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A brief history of T. reesei

Le più antiche pratiche biotecnologiche che coinvolgono funghi per la produzione di birra, vino e formaggio potrebbero risalire a diversi millenni fa, cioè all’inizio stesso della civiltà letterata. Al contrario, la scoperta dell’ascomicete filamentoso mesofilo Trichoderma reesei (poi Trichoderma viride) per il suo sorprendente potenziale di produrre cellulasi extracellulare è avvenuta poco più di 70 anni fa. Inizialmente il potenziale distruttivo dell’originale Trichoderma sp. isolato dalla putrefazione di attrezzature dell’esercito americano nelle isole Salomone durante la seconda guerra mondiale era considerato piuttosto problematico. Tuttavia, non passò molto tempo prima che i ricercatori dei Natick Army Research Laboratories guidati da Mary Mandels e Elwyn T. Reese, il ricercatore che dà il nome, cercarono di trasformare questo potenziale problematico in prodotti mirati. In uno screening di 14.000 muffe della Quartermaster Collection Trichoderma sp. QM6a ha mostrato un’eccezionale capacità di degradare la cellulosa cristallina nativa. La denominazione “QM6a” per l’ultimo isolato originale di Trichoderma rimasto, che lo identificava come la sesta di sei colture del fungo conservate presso la Quartermaster Collection di Natick, è rimasta. Questo particolare ceppo non solo è considerato il ceppo di riferimento del T. reesei, ma è anche il ceppo da cui sono stati derivati tutti i mutanti usati oggi nell’industria.

Allora come oggi, la ricerca sul T. reesei è stata spinta dall’idea che le sue cellulasi secrete potrebbero avere un impatto rivoluzionario sulla lotta di 200 anni per produrre economicamente combustibili da biomasse lignocellulosiche rinnovabili. La ricerca su T. reesei ha aperto la strada al concetto di saccarificazione enzimatica della cellulosa mediante una combinazione sinergica di diverse attività cellulasiche e ha posto le basi per la nostra attuale comprensione della regolazione degli enzimi coinvolti. La sua principale cellobioidrolasi CBH1 (CEL7a) è stata anche la prima cellulasi eucariotica ad essere clonata e la prima cellulasi la cui struttura è stata risolta. Un passo importante verso l’applicazione industriale delle cellulasi di T. reesei è stato lo sviluppo di efficienti procedure di mutagenesi del ceppo e di screening negli anni ’70. Nei due decenni successivi, il titolo della proteina extracellulare prodotta dal ceppo originale QM6a poteva essere aumentato fino a 20 volte attraverso programmi di mutagenesi al Natick e alla Rutgers University. Questi ultimi culminarono nell’isolamento del ceppo RUT-C30 (dove “RUT” sta per Rutgers). Anche se il gold standard per la produzione di cellulasi nell’industria è stato riportato essere superiore a 100 g/L, questo ceppo è ancora il prototipo di iperproduttore di cellulasi disponibile al pubblico dominio con titoli di proteina extracellulare che raggiungono i 30 g/L sul substrato che induce la cellulasi, il lattosio.

All’inizio, tuttavia, altre applicazioni commerciali per le cellulasi sono state sviluppate quando è diventato chiaro che la saccarificazione efficiente e completa della biomassa lignocellulosica in zuccheri fermentabili richiede molte più attività enzimatiche di quanto inizialmente previsto. Anche in questo caso, la ricerca che ha coinvolto T. reesei ha continuato ad aprire nuovi orizzonti nell’enzimologia della degradazione della cellulosa e dell’emicellulosa e lo fa ancora oggi. La microscopia a forza atomica ad alta velocità ha ora anche visualizzato la degradazione della cellulosa dimostrando come la principale cellobioidrolasi CBH1/CEL7A scivoli unidirezionalmente lungo la superficie della cellulosa. All’inizio degli anni ’90, le tecniche di trasformazione che facilitano l’ingegneria genetica di T. reesei sono diventate disponibili. Durante il decennio successivo queste tecnologie sono state determinanti per ottenere nuove conoscenze sulla regolazione dei suoi enzimi e per alterare il profilo enzimatico secreto dal fungo. A quel tempo, T. reesei era anche tra i primi ospiti per l’espressione di proteine dei mammiferi, come esemplificato dall’espressione della chimosina di vitello sotto i segnali di espressione cbh1 (cel7a).

Per la fine degli anni ’90, Kuhls et al. scoprirono che Hypocrea jecorina è in realtà la forma sessuale di T. reesei, motivo per cui un certo numero di pubblicazioni successive ha usato H. jecorina come nome della specie invece di T. reesei. Uno studio più dettagliato sullo sviluppo sessuale ha portato all’ipotesi che il ceppo QM6a sia di fatto sterile, il che potrebbe essere collegato a una mutazione nel gene codificante l’impalcatura della MAP-chinasi ham5.

La fine del millennio, che per la genetica può essere vista come una svolta dallo studio di geni e percorsi isolati allo studio di interi genomi, ha visto l’arrivo di T. reesei nella cosiddetta era genomica. Il primo approccio globale per studiare l’espressione genica di T. reesei nel 2003 è stato uno studio trascrittomico di Foreman et al. , che hanno costruito microarray di DNA basati su cDNA che corrispondevano a oltre 5000 trascrizioni diverse del genoma di T. reesei. Cinque anni dopo, il sequenziamento del genoma e l’analisi dell’isolato originale di T. reesei QM6a hanno posto le basi per l’applicazione su larga scala degli studi sul genoma. Negli anni successivi, l’analisi genomica comparativa di un certo numero di ceppi iperproduttori di cellulasi e di ceppi non produttori ha portato alla scoperta di potenziali nuovi fattori coinvolti nell’iperproduzione di cellulasi, come il trasporto nucleocitoplasmatico, il traffico vacuolare delle proteine e il turnover dell’mRNA. Queste analisi comparative hanno beneficiato del fatto che tutti i ceppi di T. reesei utilizzati nel mondo accademico e industriale sono derivati dal ceppo QM6a. Sessantacinque anni dopo gli studi iniziali di Elwyn Reese sulla degradazione della cellulosa da parte di T. reesei, la capacità di produzione di biocarburanti cellulosici installata in tutto il mondo è ora di 480,5 milioni di litri all’anno (MMLY) di etanolo di cui 380,5 MMLY (o circa l’80%) sono prodotti utilizzando formulazioni enzimatiche di T. reesei come Accellerase e Cellic (Fig. 1a). Senza dubbio, questo sforzo ha richiesto la maturazione della tecnologia di base a diversi livelli, tra cui l’ingegneria di processo e il pretrattamento del substrato. Tuttavia, la produzione e l’ottimizzazione delle formulazioni enzimatiche per la fase di saccarificazione della biomassa era e rimane uno dei fattori chiave che determinano il rendimento dei costi dei processi di etanolo cellulosico. Inoltre, la produzione di enzimi utilizzando T. reesei non è affatto limitata alla produzione di enzimi di bioraffinazione. Infatti, circa l’11% di tutte le formulazioni tecniche di enzimi registrate dall’Associazione dei produttori e formulatori di prodotti enzimatici sono prodotte utilizzando T. reesei come ospite di espressione (Fig. 1b, c). Infine, il T. reesei mantiene ancora la sua importanza nella ricerca, esemplificata da più di 100 articoli di ricerca che trattano il fungo o i suoi enzimi pubblicati ogni anno (Fig. 1d).

Il mix di enzimi della biomassa di T. reesei: nuove intuizioni e limitazioni

In natura la decostruzione della lignocellulosa è raramente compiuta da un singolo organismo. È piuttosto ottenuta attraverso l’ordine sequenziale e lo sforzo collettivo di diversi organismi che producono più enzimi carboidrati-attivi (CAZymes) per degradare i diversi polimeri. Quindi, non è sorprendente che la miscela di cellulasi secreta di T. reesei abbia dovuto essere significativamente adattata per fornire una formulazione enzimatica competitiva in termini di costi per la completa saccarificazione della lignocellulosa. All’inizio i ricercatori si sono resi conto che le formulazioni di T. reesei mancavano di sufficiente attività di β-glucosidasi perché la maggior parte dell’attività è legata alla parete cellulare del fungo. Di conseguenza, l’aumento dell’attività della β-glucosidasi ha migliorato la degradazione della cellulosa perché contrasta l’inibizione del prodotto attraverso il cellobiosio, che, a sua volta, viene rilasciato dall’azione cooperativa delle endoglucanasi e delle cellobioidrolasi. Questo meccanismo di feedback altrimenti rallenta seriamente la saccarificazione della cellulosa. Allo stesso modo, gli xilosaccaridi e i mannooligosaccaridi derivati dall’emicellulosa inibiscono le cellobioidrolasi di T. reesei, il che indica fortemente che sono necessarie sufficienti attività di β-xilosidasi e β-mannosidasi per degradare efficacemente la lignocellulosa. Nel 2003, Foreman et al. hanno descritto due proteine che sono coindotte con le principali cellulasi e le hanno chiamate proteine 1 e 2 indotte dalla cellulosa (CIP1 e CIP2). Da allora hanno dimostrato di essere importanti per degradare efficacemente la lignocellulosa. Risultati recenti mostrano che CIP1 ha somiglianze strutturali con le liasi, anche se non è stato possibile dimostrare l’attività liasica, e che CIP2 è una glucuronoilesterasi della famiglia CE15. Un’altra importante proteina secreta è la swollenin SWO1 che contiene un modulo di legame dei carboidrati (CBM) collegato a un dominio simile all’expansin. Nonostante l’attività di disgregazione della cellulosa, SWO1 migliora sinergicamente l’attività dell’endoxilanasi piuttosto che dell’endoglucanasi o della cellobioidrolasi durante l’idrolisi enzimatica delle stoppie di mais pretrattate. Una modalità d’azione proposta è che rende la porzione di xilano della lignocellulosa più accessibile per la degradazione da parte delle xilanasi e quindi promuove indirettamente l’azione delle cellulasi. Probabilmente la più grande rivoluzione degli ultimi anni nella degradazione della cellulosa è stata la scoperta delle monoossigenasi litiche dei polisaccaridi (LPMO). Questi enzimi hanno introdotto un nuovo meccanismo ossidativo nella degradazione dei polisaccaridi. Nella degradazione della cellulosa si presume che le LPMO agiscano sulla superficie delle fibrille cristalline di cellulosa, rendendole così più accessibili alle cellulasi. È interessante notare che questi enzimi possono ricavare gli elettroni necessari per questo processo dalla lignina della parete cellulare della pianta attraverso il trasferimento di elettroni a lungo raggio, trasformando così i meccanismi di difesa della pianta contro di essa. In alternativa, le ossidoreduttasi GMC o le deidrogenasi del cellobiosio possono funzionare come donatori di elettroni. Questa scoperta potrebbe spiegare bene come T. reesei alimenta i suoi LPMO, poiché è stato precedentemente dimostrato che diverse ossidoreduttasi GMC sono effettivamente indotte dalla paglia di grano. Tuttavia, questo meccanismo ossidativo non è affatto limitato alla depolimerizzazione della cellulosa. Originariamente dimostrato per la chitina, gli LPMO svolgono anche un ruolo nella degradazione dello xiloglucano e dell’amilosio. Nel database CAZy, gli enzimi appartenenti a questo gruppo sono stati riclassificati in “attività ausiliarie” (AA) in contrasto con la loro precedente classificazione come idrolasi dei glicosidi (ad esempio GH61) e si trovano nelle famiglie AA 9-11 e 13 . Come sottolineato in precedenza, le attività emicellulolitiche sono importanti per la completa saccarificazione della lignocellulosa (rivista da Harris et al. ). Quantità diverse di attività individuali sono richieste a seconda dei tipi di emicellulosa presenti nel substrato. È quindi degno di nota che il repertorio enzimatico di T. reesei ha alcune chiare limitazioni per alcuni tipi di legami specifici di emicellulosa. Una di queste attività mancanti è l’α-xilosidasi. L’aggiunta di α-xilosidasi a una formulazione enzimatica commerciale di T. reesei ha migliorato il rilascio di xilosio e glucosio dalla stoffa di mais pretrattata. Allo stesso modo, l’aggiunta di una cellulasi della famiglia GH 5 con attività contro il glucomannano e lo xilano ha migliorato significativamente una preparazione enzimatica sintetica di T. reesei. Altre attività che sono assenti o molto limitanti nella miscela di cellulasi di T. reesei includono l’endo-arabinasi e diverse attività di pectinasi. L’integrazione delle miscele di cellulasi commerciali con queste attività enzimatiche ha di conseguenza migliorato la saccarificazione di diversi substrati. Un’altra domanda ancora senza risposta è la funzione in vivo delle laccasi secrete, simili alle multicopper ossidasi codificate nel genoma di T. reesei.

Migliorare T. reesei come ospite per la produzione di proteine

Dato che le cellulasi e la maggior parte degli altri enzimi di degradazione della lignocellulosa sono espressi in maniera coordinata e condizionata, la loro regolazione trascrizionale rappresenta un obiettivo logico di ingegneria per migliorare la produzione di cellulasi da parte del fungo. Uno dei regolatori principali è il fattore di trascrizione CRE1 che media la repressione dei cataboliti del carbonio di tipo C2H2. CRE1 spegne la trascrizione dei suoi geni bersaglio quando sono presenti fonti di carbonio più favorevoli come il glucosio. Il suo troncamento è una delle cause principali del miglioramento della produzione di cellulasi ottenuto con programmi di mutagenesi casuale di T. reesei QM6a che portano al ceppo RUT-C30, che mostra sia un livello basale che un livello indotto più elevato di produzione di cellulasi. Allo stesso modo, la sostituzione dei motivi di legame CRE1 nella regione del promotore della principale cellobioidrolasi cel7a con quelli di un noto attivatore della cellulasi riduce la repressione del catabolita del carbonio ed eleva la trascrizione di cel7a in condizioni di attivazione e repressione. Inoltre, la trascrizione della cellulasi, della xilanasi e di un certo numero di altri geni che codificano gli enzimi coinvolti nella degradazione della lignocellulosa dipende strettamente dall’attivatore trascrizionale di tipo Zn(II)2Cys6 XYR1 . Questo è in contrasto con altri funghi tra cui i Sordariomiceti Neurospora crassa e Fusarium fujikuroi, dove l’omologo XYR1 modula esclusivamente l’espressione del gene xilanasi. Una mutazione che porta a una forma tronca di XYR1 è stata trovata per causare il fenotipo cellulasi-negativo del ceppo QM9136 che proviene dal programma di mutagenesi a Natick. Di conseguenza, i mutanti sovra e iperproduttori di cellulasi hanno livelli elevati di mRNA per gli attivatori trascrizionali xyr1 . È stato anche dimostrato che la sovraespressione di XYR1 porta ad una maggiore espressione di cellulasi e abolisce la loro repressione dei cataboliti in presenza di glucosio. Inoltre, una mutazione puntiforme all’interno di una regione regolatrice putativa di XYR1 porta ad un modello di espressione analogamente deregolato. Oltre a XYR1 e CRE1, tre fattori di trascrizione ACE1, ACE2 e ACE3 regolano l’espressione della cellulasi e della xilanasi in T. reesei. Analogamente a CRE1, ACE1 è un repressore C2H2 zinc finger e la sua delezione migliora quindi la produzione di cellulasi e xilanasi. ACE2 e ACE3, proprio come XYR1, sono attivatori di trascrizione di tipo Zn(II)2Cys6 . Quando ace2 è assente, la trascrizione delle cellulasi e delle xilanasi è ridotta di conseguenza, anche se l’induzione della cellulasi da parte del sophorose rimane apparentemente inalterata. La delezione di ace3 abolisce completamente la trascrizione della cellulasi ma riduce solo quella delle xilanasi. Mentre la sovraespressione di ACE2 non è stata ancora tentata, la sovraespressione di ACE3 porta ad un aumento delle attività di entrambi i tipi di enzimi, così come la sovraespressione di altri sei regolatori finora non caratterizzati. Questi includono due ulteriori fattori di trascrizione di tipo Zn(II)2Cys6, così come due proteine WD40, una proteina bromodomain e una acetiltransferasi legata a gcn5. Tutti e tre gli attivatori trascrizionali Zn(II)2Cys6 (XYR1, ACE2 e ACE3) assomigliano alla ben caratterizzata proteina Gal4 di S. cerevisiae. È ben stabilito che Gal4 recluta il complesso SAGA contenente Gcn5 e quindi promuove la trascrizione dei suoi geni bersaglio attraverso l’acetilazione degli istoni e la formazione di eucromatina. Infatti l’ortolano Gcn5 di T. reesei è indispensabile per l’espressione della cellulasi e coinvolto nell’acetilazione degli istoni nel promotore cbh1. Negli ultimi anni, è emerso un quadro che mostra che la trascrizione delle cellulasi e dei relativi CAZimi nei funghi è governata da una combinazione di molti fattori di trascrizione che rappresentano una complessa rete trascrizionale-regolatoria influenzata da attivatori e repressori contrastanti. In Penicillium oxalicum, per esempio, venti fattori di trascrizione modulano l’attivazione o la repressione dei geni della cellulasi. Tra questi ClrB è stato identificato come integratore chiave di tutti gli altri regolatori con i loro geni bersaglio. Omologhi di questi regolatori si trovano in T. reesei, ma data la diversità degli adattamenti nella regolazione della parete cellulare delle piante, ci si aspetta che anche altri e diversi regolatori giochino ruoli significativi. Un altro giocatore chiave nella regolazione della cellulasi è l’ortologo di T. reesei dell’enigmatico Aspergillus LaeA, che è coinvolto nella regolazione dei gruppi di geni dei metaboliti secondari in diversi funghi. Mentre la delezione di questa metiltransferasi proteica putativa porta a una forte downregulation di diverse cellulasi e altri geni CAZyme, la sua sovraespressione può promuovere fortemente la loro espressione. Effetti simili sono stati trovati per la proteina VEL1 del complesso VELVET che interagisce con LAE1.

La maggior parte degli studi sopra menzionati forniscono informazioni fondamentali sulla regolazione della formazione della cellulasi. Poiché la maggior parte di questi studi sono stati condotti nell’isolato originale di T. reesei QM6a o nel ceppo moderatamente iperproduttore QM9414, non è ancora chiaro se e in che misura questi effetti possano essere implementati nei ceppi iperproduttori. In questi ceppi, processi come la traduzione, la secrezione e il turnover degli enzimi secreti, piuttosto che la trascrizione, potrebbero limitare un ulteriore aumento della produzione di cellulasi. Sarà interessante vedere se molti dei modi riportati per migliorare l’espressione genica della cellulasi possono essere sovrapposti e come tali ceppi si comporterebbero rispetto agli iperproduttori derivati dalla mutagenesi casuale.

Il semplice aumento della trascrizione del gene di interesse non sempre porta a una migliore formazione del prodotto, specialmente nel caso di proteine non fungine. Una strategia di successo per aggirare la bassa formazione del prodotto è l’approccio del gene di fusione che utilizza oltre al promotore e al terminatore di un gene altamente espresso anche la proteina codificata come potenziatore di espressione. Per T. reesei questa è la cellobioidrolasi che codifica per cel7A che è la proteina più fortemente espressa in condizioni di induzione della cellulasi. Si ritiene che queste fusioni geniche generalmente aumentino la stabilità dell’mRNA, l’importazione nell’ER e il passaggio attraverso la via secretoria. A questo scopo, la struttura modulare di CEL7A che consiste in un modulo catalitico, un linker e un CBM viene spesso sfruttata sostituendo il CBM C-terminale con il gene di interesse. Varianti di questo approccio di fusione genica sono ora disponibili che mirano la proteina all’ER per il corretto ripiegamento, la formazione di ponti disolfuro e la glicosilazione, ma successivamente mirano all’accumulo intracellulare della proteina per evitare la degradazione del prodotto desiderato da parte delle proteasi extracellulari. Una di queste strategie usa le idrofobine con un segnale di ritenzione ER allegato come vettore. Queste proteine di fusione si auto-assemblano in strutture simili a micelle e possono essere purificate usando un sistema bifase acquoso a base di tensioattivi. Un’ulteriore strategia per indirizzare le proteine all’ER utilizza il peptide γ-zein (ZERA) derivato dalla proteina di stoccaggio del mais. Analogamente, queste proteine di fusione auto-assemblanti formano corpi proteici circondati dalla membrana ER che li protegge dalla proteolisi. Lo sviluppo di funghi come ospiti di produzione efficiente per le proteine dei mammiferi richiede anche l’inattivazione delle proteasi frequentemente incontrate nel brodo di fermentazione. In uno studio sistematico sono state identificate e inattivate diverse proteasi secrete legate alla degradazione di biofarmaci tra cui anticorpi, interferone α 2b, e insulina come fattore di crescita. Questo ha portato non solo a una drastica riduzione dell’attività della proteasi, ma anche a un forte aumento della stabilità di tutte e tre le proteine ricombinanti, con l’anticorpo che mostra l’effetto più pronunciato. Anche se l’ingegneria del modello di N-glicosilazione per la produzione di proteine terapeutiche di alto valore è stato tentato prima, la creazione di un autentico modello di glicosilazione umana in un ospite di espressione fungina non sembra fattibile al momento. È quindi discutibile se tali biofarmaci saranno prodotti da fabbriche di cellule fungine in futuro, specialmente dato il rapido sviluppo delle cellule CHO.

Le idrofobine sopra menzionate sono un altro gruppo di proteine che hanno ricevuto una notevole attenzione a causa delle loro proprietà tensioattive. Queste piccole proteine extracellulari si auto-assemblano in strati proteici alle interfacce idrofobiche/idrofile grazie alle loro proprietà anfifiliche e rendono le superfici idrofobiche bagnabili o le superfici idrofile idrofobiche. Hanno un ampio potenziale nelle applicazioni alimentari e mediche per disperdere materiali idrofobici, stabilizzare le schiume o indirizzare diverse molecole alle superfici. Le cerato-platanine sono un altro gruppo di piccole proteine secrete con quattro cisteine conservate. Si legano alla chitina e agli oligosaccaridi di N-acetilglucosamina e possiedono proprietà di auto-assemblaggio alle interfacce idrofobiche/idrofile. In contrasto con le idrofobine, le cerato-platanine migliorano piuttosto le proprietà di polarità/apolarità delle superfici. Una funzione di targeting è anche attribuita alle CBM presenti in diversi CAZimi. Possono migliorare l’attività idrolitica del dominio catalitico a cui sono attaccati e portare a un pH e una temperatura ottimali più favorevoli. Le loro proprietà di legame dei carboidrati possono inoltre essere sfruttate per la purificazione di affinità delle proteine di fusione utilizzando ad esempio colonne di cellulosa. La vasta gamma di altre applicazioni dei CBM ricombinanti è stata recentemente rivista altrove.

Trichoderma reesei per il bioprocesso consolidato e la catalisi delle cellule intere

Il bioprocesso consolidato (CBP) è classicamente inteso come l’integrazione delle fasi di produzione dell’enzima cellulolitico, idrolisi enzimatica e fermentazione di un processo di produzione di etanolo cellulosico in una singola operazione unitaria. Pertanto, sarebbe auspicabile un singolo organismo con buone proprietà cellulolitiche e un efficiente percorso di fermentazione dell’etanolo. Tuttavia, anche l’uso di consorzi microbici ha ricevuto una certa attenzione. Sfortunatamente, nessun singolo organismo che soddisfi entrambi i requisiti è attualmente disponibile (Fig. 2). Di conseguenza, sono stati intrapresi sforzi per ingegnerizzare etanologhi per diventare cellulolitici o organismi cellulolitici per diventare etanologeni. Nel contesto del primo scenario, T. reesei è spesso servito come donatore di geni CAZyme, specialmente per cel5a e cel7b che codificano due delle sue endoglucanasi e per le sue due cellobioidrolasi cel6a e cel7a (Tabella 1). In tutti gli studi pubblicati la capacità di secrezione relativamente bassa di S. cerevisiae ha limitato la conversione del substrato da parte dei CAZimi eterologhi secreti o ancorati alla membrana. Quindi, un’alta resa di etanolo con substrati cellulosici realistici richiedeva un’integrazione con cocktail di enzimi commerciali di T. reesei. Tuttavia, mentre gli sforzi per migliorare la capacità di secrezione e di visualizzazione della superficie dei ceppi di S. cerevisiae ingegnerizzati sono in corso, i ceppi attualmente disponibili che visualizzano la cellulasi hanno già il potenziale per portare a sostanziali riduzioni dei carichi enzimatici richiesti per la saccarificazione della biomassa. Nel contesto del secondo scenario, T. reesei stesso rappresenta un organismo bersaglio promettente. Ma anche se questo fungo possiede naturalmente la capacità di metabolizzare tutti gli zuccheri legati alla biomassa e convertirli in etanolo, le rese sono basse e l’acido acetico si forma come sottoprodotto indesiderato. D’altra parte, i regimi di fermentazione su larga scala per T. reesei sono ben stabiliti grazie alla sua ampia applicazione nella produzione commerciale di enzimi, e anche gli strumenti molecolari per la sua ingegneria genetica sono molto ben sviluppati. Una delle grandi sfide rimanenti per impiegare T. reesei come organismo CBP è che molte delle sue cellulasi e geni glicolitici sono repressi dall’ipossia, che è necessaria per la produzione di etanolo. Inoltre, la repressione trascrizionale delle cellulasi in presenza di etanolo rappresenta un’ulteriore sfida da superare. Tuttavia, il ceppo iperproduttore di cellulasi RUT-C30 ha una maggiore tolleranza all’etanolo rispetto al ceppo QM9414 della stirpe Natick, e quindi rappresenta un ceppo piattaforma perfetta per sviluppare T. reesei come organismo CBP, soprattutto perché è anche derepresso il catabolita del carbonio. Inoltre, in presenza di una pasta lignocellulosica, RUT-C30 mostra una morfologia simile a un pellet durante le prime fasi della fermentazione, che può essere ottenuta in modo indipendente dalla crescita con l’aggiunta del tensioattivo Triton X-100 e quindi porta anche a una maggiore produzione di enzimi. Questo è importante perché la scarsa miscelabilità e la bassa densità massima delle cellule come conseguenza della crescita filamentosa hanno finora ostacolato l’uso di T. reesei come organismo CBP. Più in generale, il bioprocesso consolidato potrebbe anche essere usato per descrivere altri processi integrati in cui il substrato non è necessariamente la biomassa lignocellulosica ma un altro biopolimero come la chitina o l’amido e il prodotto non è l’etanolo, ma qualsiasi altro metabolita. A tal fine, un certo numero di studi recenti ha mirato a sovrapprodurre diversi metaboliti attraverso l’ingegneria di T. reesei (tabella 2). Tuttavia, i rendimenti che potevano essere raggiunti erano nella maggior parte dei casi lontani dalla commercializzazione, richiedendo quindi ulteriori ottimizzazioni.

Strumenti per la progettazione e l’ingegneria cellulare

Sebbene due recensioni complete sulla cassetta degli attrezzi molecolari di T. reesei e altre specie di Trichoderma siano state date solo recentemente, vogliamo aggiornarle con i più recenti progressi nel campo. L’ingegneria mirata dei ceppi per migliorare la produzione di cellulasi o per l’ingegneria metabolica richiede metodi efficienti per introdurre alterazioni genetiche dirette nell’organismo. L’efficienza generalmente bassa del targeting genico è stata per lungo tempo una grande sfida per ottenere un numero ragionevole di trasformanti attraverso l’integrazione omologa di una delezione o cassetta di espressione. Questo problema è stato risolto principalmente inattivando i componenti della via di riparazione del DNA non-homologous end joining (NHEJ) come tku70 o tmus53 . I ceppi eliminati da Tku70 mostrano un miglioramento del targeting genico anche se l’efficienza dell’integrazione omologa in questi ceppi può ancora variare a seconda del locus target e quindi potrebbe scendere al 30%. Sulla base di questo miglioramento, un certo numero di nuovi approcci sono stati sviluppati per inserire cassette di espressione in una regione genomica definita, evitando così gli effetti pleiotropici causati dalla loro integrazione casuale. Utilizzando uno sfondo tku70, Jorgensen et al. hanno sviluppato una piattaforma di espressione che impiega il locus ade2, facile da selezionare, come sito preferito di integrazione. Dopo l’integrazione della cassetta di espressione in questo locus, ade2 viene distrutto e i trasformanti risultanti sviluppano una distinta pigmentazione rossa. In un altro studio, i loci pyr4 e asl1 sono stati scelti per sviluppare un ceppo con auxotrofia di uridina e l-arginina che permette l’integrazione diretta in questi siti. Ouaedraogo et al. hanno seguito una strategia diversa e hanno espresso la meganucleasi I-SceI di S. cerevisiae in T. reesei. I-SceI genera rotture artificiali a doppio filamento in un sito di riconoscimento I-SceI che è stato introdotto in precedenza in un locus predefinito e ha migliorato sia la trasformazione che l’efficienza di integrazione omologa. In uno studio successivo, le rotture a doppio filamento mediate da I-SceI sono state combinate con una delezione tku70. Qui, l’incapacità di riparare le rotture a doppio filamento tramite NHEJ favorisce l’integrazione della cassetta che porta a efficienze di ricombinazione omologa fino al 100%. Una rivoluzione per l’ingegneria genetica o l’editing del genoma è stata introdotta con il sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 . Sottolineando sia la necessità di una tale tecnologia che la crescente importanza come produttore di enzimi, questo sistema è stato testato per la prima volta per i funghi filamentosi in T. reesei . Esso introduce specifiche rotture del doppio filamento di DNA per stimolare il targeting del gene e dipende solo da una nucleasi Cas9 (associata a CRISPR) che utilizza un singolo RNA guida chimerico per il targeting. Il targeting accurato di questo RNA-guidato Cas9 ad una specifica sequenza di DNA è ottenuto dalla sequenza protospacer dell’RNA guida attraverso un semplice accoppiamento di basi. Usando 200 bp a monte e a valle delle regioni fiancheggiatrici per il costrutto di delezione del gene, è stato possibile raggiungere frequenze di HR superiori al 90%. Doppie delezioni e delezioni triple si sono verificate con una frequenza del 45 e del 4%, rispettivamente, dopo un singolo ciclo di trasformazione. Mentre in questo studio gli RNA guida trascritti in vitro sono stati cotrasformati con la cassetta di delezione in un T. reesei esprimente Cas9, Nødvig et al. hanno usato due sequenze di ribozima di accompagnamento per liberare gli RNA guida da una trascrizione più grande che codifica anche l’enzima Cas9 in diversi Aspergilli. Un altro strumento essenziale necessario sia nell’espressione della proteina ricombinante che nell’ingegneria dei ceppi sono i promotori che permettono l’espressione genica in modo controllabile. Anche se un certo numero di promotori inducibili e reprimibili sono disponibili con le diverse regioni del promotore della cellulasi, di solito hanno degli svantaggi poiché la loro espressione è legata al metabolismo dell’ospite e gli attivatori potrebbero essere limitanti a causa degli effetti di titolazione del promotore. Alternative utili includono una serie di geni di T. reesei reprimibili alla metionina con diversa forza di espressione basale. È stato dimostrato che uno di questi promotori può guidare l’espressione repressiva di diversi geni reporter su diverse fonti di carbonio tra cui la paglia di grano. In uno studio simile, il promotore di un gene della permeasi di rame di T. reesei è stato utilizzato per controllare l’espressione del principale regolatore di cellulasi ed emicellulasi xyr1 in assenza di rame. Tuttavia, dato che gli enzimi contenenti rame della famiglia AA 9 sono componenti importanti della miscela di cellulasi di T. reesei, è tuttavia dubbio che questo sistema possa essere applicato in uno scenario di produzione di cellulasi.

Oltre a questi eccitanti strumenti molecolari, sono ora disponibili anche alcuni vecchi trucchi della genetica classica. Lo sviluppo dei ceppi di T. reesei è stato a lungo ostacolato dal fatto che si pensava che il fungo fosse asessuato, impedendo l’incrocio dei ceppi. Una pietra miliare a questo proposito è stata la scoperta che QM6a ha un locus MAT1-2 del tipo di accoppiamento e può essere facilmente incrociato con alcuni isolati MAT1-1 di T. reesei wild-type. Ma quando il locus MAT1-2 di QM6a è stato sostituito dalla sua controparte MAT1-1, non si sono formati stromata al confronto con il ceppo originale MAT1-2 QM6a. Di conseguenza, era impossibile sfruttare l’accoppiamento per l’ingegneria dei ceppi nei diversi ceppi accademici e industriali di T. reesei derivati da QM6a. Utilizzando un approccio biologico dei sistemi, il gene mancante responsabile della sterilità femminile è stato identificato come ham5 . In N. crassa, ham-5 codifica per una proteina che serve come scaffold MAP kinase durante la fusione cellulare. La reintroduzione di un ham5 funzionale ripristina la formazione di stromata nel ceppo QM6a e permette il ripristino della fertilità femminile in altri ceppi provenienti da QM6a. Questa scoperta è particolarmente importante perché l’incrocio con i suddetti isolati di H. jecorina può portare a progenie segmentalmente aneuploide. Con questo strumento in mano, si pongono le basi per identificare le mutazioni rilevanti che portano ad esempio all’iperproduzione di cellulasi. Questo è importante perché gli approcci tradizionali di complementazione per identificare i geni che causano fenotipi mutanti sono stati in gran parte infruttuosi in specie come T. reesei. E anche se il sequenziamento ad alta velocità e l’analisi comparativa del genoma possono facilmente identificare le mutazioni nella linea di ceppi QM6a di iperproduttori e non produttori di cellulasi, solo in pochi casi questo ha già portato al collegamento di una mutazione ad un particolare fenotipo. Ma nei casi in cui è stato trovato un numero elevato di mutazioni o le mutazioni hanno colpito geni con funzione sconosciuta, l’analisi di sequenza comparativa non ha rivelato la natura dei geni bersaglio desiderati. Diversi ricercatori hanno quindi applicato con successo l’analisi segregante di massa in combinazione con il sequenziamento di prossima generazione per identificare le mutazioni rilevanti. In questo approccio, il mutante viene incrociato con un ceppo di riferimento e i DNA genomici dei segreganti che mostrano il fenotipo desiderato vengono messi in comune e sequenziati. Il confronto del genoma di questo pool di DNA sequenziato con i genomi dei ceppi parentali può quindi rivelare mutazioni conservate rilevanti per il fenotipo. Le mutazioni che non sono correlate al fenotipo saranno sottorappresentate. Anche se non ci si può aspettare che questo approccio porti all’identificazione di una singola mutazione perché le mutazioni vicine alla mutazione rilevante di solito co-segregano, il numero di obiettivi per ulteriori indagini è notevolmente ridotto.