Abstract
Un Labrador maschio di cinque anni è stato presentato a Teaching Veterinary Clinics of GADVASU con una denuncia primaria di addome disteso, febbre e anoressia. Il cane è stato trovato ottuso con temperatura rettale elevata (104°F), frequenza cardiaca (148 al minuto) e frequenza respiratoria (58 al minuto). L’esame dello striscio di sangue e il test PCR hanno rivelato che il cane era positivo per Babesia gibsoni. Bilirubina elevata, alanina amino transferasi (ALT), fosfatasi alcalina (ALP), creatinina, azoto ureico nel sangue (BUN), conta totale dei leucociti, ipoalbuminemia e ipoproteinemia erano alterazioni ematobiochimiche. La radiografia e l’ecografia hanno mostrato rispettivamente un aspetto di vetro smerigliato e un’area anecoica dell’addome.
1. Introduzione
La babesiosi canina è una delle più importanti malattie emoprotozoiche dei cani, pericolose per la vita, causate da parassiti protozoi intraeritrocitari del genere Babesia, riportati in tutto il mondo e in varie parti dell’India, compreso lo stato del Punjab. La prevalenza variabile sia di B. canis che di B. gibsoni è stata osservata in India (da 0,66 a 21,7%) e a Ludhiana la prevalenza è stata registrata come 5,26%. La patogenesi della babesiosi canina varia in diverse regioni, probabilmente a causa della variazione nella patogenicità dei diversi ceppi di specie Babesia in varie condizioni ecologiche. La gravità della babesiosi è legata al grado di replicazione del parassita nei globuli rossi dell’ospite con successiva lisi cellulare. Un’ampia varietà di segni clinici come anoressia, letargia, ittero, vomito e marcata perdita della condizione corporea sono stati osservati insieme a variabili anomalie clinicopatologiche tra cui emoglobinuria, ipoglicemia, disturbi acido-base, azotemia, ed elevazioni dei livelli di enzimi epatici. Inoltre, B. gibsoni causa anemia emolitica rigenerativa e trombocitopenia. La sferocitosi e i risultati positivi del test di Coombs diretto suggeriscono una componente immunomediata. La trombocitopenia è un riscontro frequente. Nella presente comunicazione descriviamo le osservazioni clinico-ematobiochimiche, radiografiche ed ecografiche in un caso molto raro di versamento peritoneale dovuto all’effetto patogeno dell’infezione da Babesia gibsoni.
2. Descrizione del caso
Un cane Labrador maschio di cinque anni è stato presentato al Veterinary Teaching Hospital della Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University, Ludhiana, luglio 2013, con distensione addominale e anoressia persistente negli ultimi due giorni. Il cane aveva mostrato cattive condizioni corporee. Durante l’esame fisico, il cane era piretico (104°F), con una frequenza cardiaca di 148 battiti al minuto e una frequenza respiratoria di 58 respiri al minuto. Le membrane mucose erano pallide. Le zecche sono state rimosse dal cane e sono state identificate come Rhipicephalus sanguineus.
I campioni di sangue sono stati sottoposti ad analisi ematologica e biochimica del siero.
2.1. Analisi ematologica e biochimica
L’analisi ematologica e biochimica ha rivelato un’anemia da moderata a grave con bilirubina elevata, alanina amino transferasi (ALT), fosfatasi alcalina (ALP), creatinina, azoto ureico nel sangue (BUN), conta leucocitaria totale, ipoalbuminemia e ipoproteinemia come alterazioni ematobiochimiche (tabella 1). L’insufficienza epatica cronica in caso di babesiosi potrebbe portare all’ipoalbuminemia. I parametri ematologici hanno suggerito che il cane potrebbe avere parassiti del sangue o altre malattie infettive rilevanti. La patogenesi dell’anemia sembra coinvolgere meccanismi non emolitici ed emolitici. L’emolisi può coinvolgere le proteasi prodotte dal parassita invasore, una reazione immunitaria alle cellule parassitate e/o danni ossidativi agli eritrociti. I valori MCV, MCH, e MCHC erano appena al limite del range di normalità (Tabella 1) indicando che l’anemia non era dovuta a carenza di ferro ma MCV e MCHC spesso non riescono a differenziare correttamente i vari modelli di anemia. L’anomalia più comune era la trombocitopenia. La ragione della trombocitopenia nella babesiosi potrebbe essere dovuta al sequestro piastrinico nella milza o alla distruzione piastrinica mediata dal sistema immunitario e allo sviluppo della coagulazione intravascolare disseminata.
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2.2. Esame parassitologico
Per distinguere tra queste possibilità, l’esame microscopico degli strisci di sangue sottile colorati con Giemsa, preparati dal margine dell’orecchio, è stato effettuato sotto la lente a immersione in olio (100x). L’esame ha rivelato la presenza di organismi a forma di anello, ovali, paracadute e virgola, di circa 1-3 μm di diametro negli eritrociti (Figura 1). Sulla base delle dimensioni dei parassiti intracellulari in questo caso, è stata considerata la possibilità che il cane sia stato infettato da piccole Babesia spp, specialmente da B. gibsoni. Il grado di parassitemia, calcolato come percentuale di globuli rossi infetti contando 1000 globuli rossi, era del 10,5%. Le zecche presenti sul cane sono state identificate come Rhipicephalus sanguineus. Il fatto che B. gibsoni non può essere distinto da altri isolati babesiani canini al microscopio ci ha spinto ad eseguire la PCR per la diagnosi finale utilizzando il primer specifico di B. gibsoni .
2.3. Estrazione del DNA
Il DNA dal sangue intero (300 μL) è stato estratto utilizzando il kit di purificazione del DNA (QIAGEN, GmbH, Germania) secondo le istruzioni del produttore.
Un set di primer comprendente un primer forward (Gib599 F): 5′CTCGGCTACTTGCCTTGTC3′ e un primer reverse (Gib1270R): 5′GCCGAAACTGAAATAACGGC 3′ è stato utilizzato per amplificare un frammento di 671 bp della regione del gene 18 S rRNA specifico per B. gibsoni. La miscela PCR consisteva in una concentrazione molare 1X di 12,5 µL di master mix (1X QIAGEN PCR buffer, 2,5 unità di Taq DNA polimerasi, 200 µM di ogni dNTP e 1,5 mM MgCl2), 1,5 µL di 10 pmol ciascuno dei rispettivi primer e 5 µL di template come fonte di DNA.
Dopo una denaturazione iniziale a 95°C per 5 min, sono stati condotti 30 cicli di denaturazione (94°C per 45 sec), annealing (57°C per 1 min), ed estensione (72°C per 1 min) e l’estensione finale è stata eseguita a 72°C per 8 min. Nella reazione di PCR sono stati inclusi un controllo negativo del campione (solo DNA di sangue canino) e un controllo negativo del DNA (acqua Milli-Q in sostituzione del DNA). I prodotti della PCR sono stati eseguiti su un gel di agarosio all’1,5% e colorati con bromuro di etidio. La dimensione del prodotto di PCR amplificato era di 671 bp (Figura 2).
2.4. Analisi del liquido peritoneale
Sulla base della distensione addominale si sospettava un’ascite. Una scheda peritoneale è stata eseguita e 2 mL di liquido peritoneale chiaro sono stati raccolti. Il fluido peritoneale è stato tipicamente esaminato per colore, torbidità, proteine totali e concentrazione di albumina. Il fluido era trasparente e chiaro. Le proteine totali e l’albumina erano 0,4 g/dL e 0,2 g/dL, rispettivamente, indicando ipoproteinemia (0,4 g/dL) e ipoalbuminemia (0,2 g/dL).
2.5. Radiografia ed ecografia
La radiografia e l’ecografia hanno mostrato rispettivamente un aspetto di vetro smerigliato e un’area anecoica dell’addome (figure 3 e 4). Il caso è stato quindi confermato come ascite. Anche se i segni clinici più comuni della babesiosi includono anoressia, letargia, febbre ricorrente, membrana mucosa pallida ed emesi, i nostri risultati hanno rivelato che è importante non trascurare la babesiosi nella diagnosi differenziale dell’ascite. I cani con ascite dovrebbero essere sottoposti alla classica diagnosi parassitologica o molecolare per escludere la babesiosi. Gli organismi di babesia infettano gli eritrociti dei cani, portando all’anemia emolitica. L’infezione da B. gibsoni è nota per causare segni clinici più gravi rispetto all’infezione da Babesia spp. di grandi dimensioni e può provocare sindromi da disfunzione di organi multipli. Poiché il cane era gravemente anemico con altre gravi anomalie nei parametri relativi agli organi vitali è morto entro due giorni dal trattamento.
3. Conclusione
Al meglio delle nostre conoscenze, questo è il primo rapporto di caso di effusione peritoneale in un cane associato con B. gibsoni diagnosticata tramite esame microscopico e reazione a catena della polimerasi (PCR) in combinazione con l’analisi del liquido peritoneale, la radiografia e l’ecografia.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non c’è alcun conflitto di interessi riguardo alla pubblicazione di questo articolo.