Spectroscopic Methods
Absorbance Spectroscopy. Per alcuni saggi enzimatici, è possibile misurare il reagente o il prodotto direttamente sulla base delle sue proprietà di assorbanza Fersht (1999). Nella reazione catalizzata dalla glucosio-6-fosfato deidrogenasi (EC 1.1.1.49), un prodotto (NADH) assorbe la luce a 340 nm, rendendo possibile monitorare la reazione seguendo l’aumento di assorbanza a questa lunghezza d’onda.
Glucosio 6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogluconato + NADH + H+
In altri casi, un reagente o prodotto è misurato indirettamente. Con l’acetilcolinesterasi (EC 3.1.1.7), per esempio, l’acetiltiocolina è usata come substrato che libera tiocolina all’esposizione dell’enzima. La tiocolina reagisce con il reagente di Ellman per produrre un prodotto colorato, rendendo possibile monitorare la reazione seguendo l’aumento dell’assorbanza.
Acetiltiocolina + H2O → acetato + H+ + tiocolina
Tiocolina + reagente di Ellman → derivato colorato
Saggi accoppiati sono talvolta utilizzati per monitorare l’attività enzimatica. In questo caso, la reazione enzimatica di interesse è accoppiata con una seconda reazione che è accoppiata per una misurazione conveniente. Un esempio di questo è il saggio per l’esochinasi (EC 2.7.1.1). In questo caso, un eccesso di glucosio-6-fosfato deidrogenasi e NAD+ è incluso nella miscela del saggio e l’assorbanza a 340 nm è monitorata.
Reazione I: Glucosio + ATP → glucosio 6-fosfato + ADP
Reazione II: Glucosio 6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogluconato + NADH + H+
In questo esempio, la reazione I dovrebbe essere limitante e la concentrazione di glucosio 6-fosfato dovrebbe raggiungere uno stato stazionario dopo un periodo di ritardo. Cleland Cleland (1979) ha formulato una procedura per assicurare che il saggio accoppiato fornisca una misura accurata della velocità di reazione dell’enzima. Se possibile, è preferibile monitorare una reazione continuamente. Con i saggi descritti sopra, lo spettrofotometro può essere programmato per dare una lettura continua in funzione del tempo. Nelle tecniche di separazione, che possono includere l’uso della radioattività, l’elettroforesi o la cromatografia, vengono impiegati saggi discontinui o a punto finale. Avendo stabilito un periodo di tempo lineare per un test, un parametro viene misurato in un singolo punto di tempo all’interno del periodo di tempo lineare (preferibilmente, un punto di tempo vicino alla metà della fase lineare). La velocità viene quindi determinata dalla differenza di segnale in quel punto temporale e all’inizio della reazione. Si deve prestare attenzione ai saggi end-point e i corsi di tempo dovrebbero essere controllati per confermare la linearità. I cambiamenti nelle condizioni di incubazione, come la temperatura, il pH o la concentrazione del substrato, possono alterare la linearità di un test. Per i saggi enzimatici di routine, il recipiente di reazione contiene tutti i componenti tranne uno, e la reazione viene avviata aggiungendo il componente mancante (l’enzima o uno dei substrati). Gli altri componenti dovrebbero essere equilibrati in termini di pH, temperatura e forza ionica. La reazione viene solitamente avviata con l’aggiunta di un piccolo volume di una soluzione concentrata del componente mancante. Un piccolo volume assicura che questa aggiunta non perturbi le condizioni di equilibrio già stabilite. Quando non è possibile aggiungere un piccolo componente, i componenti separati dovrebbero essere alla stessa temperatura, forza ionica e p H. Anche se ci deve essere una completa miscelazione dei due componenti, l’agitazione vigorosa dovrebbe essere evitata perché potrebbe denaturare la proteina enzimatica. La miscelazione può essere realizzata tramite l’inversione di una provetta con un tappo attaccato, o una cuvetta con un sigillo Parafilm. Le proteine diluite sono spesso meno stabili di quelle più concentrate, e i saggi sono spesso eseguiti in presenza di una proteina inerte, come la sieroalbumina bovina (0,25 mg/ml), per stabilizzare l’enzima purificato. Gli esperimenti dovrebbero essere eseguiti per assicurare che la proteina sia inerte. Poiché l’albumina, per esempio, può legarsi a substrati idrofobici, potrebbe non essere sempre appropriata per questo scopo. Per i saggi discontinui, il timer può essere impostato e i campioni aspirati a intervalli di tempo specifici dopo la miscelazione. Per la maggior parte degli spettrofotometri, il rilevamento viene avviato manualmente utilizzando un pannello dello strumento o una tastiera del computer. Per aggiungere un componente a una cuvetta, sono necessari circa 20 secondi per posizionare la cuvetta in uno spettrofotometro, e per iniziare la rilevazione premendo un tasto del computer. Questo tempo di solito non è di grande importanza perché per la maggior parte delle reazioni, il test viene eseguito da 10 a 30 minuti. Le misure di controllo includono un bianco non contenente enzimi e un bianco non contenente substrati. Tali controlli assicurano che non si verifichino reazioni accidentali. Il tasso di controllo (bianco non enzimatico) viene sottratto dalla data generata dall’esperimento per fornire la velocità effettiva della reazione enzimatica. Per molti saggi, è necessario spegnere o arrestare la reazione in un momento specifico per impedire l’ulteriore produzione di prodotto. Per esempio, i campioni possono essere prelevati a intervalli di 5 minuti per un periodo di tempo predeterminato e il prodotto misurato tramite HPLC.
Ogni analisi cromatografica può richiedere 30 minuti per essere completata. I metodi per terminare la reazione di solito comportano la denaturazione dell’enzima con l’aggiunta di acido, o l’immersione in un bagno d’acqua bollente. L’attività di alcuni metalloenzimi può essere spenta con EDTA o altri chelanti di ioni metallici. La maggior parte dei saggi enzimatici sono basati su tecniche spettroscopiche, e le due più comunemente usate sono l’assorbimento e la fluorescenza Fersht (1999). La lunghezza d’onda utilizzata per seguire il tasso di reazione dovrebbe essere quella che produce la maggiore differenza di assorbimento tra il substrato e il prodotto. Le misure di assorbimento vengono eseguite con uno spettrofotometro standard con i campioni contenuti in celle specializzate, o cuvette. Sono disponibili in commercio cuvette di plastica monouso che contengono campioni da 1 o 3 ml. Il loro uso è limitato alla gamma di lunghezza d’onda visibile (350-800 nm). Le cuvette di quarzo devono essere utilizzate (il vetro e la plastica assorbono la luce nella gamma UV) per le misurazioni a lunghezze d’onda inferiori a 350 nm. La lunghezza del percorso delle cuvette è fornita dal produttore. Le lunghezze più comuni sono 1,00 cm, 0,40 cm e 0,20 cm. Un numero crescente di saggi viene eseguito con piastre di microtitolazione a 96 pozzetti con fondo in plastica o in quarzo. La concentrazione di una sostanza che assorbe la luce a lunghezze d’onda specifiche può essere determinata dalla legge di Beer:
A = εcl,
dove A è l’assorbanza del campione a una determinata lunghezza d’onda, c è la concentrazione del campione, l è la lunghezza del percorso, e ε è il coefficiente di estinzione, o assorbibilità molare. ε ha le unità di M-1 cm-1 o mM-1 cm-1. Se il valore di ε è noto per una particolare sostanza, è possibile calcolare la concentrazione di quella sostanza in una soluzione misurando il suo assorbimento in quella soluzione. Usando la legge di Beer, è possibile calcolare il tasso di cambiamento della concentrazione nel corso di una reazione. Un potenziale errore usando le misure di assorbimento deriva da una deviazione dalla legge di Beer, perché essa vale solo per una gamma finita di valori di assorbimento. Quindi, poiché potrebbe non essere applicabile con assorbimenti maggiori di 1, i saggi dovrebbero essere progettati per mantenere i valori sperimentali inferiori a questo. Può essere possibile aggirare alcuni di questi problemi utilizzando cuvette con percorsi più brevi. Un campione con un’assorbanza di 1,00 in una cella con un percorso di 1,00 cm avrà un’assorbanza di 0,20 in una cella con un percorso di 0,20 cm. In generale, lavorare con un’assorbanza di circa 0,5 rappresenta un compromesso tra la minimizzazione del rumore ottico inerente a uno spettrofotometro e l’avere un segnale ragionevole da misurare. La torbidità di una soluzione può disperdere la luce e produrre un’assorbanza apparente. La filtrazione o la centrifugazione possono essere utilizzate per rimuovere queste particelle. Anche se le alterazioni nella lunghezza del percorso eludono alcune deviazioni dalla linearità (cioè, quando l’assorbanza è così alta che lo spettrofotometro non può fare una misurazione accurata), spesso le deviazioni sono dovute alle interazioni intermolecolari tra le specie assorbenti. La dimerizzazione (o la formazione di esimeri di ordine superiore) si verifica a concentrazioni più elevate delle specie assorbenti. In questi casi, la legge di Beer sarà rispettata se la concentrazione del prodotto è diminuita. Questo può essere ottenuto rallentando la reazione (diminuendo la concentrazione dell’enzima) o effettuando misurazioni per un periodo di tempo più breve (prima che si verifichino deviazioni dalla legge di Beer).