Alai

Per gli scopi di questo post del blog (ne arriveranno altri sui diversi tipi di fissativi…), ci concentreremo principalmente sull’uso della paraformaldeide/formaldeide, comunemente chiamata PFA, che è il fissativo più comunemente usato nella citometria a flusso. Il PFA si riferisce specificamente alla forma solida e polimerica della formaldeide (e si dissolve in formaldeide monomerica in soluzione acquosa), quindi ciò che di solito è indicato canonicamente come “fissazione PFA” è in realtà utilizzando la soluzione monomerica di formaldeide. In questo caso, PFA e formaldeide sono sinonimi e intercambiabili.
Una soluzione che va da 1-4% PFA è tipicamente usata per la fissazione di campioni per la citometria a flusso. Nel caso di sanificazione di campioni infettivi, concentrazioni a partire da 0,37% può efficacemente disinfettare i campioni da pazienti infetti da HIV1. Incubazione fino a 45-60 minuti con 1% PFA, e 15-20 minuti con 4% PFA (ad esempio il buffer di BioLegend) è sufficiente per fissare completamente le cellule, e le cellule possono essere utilizzati per l’elaborazione a valle (permeabilizzazione per obiettivi intracellulari) o conservati per analisi future in questa fase.
Durante una procedura di routine di colorazione in citometria a flusso che coinvolge la colorazione del marcatore di superficie, ci sono diverse fasi in cui si può decidere di fissare i campioni – fissare dopo la colorazione del marcatore di superficie, o fissare prima.
In alcuni casi, la decisione di quando si può fissare è… fissa. Per esempio, se state analizzando i fosfo-target, il legame di alcuni antigeni di superficie da parte degli anticorpi può alterare le vie di segnalazione intracellulare poco dopo il contatto, portando così ad un artefatto nei vostri risultati di fosforilazione. In tal caso, dovresti fissare le cellule prima dell’aggiunta degli anticorpi di superficie (ecco perché il nostro protocollo raccomandato da usare per il nostro True-Phos™ Perm Buffer per analizzare i target di fosforilazione intracellulare è progettato in modo che la fase di fissazione preceda altre procedure). Ognuno ha i suoi vantaggi e svantaggi, ma ecco un paio di cose a cui fare attenzione in ogni caso.