Discussion
A HELM egyik fontos paramétere a sugárnak az optikai tengelyhez viszonyított α szöge, amely meghatározza a gerjesztés térbeli frekvenciáját u. A 4. ábrán látható, hogy az u megválasztásához a kx és ky tengely mentén a maximális határfrekvenciával kell kereskedni a kx és ky tengelyen vs. a keletkező áteresztési sáv anizotrópiája között.
A választott érték (55°) jó kompromisszumot jelent, ráadásul lehetővé teszi az interferenciamintázat közvetlen megfigyelését merülő objektívekkel.
A nem izotróp áteresztési sáv miatt a gyöngyök képei a gyöngyök szélei közelében némi anizotrópiát és túlcsordulást mutatnak; a 2A. ábrán a leglátványosabbak az átlós irányokban lévő sötét zónák. Ez a hatás nagyrészt elkerülhető lenne hat vagy nyolc, 60°, illetve 45° többszörösére orientált lézersugár alkalmazásával.‡
A CFM-hez képest a HELM-kép jel-zaj aránya jobb, annak ellenére, hogy a 2C. ábrán látható CFM-kép esetében az időben integrált lézerteljesítmény több mint 100-szor nagyobb volt. Ennek a javulásnak az egyik alapvető oka abban rejlik, hogy a CFM felbontásjavulása a standard fluoreszcens mikroszkópiához képest csak az emissziós fényútban lévő kis lyukkal érhető el (5, 13, 14). Ez az elrendezés szükségessé teszi a zajszint és a felbontás közötti kompromisszumot. Ezzel szemben a HELM-ben a lencsékbe belépő összes fotont összegyűjtheti a kamera.
A dinamikus objektumok vizsgálatánál a képalkotás sebessége nagyon fontos. A fluoreszcens mikroszkópiában a képalkotási sebesség alapvető korlátját a fluoroforok maximális emissziós sebessége adja, amelyet a gerjesztett állapot véges élettartama okoz (“festéktelítettség”; hivatkozás 15). A HELM-ben a fluorofóráknak nagyjából a felét világítja meg egyszerre az interferenciamintázat, míg az általános egypontos CFM-ben a fluorofóráknak csak egy apró töredéke világít meg egyszerre (≈1 per millió egy 1024 × 1024 pixeles kép esetén). Ennek következtében a mintából származó teljes fotonáram a CFM szekvenciális működése esetén több nagyságrenddel kisebb értékekre korlátozódik, mint a HELM párhuzamos működése esetén. Mivel egy bizonyos jel-zaj szinthez képenként minimális számú fotonra van szükség, a HELM sokkal gyorsabb képadatgyűjtést tesz lehetővé, mint a CFM. Ezen alapvető megfontolás mellett a HELM csökkenti a mechanikus pásztázó mechanizmusokhoz kapcsolódó sebességproblémákat, mivel képenként csak öt pásztázás történik, szemben a CFM-mel, ahol soronként egy pásztázásra van szükség. Mind a festék telítődés problémája, mind pedig a CFM mechanikai szkennelési nehézségei azonban csökkenthetők az újabb többpontos szkennerekkel.
A képalkotási sebesség terén mutatkozó előnyök a kísérleti adatainkban is megmutatkoznak. A HELM-hez szükséges öt kép teljes felvételi ideje (2A ábra) 1,6 s volt, szemben a konfokális kép 6,5 s-ával (2C ábra). Figyelembe véve a HELM-kép magasabb jel-zaj arányát, amelyet egy nem hűtött ipari minőségű CCD-kamerával érünk el, a különbség egyértelmű.
A gyakorlati szempontból érdekes pont az interferenciamintázat szükséges stabilitása a mérés során. Megállapítottuk, hogy a csomóponti távolság 1/10-ének (20 nm) megfelelő fáziseltolódási hiba éppen elviselhető, de a nagyobb hibák jelentős képromláshoz vezetnek. A berendezésünk termikus sodródása (jellemzően 20 nm/perc egy nem szabályozott hőmérsékletű helyiségben) a felvételi időt néhány tíz másodpercre korlátozza. Ez a korlátozás azonban könnyen áthidalható a fáziseltolódások újrakalibrálásával egy hosszú távú mérés során. A minta törésmutatójának heterogenitása szintén az interferenciamintázat nem kívánt fázishibáihoz vezet, amelyek ebben az esetben térfüggőek. Mint korábban, ahhoz, hogy ezeket a hibákat elviselhető értékekre korlátozzuk, a törésmutató heterogenitása által okozott hullámfront-torzulások nem haladhatják meg a néhány tíz nanométert. Arra számítunk, hogy a HELM-re vonatkozó követelmények nem sokban különböznek azoktól, amelyek a standard mikroszkópiában jól korrigált, nagy NA objektívekkel történő nagyfelbontású képalkotást garantálják. További kísérleti adatokra lesz szükség a HELM törésmutató-heterogenitással szembeni érzékenységének gyakorlati tanulmányozásához.
Számos alkalmazás esetében a minta háromdimenziós szerkezetének vizsgálata nagy jelentőséggel bír. Háromdimenziós képi adatok nyerhetők a fókusznak a megjelölt (16) vagy nem megjelölt mintán való áthaladásával (17, 18). Sajnos a szabványos fluoreszcens mikroszkópia axiális felbontása pontszerű objektumok esetén erősen korlátozott, körülbelül 0,9 μm-re, és ami még rosszabb, tetszőleges objektumok esetén teljesen összeomolhat (19). Ez a probléma annak felel meg, hogy a háromdimenziós OTF-nek az origó kz tengelye körül hiányzik egy kúp, és következésképpen a kapott háromdimenziós kép potenciális műtermékeket mutat. A CFM ezzel szemben nem rendelkezik hiányzó kúppal, és lehetővé teszi a háromdimenziós képek felvételét körülbelül 0,8 μm-es axiális felbontással (20), ami azonban még mindig rosszabb, mint a laterális felbontás.
Az axiális felbontás további javítására különböző módszereket írtak le. Az úgynevezett 4π mikroszkóp (21) a CFM egy olyan származéka, amely egy második objektívvel rendelkezik, amely a mintakamra hátsó oldala felé terjedő fotonokat is összegyűjti. Az axiális felbontás elméletileg akár 100 nm is lehet, míg az oldalsó felbontóképesség megegyezik a CFM-ével. A 4π mikroszkóp szintén pásztázó mikroszkóp.
Egy nem pásztázó megközelítést a hivatkozások ismertetnek. 22. és 23. sz. Erősen megnövelt axiális elválasztó képességet érnek el egy olyan interferenciamezővel, amelynek csomóponti és antinodális síkjai párhuzamosak a képsíkkal. Ez a módszer jól alkalmazható olyan objektumok esetében, amelyek vékonyabbak, mint a gerjesztési minta egy periódusa. A vastagabb minták képalkotása műtermékeket eredményezhet, mivel a keletkező átmenő sávban még mindig hiányzik egy kúp az origónál (9).
Egy további fejlesztést, amely az utóbbi módszer és a 4π mikroszkópia szempontjait osztja, a közelmúltban mutatták be (I5M mikroszkópia; hivatkozás 24). Az I5M mikroszkópia egy nem koherens fényforrás által létrehozott bonyolultabb interferenciamezőt használ a tárgy síkjának szelektív megvilágítására, és nem pásztázó módszer. Az axiális felbontás megegyezik a 4π mikroszkópia felbontásával (100 nm), de az oldalirányú felbontás egyáltalán nem növekszik.
A megnövelt axiális felbontást úgy is el lehet érni, hogy a mintát olyan sávos mintázattal világítják meg, amelyet például egy rácsnak a tárgyra történő leképezésével (25) vagy két lézersugár interferenciájával (26) állítanak elő. Ezeknél a módszereknél az alkalmazott rekonstrukciós algoritmus jelentősen eltér a miénktől, mivel a 4. ábrán látható központi átviteli kör kimarad, és mivel a tárgyinformáció csak két oldalsávban kerül átvitelre (27). Kimutatható, hogy ebben az esetben a fókuszon kívüli elmosódás csökken.
Kívánatos egy olyan mikroszkóp, amely minden térirányban egyenletesen nagy, 100 nm-es felbontással rendelkezik, anélkül, hogy pásztázó módszerre lenne szükség. A HELM, ahogyan azt a jelenlegi elrendezésünkben megállapítottuk, nem növeli az axiális felbontást a standard fluoreszcens mikroszkópiához képest. A kulcsötlet azonban az, hogy a harmonikus gerjesztés az itt leírtakhoz hasonló rekonstrukciós algoritmussal együtt a tárgy síkjával nem párhuzamos térirányokban is működik. Olyan harmonikus intenzitásminták alkalmazásával, amelyek csomóponti és antinodális síkjai a megfelelő térirányokban vannak, a háromdimenziós OTF további másolatai nyerhetők bármely kívánt irányban. Az ilyen további áteresztő tartományok egy kiterjesztett, magas határfrekvenciájú áteresztő sávot fedhetnek le az egész reciprok térben.
Egy jövőbeli elrendezéssel kapcsolatos elképzelésünk az, hogy folyamatos sugárterelő egységeket (mint galvanométerek vagy akuszto-optikai eszközök) használjunk, hogy könnyen előállíthassunk interferenciamintákat a térben kiválasztott orientációkban és különböző csomóponti távolságokkal. Egy ilyen elrendezés lehetővé tenné a háromdimenziós képalkotást, és egyidejűleg megoldaná a lóhere alakú kétdimenziós OTF által okozott anizotrópia problémákat.