8.3 Test chimici
La visualizzazione dei componenti dei PHGs sulle piastre TLC è possibile tramite l’uso di reagenti generali per i fenoli; cloruro ferrico, vanillina e acido cloridrico (danno una gamma di colori rosa con i derivati del resorcinolo o floroglucinolo), o usando test più specifici con 2,4-dinitrofenilidrazina (rileva le aldeidi). Il reagente di Folin-Ciocalteu è anche utile per rilevare i fenoli con nuclei di catecolo o irochinone (macchie blu appaiono immediatamente dopo la spruzzatura della piastra TLC) o per altri fenoli, che mostrano macchie da blu a grigie quando la piastra viene affumicata con vapore di ammoniaca. Il reagente di Gibbs (2% 2,6-diclorochinone cloroimmide in cloroformio) seguito dall’affumicatura della piastra con 2M NH4OH dà una varietà di colori (ad esempio, è in grado di distinguere l’acido vanillico – colore rosa – e l’acido isovanillico – blu). I derivati dell’acido cinnamico danno una caratteristica fluorescenza blu chiaro quando esaminati sotto UV (366 nm). Gli isomeri cis e trans degli acidi cinnamici sono presentati sulle piastre TLC quando l’estratto viene cromatografato in solventi acquosi in due direzioni (2D-TLC). I metodi spettrofotometrici per la stima del contenuto fenolico sono usati frequentemente, per esempio, il metodo con il reagente di Arnow o il già menzionato reagente di Folin-Ciocalteu.
Alcuni test qualitativi indicano le cumarine negli estratti di piante, per esempio, Lactone ring test (le cumarine idrolizzate da alcali diluiti formano una soluzione gialla di sali di acido O-cumarico, che può essere invertita dopo acidificazione o saturazione con CO2); o Azo-coupling test (il colore rosso si sviluppa a causa della reazione con acido solfanilico diazotato in una soluzione alcalina). Le cumarine sono facilmente rilevabili sotto la luce UV (365 nm), poiché danno una caratteristica fluorescenza di colore (tranne la cumarina semplice non sostituita che non ha fluorescenza). Sono rilevate dai loro colori blu, viola, marrone, verde o giallo. Una soluzione al 10% di KOH in metanolo o una soluzione al 20% di cloruro di antimonio in cloroformio può intensificare il colore. Le idrossicumarine non mostrano spostamenti spettrali batocromici in soluzione alcalina. Nell’analisi HPLC con rilevazione diode array vari spettri UV delle cumarine consentono una rapida identificazione dei composti.
I cromoni reagiscono in soluzioni alcaline per dare O-idrossi-β-dichetoni senza rigenerazione dell’anello γ-pirone e anche composti colorati con acido concentrato e alcali concentrato. I cromoni sono anche visibili alla luce UV (blu, giallo, giallo verdastro, fluorescenza marrone a 365 nm).
La presenza dell’anello fenilico attivo (cromoforo) nei flavonoidi li rende facilmente rilevabili alla luce UV. I loro spettri UV sono particolarmente informativi, fornendo informazioni strutturali che possono distinguere il tipo di fenolo e il modello di ossidazione. Sono possibili diverse reazioni chimiche mediante spruzzatura dei cromatogrammi TLC; per esempio, la visualizzazione in presenza di vapore di ammoniaca (i calconi e gli auroni diventano arancioni e rossi, rispettivamente) o la spruzzatura con Naturstoff Reagenz A (soluzione all’1% dell’estere di 2-amminoetanolo e acido difenilborico) e sovraspruzzatura con il 5% di soluzione metanolica di polietilenglicole 4000 (PEG 4000), che aumenta la sensibilità di questa reazione. Dopo la derivatizzazione, i composti potrebbero essere osservati alla luce UV (fluorescenza da giallo chiaro a verde). Altri test includono la spruzzatura con cloruro ferrico, acido solfanilico diazotizzato (entrambi sono reazioni per i fenoli), e la reazione specifica; cianidina con polvere di magnesio in presenza di acido cloridrico (indica la presenza di flavanoni e diidroflavanoli) . Per la stima colorimetrica quantitativa dei flavonoidi si usa la reazione con cloruro di alluminio (AlCl3) (assorbanza misurata a 425 nm). I flavonoidi dissolti in soluzioni alcaline danno un colore giallo intenso, che diminuisce dopo l’aggiunta di acido. Gli spettri UV dei composti flavonoidi mostrano due bande principali (massimi di assorbanza): la banda I a lunghezza d’onda maggiore (attribuita alla parte cinnamilica della struttura flavonoide) e la banda II a lunghezza d’onda minore (dovuta alla parte benzoilica). La banda I è normalmente a 304-350 nm per i flavoni (H a C-3 nell’anello C), a 352-385 nm per i flavonoli (gruppo OH a C-3), e a 328-357 nm per i flavonoli 3-sostituiti (sostituzione O a C-3). La banda II per la maggior parte delle strutture è a circa 250-280 nm. Un gruppo fenolico aggiuntivo (-OH) nell’anello A causa lo spostamento batocromico (spostamento verso lunghezze d’onda più lunghe) nella banda II, e un gruppo aggiuntivo -OH nell’anello B genera un effetto simile nella banda I.
La maggior parte degli antrachinoni o i loro glicosidi formano cristalli gialli o rosso-arancio e possono mostrare una fluorescenza dipendente dal pH. La principale reazione di colore è il test di Bornträger, che si effettua sciogliendo il chinone in mezzo acquoso alcalino. La reazione cromatica va dal rosso-arancione al viola-violaceo (a seconda della struttura e dei sostituenti del chinone). Gli antrachinoni danno un colore rosso con questa reazione. Per gli 1,8-diidrochinoni si usa anche la reazione con acetato di magnesio. Gli antrachinoni possono essere rilevati su piastre TLC dopo averli spruzzati con una soluzione metanolica di KOH al 10%. I colori originali gialli o giallo-marroni cambiano in rosso, viola, verde o viola. Il rabarbaro in polvere potrebbe essere esaminato alla luce UV per rilevare la presenza di raponthicin (glicoside stilbenoide, che è tossico). Nel rabarbaro originale (Rheum palmatum) appare una fluorescenza rosso-marrone, ma non si vedono macchie blu-violette brillanti (come nel caso del rabarbaro rapontico-Rheum rhaponticum).
Come si è detto in precedenza le saponine sono composti attivi sulla superficie (modificano la tensione superficiale) e hanno proprietà emulsionanti. Per un rapido controllo qualitativo se una pianta ha saponine, è comunemente usato un test di schiumosità agitando il materiale vegetale con acqua. Le saponine hanno proprietà di permeabilizzazione delle membrane. Basse concentrazioni di saponine sono in grado di distruggere le membrane degli eritrociti (che possono precipitare il colesterolo che esiste nelle membrane dei globuli rossi), causando l’emolisi del sangue in vitro. Questa capacità ha portato all’uso diffuso dell’emolisi (indice emolitico-IH) come metodo per determinare l’attività biologica. L’IH è definito come la quantità di sospensione isotonica al 2% di sangue bovino (in mL), che subisce emolisi quando viene trattato con 1 g di materiale vegetale testato (o estratto testato). Come riferimento è stata usata la miscela di saponine di Gypsophila paniculata (IH=30.000) o Saponin Album (Merck) (IH=15.000). Come descritto da Hostettmann e Marston, l’attività emolitica dei saponosidi varia considerevolmente con la struttura della parte glicosidica. Le saponine monodesmosidiche (tranne gli acilglicosidi e la glicirrizina) sono fortemente emolitiche. Nessuna reazione di colore è particolarmente specifica per gli SPG. Tuttavia, è disponibile la reazione di Lieberman (con anidride acetica in presenza di acido solforico), dove i colori differiscono a seconda del tipo di aglicone (triterpene-rosa al rosso -o steroide- blu-verde) .
Le reazioni chimiche per identificare i CRG nel materiale vegetale possono essere dovute agli agliconi o agli zuccheri. Il test di Liebermann e Salkoviski indica la parte steroidea, quindi non è specifico per i CRG. I test di Keller Kiliani e Xanthidrole, entrambi indicano i deossiglucidi (digitoxosio o cimarosio). La reazione di Kedde o Baljet è più specifica, perché è legata alla presenza dell’anello lattonico α,β-insaturo. La reazione fluorescente dei CRG è anche possibile, per esempio, il gruppo idrossile della digossina a C-14 e C-16 elimina l’acqua con H2SO4 con la formazione di due doppi legami aggiuntivi. Questo risulta in un sistema coniugato (con un doppio legame nell’anello lattone) che rende la digossina fluorescente alla luce UV. La reazione Jensen (dopo la spruzzatura con acido tricloroacetico in etanolo) è usata per visualizzare i CRG sui cromatogrammi TLC.
La misurazione diretta dell’HCN totale tramite idrolisi acida dei glicosidi cianogenici presenti negli alimenti e la decomposizione delle cianoidrine intermedie in HCN ha il vantaggio di essere applicabile a tutti i tipi di campioni, anche se non tutto il potenziale HCN dei glicosidi cianogenici è probabilmente disponibile in vivo. La visualizzazione della presenza di questi composti nelle piante è possibile su carta da filtro impregnata di reagenti, come acido picrico/carbonato di sodio o benzidina/acetato di rame. Questi reagenti sono in grado di dare reazioni di colore con l’HCN rilasciato dal tessuto vegetale schiacciato. Una carta impregnata viene posta in una provetta sopra il materiale vegetale frantumato e lasciata incubare a 40°C per 2 ore. Un cambiamento di colore da giallo a marrone-rossastro indica il rilascio enzimatico di HCN. La carta picrata non è completamente specifica per il cianogeno (gli isotiocianati volatili delle specie di Brassica rispondono anche a questa reazione). Pertanto viene utilizzato anche un altro test utilizzando una miscela (1:1) di soluzioni appena preparate di 1% 4,4-tetrametildiamina difenilammina in cloroformio (w/v) e 1% rame etil acetoacetato in cloroformio (w/v). La reazione cromatica passa da un debole blu-verde a un verde brillante. Un altro possibile metodo richiede la distillazione del tessuto vegetale in acqua acida e la titolazione dell’HCN rilasciato con nitrato d’argento. I metodi cromatografici come HPLC/MS o GC/MS dei derivati trimetilsilici sono efficaci per l’analisi dei singoli glicosidi cianogenici o cianoidrine, e forniscono la caratterizzazione chimica così come la quantificazione dei composti.
A causa della diversità dei prodotti formati nelle piante da glucosinolati (a seconda della sua struttura aglicone) stima di isotiocianati con il metodo spettrofotometrico (dove i prodotti di colore 1,3-benzodithiol-2-tiones sono formati da condensazione isotiocianato con 1,2-benzene-dithiol) può essere insufficiente per determinare il contenuto di glucosinolato nelle piante.