm) son apenas tolerables, pero los errores más grandes conducen a un deterioro significativo de la imagen. La deriva térmica de nuestra configuración (normalmente 20 nm/min en una sala sin control de temperatura) limita el tiempo de adquisición a varias decenas de segundos. Sin embargo, esta limitación podría superarse fácilmente recalibrando los desfases durante una medición de larga duración. La heterogeneidad del índice de refracción de la muestra también provoca errores de fase no deseados del patrón de interferencia, que en este caso dependen del espacio. Al igual que antes, para limitar estos errores a valores tolerables, las distorsiones del frente de onda introducidas por la heterogeneidad del índice de refracción no deberían exceder unas decenas de nanómetros. Esperamos que los requisitos aplicables a HELM no difieran mucho de los que garantizan la obtención de imágenes de alta resolución con objetivos de alta AN bien corregidos en microscopía estándar. Se necesitarán más datos experimentales para estudiar la sensibilidad de HELM frente a la heterogeneidad del índice de refracción en la práctica.
Para muchas aplicaciones, investigar la estructura tridimensional de la muestra es de gran interés. Los datos de imágenes tridimensionales pueden adquirirse desplazando el foco a través de la muestra etiquetada (16) o no etiquetada (17, 18). Desgraciadamente, la resolución axial de la microscopía de fluorescencia estándar está fuertemente limitada a unos 0,9 μm para objetos puntuales y, lo que es peor, puede romperse completamente para objetos arbitrarios (19). Este problema se corresponde con el hecho de que la OTF tridimensional tiene un cono perdido alrededor del eje kz en el origen y, en consecuencia, la imagen tridimensional resultante muestra potenciales artefactos. La CFM, por el contrario, no tiene cono ausente y permite la adquisición de imágenes tridimensionales con una resolución axial de aproximadamente 0,8 μm (20), que, sin embargo, sigue siendo inferior a la lateral.
Se han descrito diferentes métodos para mejorar aún más la resolución axial. El llamado microscopio 4π (21) es un derivado del CFM con un segundo objetivo para recoger también los fotones que se propagan hacia la parte posterior de la cámara de la muestra. La resolución axial puede ser teóricamente de hasta 100 nm, mientras que el poder de resolución lateral es igual al del CFM. El microscopio 4π es también de barrido.
En las refs. 22 y 23. Se consigue una capacidad de separación axial fuertemente aumentada mediante un campo de interferencia que tiene sus planos nodales y antinodales paralelos al plano de la imagen. Este método es muy adecuado para objetos que son más delgados que un período del patrón de excitación. La obtención de imágenes de especímenes más gruesos puede dar lugar a artefactos, ya que la banda de paso resultante sigue teniendo un cono ausente en el origen (9).
Recientemente se ha demostrado un nuevo desarrollo que comparte aspectos de este último método y de la microscopía 4π (microscopía I5M; ref. 24). La microscopía I5M emplea un campo de interferencia más complicado generado por una fuente de luz no coherente para iluminar selectivamente el plano del objeto y es un método sin barrido. La resolución axial es igual a la de la microscopía 4π (100 nm), pero la resolución lateral no aumenta en absoluto.
También se puede conseguir una mayor resolución axial iluminando la muestra con un patrón de franjas producido, por ejemplo, mediante la proyección de imágenes de una rejilla sobre el objeto (25) o mediante la interferencia de dos rayos láser (26). Para estos métodos, el algoritmo de reconstrucción aplicado difiere significativamente del nuestro, porque se omite el círculo de transmisión central de la Fig. 4 y porque la información del objeto se transfiere sólo en dos bandas laterales (27). Se puede demostrar, en este caso, que el desenfoque se reduce.
Es deseable un microscopio con una resolución uniformemente alta de 100 nm en todas las direcciones del espacio sin necesidad de un método de barrido. HELM, tal como se ha establecido en nuestro montaje actual, no aumenta la resolución axial en comparación con la microscopía de fluorescencia estándar. Sin embargo, la idea clave es que la excitación armónica, junto con un algoritmo de reconstrucción similar al descrito aquí, también funciona en direcciones espaciales no paralelas al plano del objeto. Utilizando patrones de intensidad armónica que tienen sus planos nodales y antinodales en las direcciones espaciales adecuadas, se obtienen copias adicionales de la OTF tridimensional en cualquier dirección deseada. Estas regiones adicionales de banda pasante podrían superponerse a una banda pasante extendida con una alta frecuencia de corte en todo el espacio recíproco.
Nuestra idea para una futura configuración es utilizar unidades de desviación de haz continuo (como galvanómetros o dispositivos acústico-ópticos) para producir fácilmente patrones de interferencia en orientaciones seleccionadas en el espacio y con varios espaciamientos nodales. Esta configuración permitiría obtener imágenes tridimensionales y, al mismo tiempo, resolver los problemas de anisotropía causados por la OTF bidimensional en forma de hoja de trébol.