Keskustelu
Yksi tärkeäksi parametriksi HELM:ssä nousee säteen kulma α optiseen akseliin nähden, joka määrittää herätteen spatiaalisen taajuuden u. Kuvasta 4 nähdään, että u:n valinta edellyttää kaupankäyntiä maksimaalisesta katkaisutaajuudesta pitkin kx- ja ky-akselia vastaan. tuloksena syntyvän läpäisykaistan anisotrooppisuutta.
Valittu arvo (55°) on hyvä kompromissi, ja lisäksi se mahdollistaa interferenssikuvion suoran havainnoinnin upotusobjektiiveilla.
Epäisotrooppisen läpäisykaistan vuoksi helmien kuvissa näkyy jonkin verran anisotrooppisuutta ja ylikuviointia helmien reunojen läheisyydessä; selvimmin havaittavissa ovat tummia vyöhykkeitä diagonaalisuunnissa kuvassa 2A. Tämä vaikutus voitaisiin välttää suurelta osin käyttämällä kuutta tai kahdeksaa lasersädettä, jotka on suunnattu 60°:n tai 45°:n kerrannaisina.‡
Vertailtuna CFM:ään HELM-kuvauksen signaali-kohinasuhde on ylivoimainen, vaikka aikaintegroitu laserin teho oli yli 100-kertainen CFM-kuvaukseen verrattuna kuvassa 2C. Yksi perustavanlaatuinen syy tähän parannukseen on se, että CFM:n resoluution parantaminen tavanomaiseen fluoresenssimikroskopiaan verrattuna voidaan saavuttaa vain käyttämällä pientä neulanreikää emissiovalopolussa (5, 13, 14). Tämä järjestely edellyttää melutason ja resoluution välistä kaupankäyntiä. Sitä vastoin HELM:ssä kaikki linsseihin tulevat fotonit voidaan kerätä kameraan.
Dynaamisten kohteiden tutkimuksessa kuvausnopeudella on suuri merkitys. Fluoresenssimikroskopian kuvantamisnopeuden perusrajoituksen antaa fluoresenssimikroskopian fluoresooreiden maksimaalinen emissionopeus, joka johtuu kiihdytetyn tilan rajallisesta eliniästä (”väriaineen kyllästyminen”; viite 15). HELM:ssä interferenssikuvio valaisee kerrallaan noin puolet fluorofooreista, kun taas tavallisessa yhden pisteen CFM:ssä vain pieni osa fluorofooreista valaistaan kerrallaan (≈1 miljoonasta 1 024 × 1 024 pikselin kuvassa). Tämän seurauksena näytteestä tuleva kokonaisfotonivirta rajoittuu arvoihin, jotka ovat useita kertaluokkia pienempiä CFM:n peräkkäisessä toiminnassa kuin HELM:n rinnakkaisessa toiminnassa. Koska tietyn signaali-kohinatason saavuttamiseksi tarvitaan vähimmäismäärä fotoneja kuvaa kohti, HELM:llä on mahdollisuus hankkia kuvatietoja paljon nopeammin kuin CFM:llä. Tämän perustavanlaatuisen näkökohdan lisäksi HELM vähentää mekaanisiin skannausmekanismeihin liittyviä nopeusongelmia, koska kuvaa kohti tehdään vain viisi skannausta, toisin kuin CFM:ssä, jossa tarvitaan yksi skannaus riviä kohti. Sekä väriaineen kyllästymisongelmaa että CFM:n mekaanisia skannausvaikeuksia voidaan kuitenkin vähentää uudemmilla monipisteskannereilla.
Kuvantamisnopeuteen liittyvät edut näkyvät myös kokeellisissa tiedoissamme. HELM-kuvaukseen tarvittavien viiden kuvan (kuva 2A) yhteenlaskettu kuvausaika oli 1,6 s verrattuna konfokaalikuvan (kuva 2C) 6,5 s:aan. Kun otetaan huomioon HELM-kuvan korkeampi signaali-kohinasuhde, joka saavutetaan jäähdyttämättömällä teollisuuskäyttöön tarkoitetulla CCD-kameralla, ero on selvä.
Käytännöllisesti kiinnostava seikka on interferenssikuvion vaadittu vakaus mittauksen aikana. Havaitsimme, että vaiheoffset-virheet, jotka ovat 1/10 solmuvälistä (20 nm), ovat juuri ja juuri siedettäviä, mutta suuremmat virheet johtavat kuvan merkittävään heikkenemiseen. Asetelmamme lämpösiirtymä (tyypillisesti 20 nm/min lämpötilaa kontrolloimattomassa huoneessa) rajoittaa kuvausaikaa muutamiin kymmeniin sekunteihin. Tämä rajoitus voidaan kuitenkin helposti poistaa kalibroimalla vaihepoikkeamat uudelleen pitkäaikaisen mittauksen aikana. Näytteen taitekertoimen heterogeenisuus johtaa myös interferenssikuvion ei-toivottuihin vaihevirheisiin, jotka ovat tässä tapauksessa tilasta riippuvaisia. Jotta nämä virheet voitaisiin rajoittaa siedettäviin arvoihin, taitekertoimen heterogeenisuuden aiheuttamat aaltorintaman vääristymät eivät saisi ylittää muutamaa kymmentä nanometriä. Odotamme, että HELM:iin sovellettavat vaatimukset eivät juuri poikkea niistä vaatimuksista, jotka takaavat korkearesoluutioisen kuvantamisen hyvin korjatuilla suurilla NA-objektiiveilla tavanomaisessa mikroskopiassa. Tarvitaan lisää kokeellisia tietoja, jotta voidaan tutkia HELM:n herkkyyttä taitekerroinheterogeenisuudelle käytännössä.
Monissa sovelluksissa näytteen kolmiulotteisen rakenteen tutkiminen on erittäin tärkeää. Kolmiulotteista kuvatietoa voidaan hankkia siirtämällä fokus merkityn (16) tai merkitsemättömän näytteen läpi (17, 18). Valitettavasti tavanomaisen fluoresenssimikroskopian aksiaalinen erottelukyky rajoittuu voimakkaasti noin 0,9 μm:iin pistemäisten kohteiden osalta ja, mikä vielä pahempaa, se voi hajota kokonaan mielivaltaisten kohteiden osalta (19). Tämä ongelma vastaa sitä, että kolmiulotteisesta OTF:stä puuttuu kartio kz-akselin ympäriltä origosta, ja näin ollen tuloksena olevassa kolmiulotteisessa kuvassa on mahdollisia artefakteja. CFM:ssä ei sitä vastoin ole puuttuvaa kartiota, ja se mahdollistaa kolmiulotteisten kuvien ottamisen noin 0,8 μm:n aksiaalisella resoluutiolla (20), joka on kuitenkin edelleen lateraalista resoluutiota huonompi.
Aksiaalisen resoluution parantamiseksi edelleen on kuvattu erilaisia menetelmiä. Niin sanottu 4π-mikroskooppi (21) on CFM:n johdannainen, jossa on toinen objektiivi, jolla kerätään myös näytekammion takapuolelle etenevät fotonit. Aksiaalinen erotuskyky voi teoriassa olla jopa 100 nm, kun taas lateraalinen erotuskyky vastaa CFM:n erotuskykyä. Myös 4π-mikroskooppi on pyyhkäisevä mikroskooppi.
Ei-pyyhkäisevä lähestymistapa on kuvattu viitteissä. 22 ja 23. Voimakkaasti lisääntynyt aksiaalinen erotuskyky saavutetaan interferenssikentällä, jonka solmu- ja antinodaalitasot ovat kuvatason suuntaisia. Tämä menetelmä soveltuu hyvin kohteisiin, jotka ovat ohuempia kuin yksi herätekuvion jakso. Paksumpien kappaleiden kuvaaminen voi aiheuttaa artefakteja, koska tuloksena syntyvässä läpäisykaistassa on edelleen puuttuva kartio alkupisteessä (9).
Viime aikoina esiteltiin jatkokehitys, jossa on yhteisiä piirteitä jälkimmäisestä menetelmästä ja 4π-mikroskopiasta (I5M-mikroskopia; viite 24). I5M-mikroskopiassa käytetään epäkoherentin valonlähteen tuottamaa monimutkaisempaa interferenssikenttää kohteen tason valaisemiseksi valikoivasti, ja se on skannaamaton menetelmä. Aksiaalinen erottelukyky vastaa 4π-mikroskopian erottelukykyä (100 nm), mutta lateraalinen erottelukyky ei lisäänny lainkaan.
Aksiaalista erottelukykyä voidaan parantaa myös valaisemalla näytettä hapsukuviolla, joka on tuotettu esimerkiksi kuvantamalla ritilä objektin päälle (25) tai interferoimalla kaksi lasersädettä (26). Näissä menetelmissä käytetty rekonstruktioalgoritmi eroaa merkittävästi omastamme, koska kuvassa 4 oleva keskeinen siirtoympyrä jätetään pois ja koska kohteen informaatio siirretään vain kahdessa sivukaistassa (27). Tällöin voidaan osoittaa, että tarkennuksen ulkopuolinen epätarkkuus vähenee.
Toivottavaa on mikroskooppi, jolla on tasaisen korkea 100 nm:n resoluutio kaikissa avaruussuunnissa ilman, että tarvitaan skannausmenetelmää. HELM, sellaisena kuin se on vakiintunut nykyisessä asetuksessamme, ei lisää aksiaalista resoluutiota verrattuna tavanomaiseen fluoresenssimikroskopiaan. Keskeinen ajatus on kuitenkin se, että harmoninen heräte yhdessä tässä kuvatun kaltaisen rekonstruktioalgoritmin kanssa toimii myös muissa kuin objektin tason suuntaisissa tilasuunnissa. Käyttämällä harmonisia intensiteettikuvioita, joiden solmu- ja antinodaalitasot ovat sopivissa tilasuunnissa, saadaan lisäkopioita kolmiulotteisesta OTF:stä mihin tahansa haluttuun suuntaan. Tällaiset ylimääräiset läpäisyalueet voitaisiin limittää yhdeksi laajennetuksi läpäisykaistaksi, jolla on korkea raja-arvotaajuus koko vastavuoroisessa avaruudessa.
Ajatuksemme tulevaa asetelmaa varten on käyttää jatkuvan säteen poikkeutusyksiköitä (kuten galvanometrejä tai akusto-optisia laitteita) interferenssikuvioiden tuottamiseksi helposti valituissa avaruuden suunnissa ja erilaisilla solmuväleillä. Tällainen konfiguraatio mahdollistaisi kolmiulotteisen kuvantamisen ja samalla ratkaisisi kaksiulotteisen apilanlehden muotoisen OTF:n aiheuttamat anisotrooppisuusongelmat.