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L’ATPasi vacuolare (V-ATPasi) è una pompa protonica multi-subunità guidata da ATP che acidifica le vescicole intracellulari e il milieu extracellulare ed è quindi coinvolta in un gran numero di funzioni biologiche. Precedenti recensioni hanno elegantemente descritto la struttura e la funzione della V-ATPasi. Qui passiamo in rassegna la recente letteratura relativa alla funzione della V-ATPasi e il contributo a vari processi cellulari nella fisiologia normale con un’enfasi sul cancro. Presentiamo anche in dettaglio la regolazione di Notch e altre vie di segnalazione da parte della V-ATPasi rivelando una funzione finora meno conosciuta della V-ATPasi nella segnalazione cellulare.

Subunità isoformi

Strutturalmente, la V-ATPasi è un nanomotore rotante composto da più subunità, ciascuna con più isoforme. Le subunità sono disposte in due domini: un dominio periferico V1, responsabile dell’idrolisi dell’ATP e un dominio integrale di membrana VO, che funziona nella traslocazione dei protoni. La struttura della V-ATPasi è stata altamente conservata tra tutte le cellule eucariotiche ed è coinvolta in diverse funzioni attraverso le specie. Nei mammiferi, il dominio V1 ha otto diverse subunità (A, B, C, D, E, F, G e H) mentre il dominio VO è composto da sei diverse subunità (a, c, c’, c”, d, e). Il requisito differenziale di acidificazione nelle vescicole intracellulari e nel milieu extracellulare guida la funzione e la regolazione della V-ATPasi. Per diminuire o aumentare l’efficienza della pompa, la V-ATPasi controlla l’accoppiamento tra l’idrolisi dell’ATP e il pompaggio dei protoni. Questo processo è portato dalla subunità “a” della V-ATPasi. Allo stesso modo, il targeting specifico delle cellule e dei compartimenti della V-ATPasi dipende anche dalle isoforme della subunità “a”. VOa è una proteina integrale di membrana di 100 kDa con una coda citosolica terminale N e 9 domini transmembrana. Sono state identificate quattro isoforme della subunità “a” (a1, a2, a3 e a4) con una distinta distribuzione vescicolare e di tipo cellulare. VOa1 è espresso sulle vescicole sinaptiche e VOa2 è espresso su vescicole intracellulari come golgi e primi endosomi. VOa3 è espresso sulla membrana plasmatica degli osteoclasti, mentre VOa4 è espresso sulla membrana plasmatica delle cellule intercalate renali. Inoltre, il N-terminale della subunità ‘a’ è un motivo importante che lega il dominio V1 alla membrana ed è stato anche segnalato come un unico sensore di pH nei lisosomi. L’espressione e la localizzazione isoforma della subunità ‘a’ è fondamentale per il funzionamento della V-ATPasi.

Funzione fisiologica della V-ATPasi

La V-ATPasi è espressa ubiquitariamente e svolge diverse funzioni biologiche all’interno delle cellule della maggior parte dei tessuti attraverso l’acidificazione vescicolare, luminale ed extracellulare. Per raggiungere numerose funzioni cellulari, la V-ATPasi facilita la concentrazione localizzata di protoni nelle vescicole acide delle vie endocitiche ed esocitiche.

Acidificazione vescicolare

Endosomi e lisosomi

La V-ATPasi è meglio conosciuta per il suo ruolo nell’acidificazione di vescicole intracellulari come gli endosomi e i lisosomi. Sulla superficie degli endosomi, la V-ATPasi acidifica e quindi modula importanti processi cellulari come l’endocitosi dei recettori e il traffico vescicolare. L’acidificazione degli endosomi da parte della V-ATPasi è cruciale per l’internalizzazione endocitica dei complessi di ligandi recettoriali. Dopo l’inizio della segnalazione, il pH più basso negli endosomi rilascia il ligando riciclandolo alla membrana plasmatica. Nei lisosomi, le V-ATPasi aiutano a mantenere il pH basso di 4,5 e sono anche importanti per il trasporto delle idrolasi acide appena sintetizzate dal Golgi ai lisosomi. Inoltre, i fagosomi e gli autofagosomi nei macrofagi e nelle cellule tumorali rispettivamente, dipendono anche dal pH acido mantenuto dalla V-ATPasi per l’attività degli enzimi degradativi in questi compartimenti.

Golgi

Lo smistamento dei macchinari esocitici ed endocitici inizia nel complesso di Golgi. È importante notare che la maggior parte delle proteine subiscono la glicosilazione, una modifica posttraslazionale cruciale all’interno dell’apparato di Golgi. Mutazioni nella subunità a2 della V-ATPasi provocano la cutis laxa, una sindrome autosomica recessiva della pelle rugosa in cui si osserva un’alterata glicosilazione delle proteine della matrice extracellulare. Sebbene la V-ATPasi sia stata correlata geneticamente al difetto di glicosilazione, l’esatta relazione tra l’acidificazione del golgi e la maturazione delle proteine non è stata esplorata.

V-ATPasi specializzate

La V-ATPasi è una proteina importante espressa in compartimenti specializzati di tipi cellulari specifici. Durante la neurotrasmissione, la V-ATPasi fornisce la forza motrice protonica cruciale necessaria per la formazione di vescicole sinaptiche e il successivo accumulo di neurotrasmettitori. Nelle cellule pancreatiche, l’acidificazione dipendente dalla V-ATPasi è importante per l’esocitosi dell’insulina. La V-ATPasi regola anche l’equilibrio fissione-fusione del sistema vescicolare interagendo con il Soluble NSF Attachment protein Receptor (SNARE) e la GTPasi.

L’acidificazione luminale

Le V-ATPasi sono state inizialmente identificate sulle vescicole intracellulari, ma l’importanza delle V-ATPasi di membrana plasmatica è cresciuta enormemente. Nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale del rene, l’isoforma a4 della V-ATPasi mantiene l’equilibrio acido-base e l’acidificazione delle urine (acidosi sistemica). Allo stesso modo, nelle cellule chiare dell’epididimo, la V-ATPasi della membrana plasmatica acidifica il compartimento luminale e aiuta la maturazione e la conservazione dello sperma. Negli osteoclasti dell’osso, la V-ATPasi lisosomiale si trasferisce alla membrana plasmatica durante il riassorbimento osseo per acidificare le lacune. La V-ATPasi plasmalemmale è fondamentale per il funzionamento delle cellule interdentali dell’orecchio, delle cellule epiteliali del naso e della vista. La disfunzione della V-ATPasi è associata a condizioni patologiche come l’acidosi tubulare renale, la sordità, la compromissione del senso olfattivo e l’osteoporosi Uno schema che delinea il ruolo della V-ATPasi nell’acidificazione vescicolare e luminale è mostrato in Fig. 1.

Ruolo nei tumori

Di recente, la V-ATPasi di membrana plasmatica è stata ampiamente studiata nel cancro, dove aiuta a mantenere un ambiente intracellulare alcalino favorevole alla crescita e un ambiente extracellulare acido favorevole all’invasione. Nei tumori, l’espressione della V-ATPasi ha dimostrato di essere più alta verso il bordo anteriore delle cellule tumorali proliferanti del seno, della prostata, del polmone, delle ovaie, del fegato, del pancreas, del melanoma e dei tumori esofagei. In particolare, le cellule del cancro al seno esprimono la V-ATPasi sulla membrana plasmatica per acidificare lo spazio extracellulare e l’espressione quantitativa della V-ATPasi è correlata all’invasività e al potenziale metastatico della linea cellulare. L’esatto contributo della V-ATPasi alla crescita del tumore si ottiene attraverso la sua influenza sui meccanismi/percorsi molecolari discussi di seguito.

Immunomodulazione

L’isoforma a2 della Vacuolar ATPase (VOa2 o a2V) ha un ruolo immunomodulatore nella gravidanza e nel cancro. Gli studi che coinvolgono a2V nella biologia riproduttiva hanno portato alla luce un ruolo finora sconosciuto di questa molecola nella normale maturazione e produzione dello sperma, oltre all’impianto dell’embrione. Nel microambiente tumorale, il dominio terminale N di a2V polarizza i macrofagi verso i macrofagi associati al tumore (tipo M2) e stimola diversi sottoinsiemi di monociti attraverso la via dell’endocitosi. A seguito di questi risultati, è stato ulteriormente dimostrato che la carenza di a2V nelle cellule tumorali altera la popolazione di macrofagi residenti nel microambiente tumorale e influenza la crescita tumorale in vivo. a2V è espresso sui granuli primari dei neutrofili e aiuta a mantenere il pH nel percorso esocitico durante l’attivazione dei neutrofili. Il trattamento dei neutrofili umani con il peptide N terminale ricombinante di a2V (a2NTD) ha promosso la migrazione e la polarizzazione dei neutrofili. Insieme, questi studi evidenziano il ruolo immunomodulatorio della V-ATPasi nel suscitare potenti risposte immunitarie.

Effetto Warburg

Un segno distintivo del cancro è l’effetto Warburg dove le cellule passano dalla fosforilazione ossidativa alla glicolisi aerobica. Diversi studi indicano l’ipotesi che le cellule cancerose dipendono dalla V-ATPasi più di qualsiasi altro regolatore di pH come gli scambiatori Na+H+, i trasportatori di bicarbonato e i simpatizzanti protone-lattato per ottenere un pH intracellulare alcalino favorevole e un pH extracellulare acido. L’alcalinizzazione del citosol attiva la glicolisi mentre sopprime la fosforilazione ossidativa. Inoltre, alcuni oncogeni legati alla glicolisi come l’Hypoxia Induced Factor (HIF-1) sono regolati dall’alterazione del pH indotta dalla V-ATPase.

Proteasi acide

La conseguenza dell’acidificazione extracellulare nei tumori è l’attivazione delle proteinasi acide, che sono enzimi che scindono la matrice extracellulare durante l’invasione tumorale. Questi enzimi appartengono alla classe delle proteinasi acide come le catepsine, le Metallo Proteinasi di Matrice (MMP) e le gelatinasi e sono attive a pH acido. Inoltre, l’attività degli enzimi intracellulari come la γ-secretasi, che sono attivi a pH acido, è anche potenziata con un aumento dell’attività della V-ATPasi nelle vescicole. Successivamente, questo porta alla disregolazione delle vie oncogene come Notch.

Resistenza ai farmaci e inibitori della V-ATPasi

Il pH alterato del microambiente tumorale può influenzare la sensibilità ai farmaci chemioterapici. Le antracicline e gli alcaloidi hanno un pKa di 7-8 e sono internalizzati nel compartimento endosomiale. Dati recenti suggeriscono che l’uso di inibitori della V-ATPasi non solo provoca alterazioni del pH citosolico che portano alla morte cellulare, ma migliora anche l’assorbimento dei farmaci, rendendo così un componente efficace del trattamento combinatorio del cancro. Nel cancro ovarico, a2V è espresso sul bordo anteriore delle cellule tumorali e modula l’attività di MMP9. Inoltre, a2V contribuisce alla resistenza ai farmaci mediata dal cisplatino nel cancro ovarico e l’inibizione selettiva di a2V potrebbe servire come una strategia efficace per trattare il cancro ovarico resistente alla chemio. Gli inibitori della V-ATPasi bafilomicina e concanamicina appartengono a una classe di pleomacrolidi che mirano al settore VO e inibiscono efficacemente l’attività della V-ATPasi. Recentemente, Apicularen e archazolidi sono stati segnalati come potenti e specifici inibitori della V-ATPasi. Tuttavia, tutti gli inibitori di piccole molecole disponibili hanno una tossicità significativa considerando il coinvolgimento della V-ATPasi nella normale fisiologia cellulare. Pertanto lo sviluppo di anticorpi neutralizzanti specifici contro l’isoforma della subunità ‘a’ che ha un’espressione specifica della cellula potrebbe essere un’alternativa efficace per causare l’inibizione diretta della V-ATPasi, affrontando anche la resistenza a più farmaci indirettamente con l’uso combinatorio .

Autofagia

L’autofagia è il processo di degradazione selettiva o riciclo dei carichi consegnati dagli autofagosomi ai lisosomi. Le cellule tumorali mostrano una varia dipendenza dall’autofagia man mano che progrediscono dal tumore primario al tumore solido altamente metastatico. I carichi cellulari contrassegnati per la degradazione sono consegnati ai lisosomi dai processi autofagici. L’attività di pompaggio protonico della V-ATPasi è responsabile dell’attivazione delle idrolasi acide lisosomiali che degradano l’assorbimento del carico dagli autofagosomi. Anche se gli studi indicano il requisito della V-ATPasi funzionale per l’autofagia e l’inibitore della V-ATPasi Bafilomicina è usato come inibitore classico dell’autofagia, il ruolo esatto della V-ATPasi nelle dinamiche di membrana del flusso autofagico non è compreso. Uno studio recente ha riportato che il trattamento con Bafilomicina, che inibisce l’attività sia della V-ATPasi che della pompa Ca2+ SERCA ha portato al blocco del flusso autofagico mentre i lisosomi carenti di V-ATPasi erano ancora capaci di fondersi con gli autofagosomi. Questi risultati suggeriscono il coinvolgimento della V_ATPasi nella degradazione del carico autofagico nei lisosomi piuttosto che nel flusso autofagico ed evidenziano la necessità di sviluppare inibitori specifici e tecniche di manipolazione genica per studiare il ruolo esatto della V-ATPasi in vari importanti processi cellulari.

Signaling

La via endolisosomiale è importante per la regolazione sia positiva che negativa delle vie di segnalazione. Il primo rapporto noto del coinvolgimento della V-ATPasi nella segnalazione è venuto da uno studio che ha dimostrato che l’inibizione della V-ATPasi da parte della Bafilomicina ha influenzato l’internalizzazione di EGFR. Da allora, la V-ATPasi è stata associata alla trasduzione del segnale associata a m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β e alla regolazione della segnalazione Notch.

Segnalazione Notch

Forse la via di segnalazione più studiata regolata dalla V-ATPasi è Notch. Questo può essere attribuito al fatto che la segnalazione di Notch dipende dalla via endolisosomiale per la sua attivazione, il mantenimento e la degradazione dei mediatori chiave della via. La V-ATPasi mantiene l’equilibrio del pH cellulare e gioca un ruolo importante nell’endocitosi, nell’attivazione delle proteasi e nella degradazione delle proteine. In particolare, a2V (subunità V-ATPasi – VOa2) è stata precedentemente localizzata agli endosomi precoci – il sito per l’endocitosi del recettore. In seguito al legame del ligando, il recettore Notch prende la via endocitica e viene scisso dalle proteasi per l’attivazione. Più tardi, i recettori sono degradati nel lisosoma. In Drososphila, le mutazioni in Vps25, un componente del macchinario ESCRT che regola lo smistamento endosomiale dei recettori di segnalazione, causa l’accumulo del recettore Notch negli endosomi e migliora la segnalazione Notch. In uno studio che analizza le mutazioni di drosophila di Hrs, un altro componente di ESCRT, Notch si accumula negli endosomi ma non causa l’attivazione ectopica della segnalazione di Notch. La perdita di autofagia porta all’attivazione della segnalazione di Notch nelle cellule del follicolo ovarico di Drosophila a causa dell’interruzione della degradazione di Notch. Contrariamente a questi rapporti, uno studio indipendente ha scoperto che le mutazioni in Rabconnection-3 interrompono l’attività di pompaggio protonico della V-ATPasi e accumulano Notch negli endosomi tardivi dopo la scissione S2, riducendo così la segnalazione Notch in Drosophila e cellule di mammifero. Questi risultati sono stati seguiti da rapporti in Drosophila indicando ulteriormente che attraverso l’acidificazione del percorso endolisosomiale, V-ATPase è richiesto per l’attivazione di Notch in endosomi così come per la degradazione di Notch in lisosomi. Durante lo sviluppo dei mammiferi, l’espressione di una subunità dominante negativa di V-ATPase nei precursori neurali ha ridotto la segnalazione di Notch e impoverito le cellule staminali neurali portando alla differenziazione neuronale. Recentemente, studi in astrociti nella retina di ratti mutati Nuc1 hanno dimostrato di disregolare la segnalazione Notch. La riduzione della segnalazione di Notch era dovuta alla βA3/A1-cristallina mutata, che regola l’attività della V-ATPasi con conseguente alterazione dell’acidificazione endosomiale e dell’attività della γ-secretasi, influenzando così il tasso di elaborazione del recettore Notch. Questa è una scoperta interessante considerando che il ruolo della V-ATPasi nella visione sta emergendo. Insieme questi risultati indicano che la regolazione della segnalazione Notch da V-ATPase può avere esiti sia positivi che negativi a seconda della localizzazione cellulare dell’attività V-ATPase interessata (endosomi vs lisosomi) e la dipendenza di elaborazione del recettore Notch sul percorso endosomiale. Sebbene la diafonia tra V-ATPasi e Notch sia stata studiata nel contesto dell’acidificazione endolisosomiale dipendente dalla V-ATPasi che influenza la segnalazione di Notch, un recente rapporto suggerisce che la regolazione potrebbe anche essere viceversa. In particolare, gli autori suggeriscono che Presinilin1 (PS1), un componente del complesso enzimatico γ-secretasi responsabile della scissione del recettore Notch e del peptide β-amiloide interagisce fisicamente con l’isoforma VOa1 della V-ATPasi e la indirizza dal reticolo endoplasmatico ai lisosomi. I nostri studi hanno identificato che la V-ATPasi regola la segnalazione di Notch nel cancro al seno e nello sviluppo delle ghiandole mammarie. a2V è espressa sulla superficie delle cellule epiteliali mammarie proliferanti e delle cellule del cancro al seno triplo negativo (TNBC), indicando il suo ruolo nella proliferazione cellulare durante lo sviluppo normale e la malattia. In TNBC, l’inibizione di a2V aumenta la segnalazione di Notch bloccando la degradazione lisosomiale e autofagica del recettore di Notch. La perdita di a2V nella ghiandola mammaria del topo porta ad un’anomala attivazione di Notch e compromette la morfogenesi duttale, causando difetti di lattazione. La segnalazione Notch viene attivata durante il travaglio pretermine indotto da infezione con PGN + poli (I:C), con conseguente upregulation delle risposte pro-infiammatorie, e la sua inibizione migliora la sopravvivenza in-utero dei feti vivi. Inoltre nel travaglio pretermine indotto dalla risposta infiammatoria all’iniezione di LPS, è stata osservata una up-regolazione dell’infiammazione legata a Notch e una down-regolazione dei fattori di angiogenesi. In entrambi i modelli di infezione e di travaglio pretermine infiammatorio, siamo stati in grado di salvare il fenotipo trattando con inibitori della γ-secretasi (GSI). Questo apre la strada per un’importante direzione futura, soprattutto perché GSI è un efficiente inibitore della segnalazione di Notch ed è attualmente in studi clinici per diversi tumori. Con questo, il crosstalk V-ATPase e Notch emerge per essere importante durante lo sviluppo normale e le malattie come Alzheimers e vari tipi di cancro.

Segnalazione Wnt

La via di segnalazione Wnt gioca un ruolo importante nel mantenimento, polarità e differenziazione delle cellule e dei tessuti. Negli esseri umani, la disregolazione della segnalazione Wnt è stata implicata nel cancro. Un esempio classico di segnalazione Wnt disregolata è il cancro colorettale in cui la perdita di Adenomatous Polyposis Coli (APC), un regolatore negativo della segnalazione Wnt innesca la tumorigenesi. Durante la segnalazione, i ligandi Wnt agiscono sulle cellule bersaglio legandosi a Frizzed, Fz e LRP (lipoproteina a bassa densità), un complesso di recettori della superficie cellulare che porta al disassemblaggio di Glycogen Synthase Kinas (GSK-3) e al successivo rilascio di β-catenina. La β-catenina è il principale mediatore a valle della via Wnt, che ha attivato i geni oncogeni bersaglio di Wnt come c myc e cyclinD1. Il (P) RR, Pro Renin Receptor chiamato anche ATP6ap2 agisce come una molecola adattatore tra V-ATPase e il complesso di recettori Wnt LRP 5/6. In Xenopus e Drosophila, è stato dimostrato che la V-ATPasi interagisce con il complesso recettoriale LRP 5/6 e sia il knockdown genetico che l’inibizione farmacologica della V-ATPasi interferiscono con la trasduzione del segnale e riducono significativamente la risposta cellulare alla segnalazione Wnt. Inoltre, è stato dimostrato che la V-ATPasi regola indirettamente il mediatore di segnalazione Wnt β-catenina e il mediatore Notch NICD attraverso l’autofagia.

Segnalazione TGF-β

Mutazioni nel gene a2V causano la sindrome autosomica recessiva Cutis Laxa (ACL) in cui i pazienti presentano una ridotta quantità di proteine della matrice extracellulare come il collagene con conseguente fenotipo della pelle rugosa. A sostegno di questi risultati, un’indagine meccanicistica delle mutazioni responsabili della cutis laxa nell’uomo ha identificato la mutazione a2P405L come instabile e difettosa nel traffico del golgi rispetto al tipo selvaggio. Inoltre, i rapporti indicano un difetto di glicosilazione in ACL con conseguente elevato promuove fattore di crescita trasformante-beta (TGF-β) segnalazione in questi pazienti con mutazioni a2V. V-ATPase promuove la transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF-β delle cellule epiteliali tubulari prossimali di ratto. Oltre al suo effetto sulla segnalazione Notch, l’inibizione di a2V ha attivato la via Wnt nel TNBC e la via TGF-β nelle cellule epiteliali mammarie. Questo suggerisce che il ruolo di a2V nel modulare i mediatori di segnalazione non è esclusivo di Notch. Inoltre, questi topi hanno anche mostrato una riduzione del collagene totale a causa della compromissione della glicosilazione.

Segnalamento mTOR

Nella segnalazione mTOR, la serina treonina chinasi mTOR e altri componenti del complesso mTOR 1 (mTORC1) percepiscono lo stress cellulare della disponibilità di aminoacidi e modulano la crescita.Su stimolazione dell’aminoacido, V-ATPase attiva l’attività Guanine Exchange Factor (GEF) di Ragulator verso RagA che a sua volta promuove l’idrolisi di RagC GTP. Il RagA legato al GTP e il RagC caricato di GDP reclutano insieme mTORC1 alla superficie lisosomiale. Il mTORC1 attivato risponde alla segnalazione del fattore di crescita e controlla il passaggio normativo dalla morte cellulare alla proliferazione. Un recente rapporto ha suggerito il coinvolgimento del regolatore della pompa protonica degli osteoclasti Atp6v1c1 nel migliorare la crescita del cancro al seno attivando la via mTORC1 e la metastasi ossea aumentando l’attività della V-ATPasi.