Fattore von Willebrand, ADAMTS13, e Porpora trombotica trombocitopenica
VWF è sintetizzato da un grande gene sul cromosoma 12p13.31 che si estende per 178 kb e contiene 52 esoni.49 L’RNA messaggero (mRNA) prodotto da questo gene specifica un polipeptide di 2813 aminoacidi, che include un peptide segnale di 22 aminoacidi, un propeptide di 742 aminoacidi e una sequenza di 2050 aminoacidi che costituisce il blocco monomerico del VWF trovato nel plasma. Dopo la scissione del peptide di segnale nel reticolo endoplasmatico, i monomeri contenenti il propeptide sono legati in modo disolfuro in dimeri attraverso legami disolfuro intercatena che coinvolgono i residui Cys vicino al C-terminale della molecola. Questi dimeri sono poi trasportati nell’apparato del Golgi, dove il propeptide catalizza i legami disolfuro interdimero tra i residui nel dominio D3, producendo lunghi multimeri composti da dimeri collegati testa a testa contenenti N-termini ad entrambe le estremità. Il propeptide viene poi scisso da un enzima simile alla furina e la maggior parte dell’ULVWF risultante viene impacchettata in granuli di stoccaggio per una successiva secrezione regolata.
Solo due tipi di cellule sono note per sintetizzare il VWF: le cellule endoteliali e i megacariociti. Nelle cellule endoteliali, il VWF è immagazzinato in granuli chiamati corpi di Weibel-Palade; nelle piastrine, è immagazzinato in granuli α. La maggior parte del VWF nel sangue è di origine endoteliale. Molti stimoli possono indurre il rilascio di VWF endoteliale, tra cui epinefrina, desamino-vasopressina (DDAVP), istamina, trombina, tossine di Shiga e citochine proinfiammatorie tra cui il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, interleuchina (IL)-8 e IL-6 (in complesso con il recettore IL-6).50 Anche altri agenti possono indurre il rilascio endoteliale di VWF, fornendo indizi su alcuni dei fattori incitanti nella TTP. Questi agenti includono virus come l’adenovirus51 e ossidanti come il superossido.52 Gli ossidanti non solo hanno la capacità di indurre la secrezione di ULVWF; possono anche ossidare il VWF in modo da renderlo non scindibile da ADAMTS1353 e più adesivo.54 Inoltre, gli ossidanti, specialmente quelli prodotti da neutrofili e monociti durante l’infiammazione, possono ossidare un residuo cruciale di metionina nel dominio catalitico di ADAMTS13 e inattivare l’enzima.55
Sia le cellule endoteliali che le piastrine rilasciano multimeri VWF che sono più grandi dei multimeri nel plasma normale.56 Questi multimeri ULVWF non sono solo molto più grandi di quelli normalmente presenti nel plasma; sono anche molto più adesivi e in grado di legare il recettore VWF piastrinico glicoproteina Ib (GPIbα; il polipeptide più grande del complesso GPIb-IX-V) spontaneamente e con una forza di legame superiore a quella ottenuta con il legame del VWF plasmatico a GPIbα in presenza dei modulatori ristocetina o botrocetina.57 In vivo, questo si traduce nel fatto che l’ULVWF è in grado di legare le piastrine in assenza di stress di taglio o a basso livello, mentre il VWF plasmatico elaborato richiede uno spiegamento indotto da un elevato stress di taglio per legare le piastrine.58
Le stringhe di ULVWF consistono in fasci di multimeri VWF, e ogni stringa è legata alla superficie endoteliale in diversi siti di ancoraggio. In assenza (o a basse concentrazioni) di Ca2+ e Mg2+, le stringhe ULVWF si attaccano alla superficie endoteliale attraverso il legame alla P-selectina.60 In presenza di concentrazioni fisiologiche di cationi divalenti, le stringhe di ULVWF si ancorano alla superficie endoteliale attraverso la loro interazione con l’integrina αvβ3.61 Altre molecole sono indubbiamente coinvolte in questo ancoraggio dei filamenti di VWF, ma non sono ancora state identificate.
La capacità di VWF o di ULVWF multimeri di autoassociarsi in fibre e cavi più spessi diventa un meccanismo importante per regolare le proprietà adesive di VWF. Savage et al. hanno dimostrato che sotto sforzo di taglio e in presenza di piastrine, i multimeri VWF in fase fluida si associano omotipicamente e reversibilmente con multimeri VWF immobilizzati su una superficie di collagene; i multimeri VWF auto-associati supportano l’adesione delle piastrine sotto sforzo di taglio.62 I multimeri VWF in fase fluida possono anche associarsi a stringhe ULVWF attaccate alla superficie endoteliale,63 e l’autoassociazione è facilitata dal parziale dispiegamento delle molecole VWF indotto dallo shear stress64,65 o dal legame della ristocetina.66 I multimeri VWF auto-associati formano una rete di fibre reticolate sulle superfici di collagene64 o in soluzione.66 Sotto stress di taglio, i multimeri VWF in fase fluida possono anche associarsi a multimeri VWF legati alle piastrine attraverso l’interazione con GPIbα sulle superfici piastriniche.67 L’auto-associazione del VWF sulle superfici piastriniche può innescare l’attivazione piastrinica, promuovere l’aggregazione piastrinica e migliorare la crescita del trombo.
La capacità del VWF di auto-associarsi gli permette di produrre filamenti che rivaleggiano o superano la lunghezza e lo spessore di quelli prodotti dalla polimerizzazione della fibrina. In microvasi sintetici indotti a secernere VWF da una stimolazione agonista, il VWF secreto dalla parete del vaso potrebbe riunirsi in filoni capaci di attraversare il lume del vaso, in particolare in corrispondenza delle biforcazioni e delle curve.68 La capacità del VWF di formare filamenti e cavi di dimensioni così enormi e di farli passare attraverso il percorso del flusso non solo aumenta le possibilità che i filamenti catturino le piastrine, ma aumenta anche la loro capacità di ridurre gli eritrociti in schistociti.
La stessa autoassociazione del VWF è regolata non solo dallo shear stress ma da fattori plasmatici, che probabilmente possono cambiare il corso e la gravità degli episodi di TTP. L’autoassociazione del VWF è attenuata dalle lipoproteine ad alta densità (HDL) e dall’apoliproteina (Apo) A-I, la principale componente proteica delle HDL. Entrambi riducono significativamente la lunghezza e lo spessore delle fibre VWF immobilizzate sulla superficie endoteliale. L’adesione delle piastrine a queste strutture iperadesive è anche ridotta in proporzione alla riduzione del VWF auto-associato. In un modello di TMA in topi ADAMTS13 knockout, l’HDL ha anche attenuato significativamente la trombocitopenia indotta dall’infusione di alte dosi di VWF umano.69 Coerentemente con la capacità dell’ApoA-I di modulare l’autoassociazione del VWF, la sua concentrazione plasmatica è correlata inversamente al livello di VWF iperadesivo in pazienti con TTP e sepsi. Questi risultati suggeriscono che l’interferenza con l’autoassociazione del VWF potrebbe essere un nuovo approccio per trattare i disturbi trombotici associati al VWF iperadesivo, compresa la TTP.
La metalloproteasi che taglia il VWF è il 13° membro di una famiglia di 18 distinti enzimi di tipo ADAMTS identificati finora che condividono somiglianze strutturali.16,17 ADAMTS13 è composto da un dominio N-terminale di tipo reprolysin-type metalloprotease (M), seguito da un dominio disintegrin (D), un dominio thrombospondin-1-like (T), un dominio ricco di cisteina (C) che contiene una sequenza arginina-glicina-aspartato, un dominio spaziatore (S), sette ulteriori domini simili alla trombospondina-1 (T2-8), e due domini non identici di tipo CUB (CUB1-2) all’estremità C-terminale della molecola (Fig. 24.2). I domini CUB contengono sequenze di peptidi simili ai sottocomponenti del complemento C1r/C1s, alla proteina embrionale del riccio di mare egf e alla proteina morfogenica ossea-1.70 ADAMTS13 è una glicoproteina da 190.000 dalton che richiede Zn2+ e Ca2+, il cui gene risiede sul cromosoma 9q34 ed è prodotta prevalentemente nelle cellule stellate del fegato.71,72 L’ADAMTS13 è inibito dall’EDTA; pertanto i saggi funzionali dell’enzima vengono eseguiti al meglio su plasma citrato.12,14-17,73-77 Anche il plasma anticoagulato con eparina, clorometilchetone (ad esempio, fenilalanina-prolina-aspartato clorometilchetone), irudina e altri inibitori diretti della trombina (DTI) sarebbe soddisfacente per i test. Anche il siero opportunamente trattato con inibitori della proteasi è adatto per i test.78
La scissione di VWF da parte di ADAMTS13 dipende dai cambiamenti conformazionali di VWF indotti dallo shear stress, una forza che cambia la conformazione dei multimeri di VWF da globulari ad aperti.79 Questa transizione conformazionale è seguita dallo spiegamento di uno o più domini A2 all’interno del multimero VWF, esponendo il legame peptidico Tyr1605-Met1606 alla scissione da parte di ADAMTS1379 o all’ossidazione di Met1606 da parte dell’ipoclorito.54 Oltre alla forza di taglio, la transizione nella conformazione accessibile è anche facilitata dai cambiamenti nella struttura del dominio A2 causati dall’attacco dei carboidrati,80 dalle sostituzioni aminoacidiche nella VWD di tipo 2A che destabilizzano il ripiegamento del dominio A2,81 e dalle mutazioni nella VWD di tipo 2B82 e dal legame della ristocetina,83 che espongono contemporaneamente il dominio A1 al legame con le piastrine e al sito di clivaggio di ADAMTS13.
Il riconoscimento e il clivaggio di VWF da parte di ADAMTS13 è stato ampiamente studiato. Prove recenti mostrano che nella molecola nativa di ADAMTS13, i domini T8-CUB C-terminali sono in contatto con i domini MDTCS N-terminali, un’interazione intramolecolare che inibisce parzialmente la capacità dei domini MDTCS di legare e scindere il substrato peptidico VWF-78. In questa conformazione nativa, l’ADAMTS13 è parzialmente autoinibito.84,85 La capacità dell’ADAMTS13 di piegarsi in questa conformazione è apparentemente facilitata dalla flessibilità conferita da quattro sequenze putative di collegamento situate tra i domini T1 e T2, T2 e T3, T4 e T5, e T8 e CUB1.86 L’autoinibizione viene alleviata quando i domini C-terminali vengono troncati o legati da anticorpi o VWF multimerico, permettendo l’impegno dei domini MDTCS con il substrato.
Sulla base di analisi delle mutazioni, studi di legame, analisi cinetiche e uso di substrati peptidici sintetici, sono stati identificati e riassunti in un modello di cerniera molecolare,87 i molteplici siti di interazione tra l’ADAMTS13 conformazionalmente attivo e il dominio VWF A2 non piegato, come illustrato schematicamente in Fig. 24.3. Con l’esposizione del VWF multimerico a un livello critico di shear stress, un esosito nel dominio A2 viene esposto per primo. Questo esosito comprende la regione elicoidale Glu1660-Arg1668 che è 65 aminoacidi C-terminale al sito di scissione e si lega al dominio spaziatore dell’ADAMTS13 con alta affinità (KD ~ 10 nM).88-90 Lo shear stress espone anche un secondo esosito a bassa affinità nel dominio A2 all’altezza o vicino a Asp1614 (sito P9′), che interagisce con Arg349 nel dominio disintegrin dell’ADAMTS13.91 L’interazione di questi due esositi con regioni complementari in ADAMTS13 posiziona il sito di scissione Tyr1605-Met1606 in VWF con il centro attivo nel dominio metalloproteasico di ADAMTS13. Ciò comporta l’interazione di Leu1603 (sito P3) in VWF con i complementari Leu198, Leu232 e L272 (sito S3) in ADAMTS13, Tyr1605 (sito P1) in VWF con Leu151 e Val195 (sito S1) in ADAMTS13 e Met1606 (sito P1′) in VWF con Asp252-Pro256 (sito S1′) in ADAMTS13.92 Il phage display e l’analisi delle mutazioni casuali confermano e mostrano che anche gli aminoacidi nella regione P3-P2′ e P11′ (Ile1616) sono importanti per la scissione.93 Quindi, l’interazione sequenziale di queste regioni complementari nelle due proteine multidominio facilita la scissione specifica del legame scissile.
La mancata degradazione dei multimeri ULVWF è stata a lungo sospettata di causare tipi idiopatici familiari e acquisiti di TTP, o di predisporre un individuo a questi disturbi (Fig. 24.4).11,94 Esperimenti critici condotti per verificare questo concetto sono stati riportati nel 1997 e 1998. Quattro pazienti con TTP cronica recidivante hanno dimostrato di essere carenti di attività plasmatica ADAMTS13.12 Poiché non è stato rilevato alcun inibitore dell’enzima, questa carenza è stata attribuita a un’anomalia nella produzione, sopravvivenza o funzione della proteasi. Durante l’anno successivo, la patogenesi del più comune tipo idiopatico acquisito di TTP è stata chiarita.13-15 I pazienti con TTP idiopatica acquisita avevano poca o nessuna attività plasmatica ADAMTS13 durante gli episodi acuti, ma questa attività aumentava verso la normalità durante il recupero. Anche se i dosaggi plasmatici di questi studi non erano fisiologici, erano comunque innovativi e informativi. Gli autoanticorpi dell’immunoglobulina (Ig) G contro l’enzima sono probabilmente responsabili della mancanza di attività della proteasi nella maggior parte dei pazienti con TTP idiopatica acquisita.13-15 Le ragioni di questa disregolazione immunitaria transitoria, così come del targeting antigenico selettivo della proteasi che taglia il VWF, non sono ancora note.
I pazienti con TTP cronica recidivante familiare hanno spesso multimeri ULVWF nel loro plasma.11,94 I multimeri di ULVWF sono rilevati utilizzando un metodo sensibile di elettroforesi su gel di agarosio in alcuni campioni di plasma di pazienti durante episodi acuti di TTP idiopatica acquisita, ma non dopo la guarigione.94 Questi risultati sono stati spiegati dai ricercatori che hanno scoperto un’assenza cronica dal plasma di ADAMTS13 nella TTP cronica recidivante familiare, così come un’inibizione transitoria dell’enzima durante gli episodi acuti di TTP idiopatica acquisita.12-15
La maggior parte dei pazienti con TTP familiare hanno meno del 5% della normale attività di ADAMTS13 nel loro plasma, indipendentemente dal fatto che il plasma sia ottenuto durante o dopo episodi acuti (a condizione che non abbiano ricevuto recentemente infusioni di plasma). La maggior parte dei pazienti con TTP idiopatica acquisita hanno meno del 5% della normale attività ADAMTS13 nel loro plasma solo durante gli episodi acuti di TTP.12-15,24,95 La grave carenza di attività ADAMTS13 nel plasma dei pazienti con TTP è correlata alla mancata scissione dei multimeri ULVWF quando emergono dalla superficie delle cellule endoteliali (vedi Fig. 24.4).59 Di conseguenza, i multimeri ULVWF secreti dalle cellule endoteliali rimangono ancorati a queste cellule e si autoassociano in lunghe stringhe59 e sono in grado di catturare le piastrine di passaggio legando il GPIbα piastrinico (Fig. 24.5). 24.5).68 (Le piastrine non si legano spontaneamente alle forme più piccole di VWF che circolano dopo la scissione dei multimeri ULVWF.)56 Ulteriori piastrine si uniscono successivamente all’aggregato piastrinico in crescita (reclutate nell’aggregato attraverso αIIbβ3 attivato), che può crescere fino a occludere il vaso (vedi Fig. 24.4).59,96 Sebbene la maggior parte dei casi di TTP idiopatica presenti una grave carenza di ADAMTS13, un sottogruppo non è gravemente carente nell’attività enzimatica misurata dai test attualmente disponibili.97 Non è ancora chiaro se ciò sia dovuto all’interferenza con l’attività enzimatica da parte di anticorpi non rilevati dai test disponibili, alla resistenza del VWF alla scissione (ad esempio, a causa di modifiche ossidative),53 o ad altre cause. Ciononostante, è probabile che molti pazienti in questa categoria beneficino ancora della terapia di scambio plasmatico.98 Va inoltre sottolineato che la carenza di ADAMTS13 non è né sensibile né specifica (l’attività di ADAMTS13 è diminuita in molti altri disturbi)99 per formulare la diagnosi di TTP acquisita.
Le stringhe di ULVWF sono in grado di staccarsi dalle cellule endoteliali in assenza di attività ADAMTS13, venendo meccanicamente interrotte con la crescente tensione generata dallo stress da taglio del fluido quando le piastrine aderiscono e si aggregano.59 Le stringhe di ULVWF-piastrine staccate possono occludere i microvasi a valle, contribuendo all’ischemia dell’organo.
L’attività di ADAMTS13 nel plasma è quasi sempre assente o gravemente ridotta nei pazienti con TTP familiare,12,100,101 come conseguenza di mutazioni omozigoti o eterozigoti composti del gene ADAMTS13.18,24,95,102,103 Le mutazioni nella TTP familiare sono state rilevate in tutto il gene in regioni che codificano diversi domini (vedi Fig. 24.2). Con una grave deficienza congenita dell’attività dell’ADAMTS13, gli episodi di TTP di solito iniziano durante l’infanzia o la fanciullezza. In alcuni pazienti, tuttavia, gli episodi evidenti di TTP non si sviluppano per anni (ad esempio, durante la prima gravidanza),102 se non mai. Quest’ultima osservazione suggerisce che in alcuni pazienti rimane un’attività residua dell’ADAMTS13 e che gli episodi acuti di TTP si scatenano quando il rilascio di ULVWF dalle cellule endoteliali supera la capacità limitata del loro ADAMTS13 di processarli. Un caso in cui questo potrebbe accadere con regolarità è durante la gravidanza: È noto che i livelli di VWF aumentano durante la gestazione.104-106 Coerentemente con questa nozione, le donne con TTP congenita sono spesso diagnosticate durante la loro prima gravidanza.29 Nei neonati con esordio neonatale di TTP congenita e meno del 5% di attività ADAMTS13, l’insufficienza renale transitoria o progressiva è spesso una componente importante del disturbo.107 Questi pazienti assomigliano clinicamente a due pazienti descritti nel 1960 da Schulman e colleghi108 e nel 1978 da Upshaw109; di conseguenza, questo sottogruppo pediatrico viene talvolta definito “sindrome di Upshaw-Schulman”.
In molti pazienti con TTP acquisita, l’attività plasmatica dell’ADAMTS13 è assente o gravemente ridotta durante gli episodi acuti, e aumenta con il recupero, sia da episodi singoli che ricorrenti.1315 Gli autoanticorpi IgG che inibiscono l’attività plasmatica dell’ADAMTS13 possono essere rilevati nel 44% – 94% di questi pazienti.13-15,102,110,111 Questi risultati suggeriscono la presenza di un difetto transitorio o intermittentemente ricorrente nella regolazione immunitaria in molti pazienti con TTP idiopatica acquisita associata a deficit di ADAMTS13. Anticorpi che inibiscono l’ADAMTS13 plasmatico sono stati identificati anche in alcuni pazienti con TTP associata a ticlopidina o clopidogrel.34,112 Non è ancora noto se un grave difetto transitorio nella produzione o nella sopravvivenza dell’ADAMTS13 si verifica in pazienti con TTP acquisita che non hanno autoanticorpi rilevabili contro l’enzima. In alternativa, la mancata rilevazione di autoanticorpi inibitori in alcuni pazienti può riflettere la sensibilità limitata dei sistemi di test attualmente in uso. Gli autoanticorpi non inibitori che potrebbero legare e potenzialmente mediare la clearance immunitaria dell’ADAMTS13 non sono rilevati dall’attuale sistema di test.
Uno studio ha valutato gli epitopi dell’ADAMTS13 riconosciuti dagli autoanticorpi policlonali in 25 pazienti con TTP acquisita,113 trovando che i bersagli degli anticorpi includevano invariabilmente la sequenza del dominio ricco di cisteina/spacer (CS); in 3 pazienti questa era l’unica regione bersaglio degli anticorpi. Gli altri 22 autoanticorpi hanno reagito con la sequenza del dominio CS più i domini CUB (64%), la sequenza metalloproteasi/disintegrina-simile/primo dominio trombospondina-1-simile (MDT) (56%), o la regione contenente la seconda-ottava ripetizione della trombospondina-1-simile (T2-8, 28%) (vedi Fig. 24.2). La regione propeptidica è stata identificata anche dal 20% degli autoanticorpi,113 indicando che la rimozione del propeptide non è richiesta per la secrezione dell’enzima attivo.114 Gli autoanticorpi inibiscono l’attività di ADAMTS13 o ne diminuiscono la sopravvivenza. In un altro studio su sette pazienti, Luken et al.115 hanno identificato gli autoanticorpi ADAMTS13 in sei pazienti che si legano esclusivamente al dominio spaziatore (S); nel settimo paziente, gli anticorpi si legano sia al dominio S che alle ripetizioni T2-8. Tramite mutagenesi, questi ricercatori hanno determinato che le regioni Thr572-Asn579 e Val657-Gly666 nel dominio spaziatore di ADAMTS13 erano gli epitopi comuni per il legame autoanticorpale.116 Quando Arg660, Tyr661, o Tyr665 sono stati sostituiti con l’alanina, il legame degli autoanticorpi dei sei pazienti con TTP è stato eliminato.117
Gli autoanticorpi contro ADAMTS13 nei pazienti con TTP acquisita appartengono prevalentemente alla classe IgG,118 sebbene siano stati rilevati anche anticorpi di classe IgM e IgA.119 Il clonaggio e il sequenziamento degli anticorpi monoclonali di pazienti con TTP acquisita mostrano che c’è un’incorporazione preferenziale del segmento genico della catena pesante VH1-69 nella regione variabile delle immunoglobuline.120,121 Questa preferenza suggerisce che la regione CDR2 o CDR3 di VH1-69 può contribuire alla specificità per un epitopo sul dominio spaziatore di ADAMTS13. In un’analisi della distribuzione dei sottotipi anticorpali in 58 pazienti con TTP acuta acquisita, sono stati rilevati anticorpi appartenenti a tutti i sottotipi IgG.118 IgG4 era il sottotipo più prevalente, presente nel 90% dei pazienti, da solo o in combinazione con altri sottotipi IgG.
La produzione di autoanticorpi ADAMTS13 è quasi certamente influenzata geneticamente. Questo fatto è sottolineato dalla scoperta in sorelle gemelle di TTP acquisita causata da autoanticorpi ADAMTS13.122 Le ricadute si verificano nel 23% – 44% dei pazienti con TTP acquisita,102,110,123,124 spesso durante il primo anno dopo l’episodio iniziale.102 Le ricadute sono più comuni tra i pazienti con i più bassi livelli di attività ADAMTS13 (<10%).
La gravidanza e il periodo post-partum rappresentano una sfida speciale per quanto riguarda la TTP. In primo luogo, la preeclampsia e la sindrome HELLP (emolisi, enzimi epatici elevati, piastrine basse) hanno molte caratteristiche cliniche che si sovrappongono alla TTP e possono condividere alcune caratteristiche fisiopatologiche come la disfunzione endoteliale sistemica e la proteinuria (vedi capitolo 32).125 La sindrome HELLP può essere particolarmente difficile da distinguere dalla TTP in quanto si manifesta anche con anemia emolitica microangiopatica, livelli elevati di LDH e trombocitopenia (anche se di solito non così grave come nella TTP).126 La TTP in gravidanza può essere associata ad autoanticorpi contro ADAMTS13 e la malattia di solito si manifesta vicino al termine o dopo il parto.127 Le stime del rischio di recidiva durante le gravidanze successive variano ampiamente, variando dal 26% al 73% per gravidanza.102
L’attività plasmatica dell’ADAMTS13 negli adulti sani varia da circa il 50% al 178% del plasma normale utilizzando i test statici attualmente disponibili. Una ridotta attività di ADAMTS13 è stata riscontrata anche nelle malattie epatiche, nei tumori maligni disseminati,128 nelle sindromi infiammatorie sistemiche come quelle causate dall’endotossina,129 nella pancreatite acuta,130 nella sepsi grave e nello shock settico,131 nella DIC indotta dalla sepsi,132 e nella disfunzione d’organo indotta dalla sepsi.133-135 Inoltre, bassi livelli di ADAMTS13 possono essere trovati in gravidanza e nei neonati.136 Con l’eccezione di quelle donne peripartum che sviluppano una TTP manifesta,102,110 l’attività ADAMTS13 osservata nei pazienti con queste condizioni non è ridotta ai valori estremamente bassi (<5% del normale) trovati nella maggior parte dei pazienti con TTP familiare o acquisita.
Saggi ADAMTS13
I test ADAMTS13 determinano l’attività proteolitica, il livello di antigene e il livello degli autoanticorpi anti-ADAMTS13. I primi saggi di attività ADAMTS13 si basavano sulla degradazione di multimeri VWF purificati in presenza di agenti denaturanti e sulla quantificazione dei prodotti di scissione mediante immunoblotting,74,75 legame residuo al collagene,137 o ridotta aggregazione piastrinica indotta dalla ristocetina.138 Sebbene questi saggi siano sensibili, sono macchinosi e richiedono molto tempo per essere eseguiti e implicano l’uso di denaturanti. Questi saggi sono stati soppiantati dopo che gli studi sui frammenti ricombinanti di VWF hanno rivelato sequenze minime necessarie per le misurazioni dell’attività. Kokame e colleghi hanno eseguito delezioni parziali del dominio VWF A2 e hanno identificato un peptide minimo di 73 aminoacidi (VWF73, Asp1596-Arg1668) che è stato efficacemente scisso da ADAMTS13 in assenza di denaturanti in condizioni statiche.88 Successivamente, sono stati sviluppati diversi saggi basati sulla scissione di peptidi che comprendono VWF73, come il trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza (FRET),97 un VWF78 legato a HRP,139 ELISA,140 immunoblotting,141 e la spettrometria di massa142 .
Nel 2008, è stato condotto un secondo studio collaborativo internazionale per confrontare le prestazioni di otto test funzionali e tre test antigenici per l’ADAMTS13.143 Il confronto di questi metodi ha dimostrato che i test di scissione basati su peptidi VWF modificati come substrati offrono un’elevata accuratezza e riproducibilità e una bassa varianza e variabilità tra i metodi. Il test FRET-VWF73 è stato ampiamente utilizzato per quantificare l’attività di ADAMTS13 in campioni di pazienti. Anche se facile da eseguire, il test basato su FRET ha diverse limitazioni. In primo luogo, la scissione FRET-VWF73 utilizzando il plasma citrato come fonte di ADAMTS13 dovrebbe essere effettuata al di sotto dei 33°C poiché una significativa inattivazione irreversibile di ADAMTS13 da parte della chelazione del calcio mediata dal citrato avviene a 37°C. In secondo luogo, il rilevamento ottimale del segnale di fluorescenza richiede l’esecuzione della scissione del substrato FRET-VWF73 a pH 6,1, che riduce il tasso di scissione. In terzo luogo, a questo pH subottimale, alcuni autoanticorpi inibitori non formano complessi stabili con ADAMTS13, e questi anticorpi rimangono non rilevati negli studi di inibizione. Quarto, interferenza significativa del segnale di fluorescenza da emoglobina e bilirubina si verifica a causa della sovrapposizione spettrale. È stato sviluppato un substrato peptidico migliorato basato sulla FRET, FRETS-rVWF71. L’attività di ADAMTS13 nel siero e nel plasma citrato o eparinizzato può essere misurata con questo substrato migliorato a pH fisiologico, forza ionica e concentrazione di calcio, senza interferenze dai multimeri VWF endogeni, o dalla bilirubina o dall’emoglobina nel plasma.78 Un’altra limitazione di questi saggi di attività basati sul peptide è che la capacità di ADAMTS13 di scindere VWF multimerico sotto stress da taglio non è valutata. Anche se lo stress di taglio prodotto dal vortice costante ha dimostrato di promuovere la scissione di VWF multimeri,144 quantificazione dei prodotti di scissione da immunoblotting rimane tempo. Sono disponibili almeno quattro kit commerciali per la misurazione dell’attività di ADAMTS13 basati su metodi riportati. Tuttavia, questi kit non sono stati valutati in studi di confronto diretto e standardizzazione.
I livelli di antigene ADAMTS13 sono stati quantificati da anticorpi monoclonali e policlonali.145,146 L’influenza di troncamenti, mutazioni e autoanticorpi sull’accuratezza e la sensibilità di questi test non è chiara. Sono disponibili cinque kit di test commerciali per misurare i livelli di antigene ADAMTS13, ma non sono stati eseguiti la convalida e il confronto con altri test.
Nel 2015, il primo standard internazionale per ADAMTS13 è stato stabilito e testato in 32 laboratori di 14 paesi per l’attività ADAMTS13 e i livelli di antigene rispetto agli standard locali.147 Questo standard plasmatico, denominato WHO IS (12/252), è stato derivato da plasma pooled di 38 donatori sani normali. Questo studio ha mostrato un valore medio di consenso di 0,91 unità/mL di attività ADAMTS13 per questo plasma con una variabilità interlaboratorio del 12,4% e 0,92 unità/mL di antigene ADAMTS13 con una variabilità interlaboratorio del 16,3%. La grande variabilità interlaboratorio non era dovuta principalmente all’uso di diversi standard locali, ma a differenze metodologiche tra i laboratori.
I test degli autoanticorpi anti-ADAMTS13 sono tipicamente eseguiti mescolando plasma paziente inattivato al calore con una quantità nota di plasma normale e misurando l’attività ADAMTS13 residua. Gli anticorpi non neutralizzanti sono rilevati mediante immunoblotting.148
Anche se finora non è stato identificato alcun inibitore non anticorpale specifico per ADAMTS13, diverse proteine e peptidi possono inibire la scissione di VWF di ADAMTS13 in condizioni particolari. Questi includono l’emoglobina, IL-6, la trombospondina-1 e le α-defensine dei neutrofili. In tutti i casi, gli agenti inibitori apparentemente legano il substrato, VWF, impedendo al VWF di essere scisso da ADAMTS13. È stato dimostrato che l’emoglobina agisce in questo modo, legando le stringhe di VWF sulla superficie endoteliale sotto flusso e bloccando competitivamente la scissione da parte di ADAMTS13.149 Questo meccanismo può contribuire alle complicazioni vaso-occlusive nei pazienti con malattia falciforme con emolisi significativa e complicare ulteriormente la TTP quando i tassi emolitici sono elevati. Alte concentrazioni di IL-6 (50 e 100 ng/mL) inibiscono anche la scissione mediata da ADAMTS13 delle stringhe endoteliali ULVWF sotto flusso in vitro,50 suggerendo che questo meccanismo può contribuire alla trombosi durante la tempesta citochinica150 o la sindrome da rilascio di citochine.151 La trombospondina-1, una proteina abbondante negli α-granuli delle piastrine che viene rilasciata nella circolazione all’attivazione delle piastrine, si lega alle regioni A2-A3 del VWF, bloccando e inibendo competitivamente la scissione da parte di ADAMTS13 in vitro.152 Questa proprietà protrombotica della trombospondina-1 è coerente con il reclutamento difettoso delle piastrine nell’endotelio attivato o danneggiato e l’aumentata embolizzazione dei trombi piastrinici osservata nei topi knockout della trombospondina-1.153 I peptidi neutrofili umani noti come α-defensine, rilasciati dai neutrofili attivati, possono legare il dominio VWF A2 e bloccare competitivamente la scissione mediata da ADAMTS13.154 Le concentrazioni di α-defensine aumentano fino a sette volte nel plasma dei pazienti con TTP acquisita.