Alai

Abstract

L’artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune. Il veleno di vespa (WV), che è considerato una medicina popolare tradizionale nella nazionalità Jingpo in Yunnan, Cina, allevia l’artrite reumatoide. Lo studio attuale ha voluto indagare l’effetto del veleno di vespa per migliorare i sintomi dell’artrite reumatoide nei ratti da esperimento. Abbiamo stabilito un modello di artrite indotta da collagene di tipo II (CII) in ratti SD ed esaminato l’inibizione dell’infiammazione e della risposta autoimmune. Gli effetti antiartritici del WV sono stati valutati attraverso il gonfiore della zampa, e sono stati valutati il punteggio istopatologico e i cambiamenti istopatologici della zampa interessata. Gli effetti antinfiammatori sono stati valutati attraverso il livello di IL-6, TNF-α, IL-1β, e il numero di cellule infiammatorie nel sangue periferico. L’alterazione del rapporto del sottogruppo di cellule T nella milza dei ratti è stata rilevata mediante citometria a flusso, e allo stesso tempo, sono stati valutati l’indice delle viscere e i livelli di immunoglobulina nel siero. I risultati hanno suggerito che varie dosi di WV (0,125, 0,25, e 0,5 mg/kg) hanno significativamente alleviato il gonfiore della zampa e il punteggio dell’artrite nei ratti CIA con il controllo non trattato. WV (0,25 e 0,5 mg/kg) ha alleviato le lesioni del tessuto sinoviale delle articolazioni della caviglia e i punteggi istopatologici dell’iperplasia sinoviale e dell’infiltrazione di cellule infiammatorie con il gruppo del veicolo (). Per quanto riguarda la regolazione immunologica, 0,5 mg / kg WV abbassato i livelli di globulina sierica immunitaria (), e abbiamo inoltre scoperto che WV (0,5 mg / kg) soppresso la risposta immunitaria delle cellule Th, mentre migliorando le funzioni delle cellule Tc e cellule Treg nelle cellule della milza marcatamente (). L’azione immunosoppressiva del WV è stata analoga al suo effetto inibitorio sui livelli di IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 e PGE2 nel siero di ratto. In conclusione, questi risultati hanno dimostrato che la WV ha esibito un’attività antiartritica, che potrebbe essere associata ai suoi effetti inibitori sull’immunoregolazione e all’azione antinfiammatoria.

1. Introduzione

L’artrite reumatoide (RA) è una malattia cronica autoimmune che può progredire verso complicazioni sistemiche, disabilità fisiche e persino morte precoce. L’iperplasia delle cellule sinoviali, l’infiammazione cronica della sinovia e la distruzione della cartilagine e delle ossa sono le caratteristiche principali dell’AR. Inoltre, gli effetti sinergici delle cellule T, delle cellule B e delle citochine proinfiammatorie giocano un ruolo chiave nel processo fisiopatologico. Quando le cellule T CD4+ sono attivate, producono citochine proinfiammatorie che aumentano la risposta immunitaria stimolando altre cellule mononucleate, fibroblasti sinoviali, condrociti e osteoclasti. Il rilascio di queste citochine proinfiammatorie, in particolare TNF-α, IL-6 e IL-1β, può contribuire alla sinovite.

Attualmente, i farmaci utilizzati per il trattamento clinico dell’AR si concentrano principalmente sulla riduzione dei mediatori infiammatori, come i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), i farmaci antireumatici modificanti la malattia (DMARDs) e gli agenti biologici. Per esempio, il metotrexato analogo al folato (MTX), come un FANS, è stato approvato dalla FDA per l’AR nel 1988. Inoltre, è diventato il più usato nel trattamento dell’AR grazie alla sua attività immunosoppressiva, all’effetto antinfiammatorio e al basso costo. Tuttavia, MTX non è un agente terapeutico ideale per i suoi effetti collaterali indesiderati sul sistema neuronale, gastrointestinale e immunitario, così come altri farmaci. Ecco perché un numero crescente di persone sta cercando nuove alternative per affrontare l’inefficienza e la sicurezza di questi farmaci. Nella teoria della medicina tradizionale cinese (MTC), l’AR è considerata una sindrome artralgica (“Bi Zheng” in MTC), possibilmente causata da vento esogeno, umidità e agenti patogeni di calore o freddo. L’applicazione della MTC nella prevenzione e nel trattamento delle malattie ha una storia di diversi secoli, aumentando l’importanza nel trattamento di RA attribuito alla sua notevole efficacia, ma meno effetti collaterali e costi.

La terapia del veleno, come un approccio di medicina complementare e alternativa, è stato utilizzato per diversi secoli per il trattamento del dolore, infiammazione e artrite nella medicina popolare. Già nel periodo degli Stati Combattenti, il Canone Interno dell’Imperatore Giallo (“Huangdi Neijing” in cinese) ha un record di “la puntura d’ape è terapeutica nonostante il rischio tossico sostenuto”. Secondo la ricerca medica moderna, il veleno d’api (BV) esibisce effetti antiartritici, antinfiammatori e analgesici attribuibili all’attivazione dell’inibitore centrale e alla modulazione del sistema immunitario attraverso molteplici meccanismi. Diversi studi clinici hanno anche dimostrato che BV potrebbe migliorare i sintomi legati all’artrite.

Il veleno di vespa contiene una varietà di costituenti biologicamente attivi, tra cui ammine biogeniche, sostanze ad alta massa molecolare (come enzimi, allergeni e peptidi bioattivi) e tossine poliammidiche. Il veleno di vespa ha mostrato vari effetti farmacologici nel trattamento del dolore, delle malattie infiammatorie e delle malattie neurodegenerative. Vespa magnifica (Smith) è una specie di vespa sociale, trovata in Yunnan, Cina. Negli ultimi anni, molti composti con attività anticoagulanti, antipiastriniche, antinfiammatorie e immunosoppressive sono stati separati dal loro veleno. Sulla base del suo notevole effetto sull’artrite reumatoide, è diventato un’abitudine essere ampiamente utilizzato in Jingpo, una minoranza nazionale cinese. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, ci sono stati solo pochi rapporti sulle azioni antireumatiche del veleno di vespa.

Nel lavoro attuale, il modello di artrite indotta da collagene (CIA) è stato adottato per replicare da vicino la patogenesi di RA. I cambiamenti nel volume della zampa è stato classicamente utilizzato per valutare gli effetti anti-infiammatori su RA come al solito . Inoltre, abbiamo valutato l’effetto di WV (veleno di Vespa magnifica) nello stesso modello. Infine, l’efficacia di WV sull’antinfiammatorio e l’immunomodulazione sono stati osservati dalla colorazione H&E del tessuto articolare, dalla citometria a flusso dei sottoinsiemi di cellule T nella milza, così come dall’ELISA di IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2, e fattori reumatoidi (IgG, IgA, e IgM).

2. Materiali e metodi

2.1. Animali sperimentali

Ratti maschi SD (60 ratti, 180-220 g) sono stati ottenuti da Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie standard di polipropilene rivestite di pula grezza (rinnovata dopo 48 ore). La casa degli animali è stata mantenuta con un ciclo luce/buio di 12 ore a circa 22 ± 2°C e un’umidità relativa del 60-70%, e gli animali avevano libero accesso all’acqua e al cibo standard. I ratti sono stati assegnati in modo casuale a 8 controlli e 52 modelli, e poi un periodo minimo di 7 d è stato permesso per l’adattamento su ogni esperimento. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health) e approvate dal Comitato Etico dell’Università di Dali.

2.2. Modello animale di CIA e protocollo di trattamento

I ratti sono stati disinfettati con alcool e iniettati per via sottocutanea sulla vola pedis destra, sulla schiena e sulla coda con 1 mg/ml di emulsionante CCII (collagene di pollo tipo II) per la prima immunizzazione, che è composto da CCII (C9301, Sigma) emulsionato 1 : 1 con adiuvante di Freund incompleto (F5506, Sigma). Il giorno di induzione è stato concepito come giorno 0. La dose di richiamo è stata iniettata di nuovo all’addome, alla schiena e alla coda insieme a 1 ml di emulsionante CCII il giorno 8. Il piede iniettato è stato definito come il piede infiammatorio, mentre l’altro piede senza iniezione è stato notato come il piede secondario. Poi, i ratti con artrite indotta da collagene (CIA) sono stati trattati il giorno 14 e sono terminati il giorno 28. Dopo l’insorgenza della CIA, i ratti modello sono stati divisi a caso in cinque gruppi in base ai punteggi clinici. Gruppo I: gruppo modello che ha ricevuto un’iniezione ipodermica (1 ml/kg) di soluzione fisiologica normale come veicolo. Gruppi II-IV: ratti CIA hanno ricevuto un’iniezione ipodermica di 0,125, 0,25, e 0,5 mg/kg di WV (veleno di vespa, da Vespa magnifica (Smith) in Yunnan, Cina, polvere liofilizzata ricavata dall’essudato delle ghiandole della coda delle vespe, diluito con soluzione salina normale), rispettivamente, come gruppi di trattamento. Gruppo V: il gruppo di controllo positivo ha ricevuto TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, No. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) di 9 mg/kg nello stesso modo. Contemporaneamente, lo stesso volume di sola soluzione salina normale è stato dato ai ratti normali del gruppo di controllo. I ratti sopra tutti hanno avuto una somministrazione quotidiana per 14 giorni.

2.3. Valutazione di base dell’artrite sperimentale

La gravità della CIA è stata valutata periodicamente in base al gonfiore della zampa e al punteggio dell’artrite. I ratti sono stati pesati nei giorni 0-28 dello studio, e lo spessore e il perimetro delle caviglie del piede infiammato (il piede destro) e del piede secondario (il piede sinistro) sono stati misurati separatamente con un calibro vernier e un nastro al giorno 0, 14, e 28. Il punteggio dell’artrite è stato valutato sulla base di osservazioni indipendenti di tre studiosi. Ogni zampa è stata valutata su una scala da 0 a 4, il che significa che il massimo punteggio totale per entrambe le articolazioni delle zampe posteriori era 8. I criteri di valutazione erano i seguenti: 0 = nessun edema o alcun cambiamento visivo; 1 = edema leggero ed eritema limitato; 2 = edema ed eritema leggero; 3 = edema evidente ed eritema significativo; e 4 = edema grave ed eritema esteso . Il giorno 28, gli animali sono stati sacrificati, e poi il siero e le articolazioni della caviglia secondaria sono stati raccolti e trattati per ulteriori analisi.

2.4. Istopatologia delle articolazioni della caviglia

Gli arti posteriori sinistri senza abbattere i tessuti vicini sono stati immediatamente lavati con PBS per 2-3 volte, fissati con formalina al 10% per 48 h, e decalcificati con acido nitrico al 5% per 24 h fino a quando la corteccia ossea era facilmente percorribile con la punta di un ago. I campioni sono stati inseriti in sezioni di paraffina e tagliati in fette (5 μm) per la colorazione ematossilina-eosina (H&E) di routine. I cambiamenti patologici delle articolazioni sono stati rilevati con un microscopio ottico (Olympus, Giappone) e fotografati. Le immagini sono state scattate a ingrandimenti di 200x. Sono stati rilevati anche i cambiamenti nell’iperplasia sinoviale e l’infiltrazione di cellule infiammatorie. I cambiamenti istopatologici sono stati segnati, rispettivamente, utilizzando i seguenti criteri: 0 = nessun cambiamento rilevabile; 1 = lieve; 2 = moderato; 3 = grave .

2.5. Analisi dell’indice viscerale

I ratti sono stati sacrificati e il fegato completo, la milza e il timo sono stati resecati con il tessuto adiposo circostante e la fascia accuratamente separati. La massa umida di fegato, milza e timo è stata misurata con una bilancia elettronica e l’indice delle viscere (compreso l’indice del fegato, della milza e del timo) è stato calcolato secondo la seguente formula. Indice delle viscere = massa dell’organo (mg)/massa del corpo (g) × 100%.

2.6. ELISA degli indici biochimici del siero

Il siero dei ratti sperimentali è stato raccolto, e le concentrazioni di TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2, e PGE2 sono state rilevate da kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Nanjing JianCheng, China) seguendo le istruzioni del produttore. I kit ELISA per rilevare i livelli di espressione di IgA (ERC015), IgG (ERC016) e IgM (ERC017) sono stati acquistati da NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, Cina.

2.7. Citometria a flusso della milza artritica

Il numero di sottoinsiemi di cellule T è stato rilevato usando la citometria a flusso. I linfociti sono stati raccolti da cellule della milza di ratto, che sono state omogeneizzate passando attraverso un setaccio di nylon a 200 mesh. Le cellule sono state filtrate in un tampone PBS contenente il 10% di siero fetale bovino. La concentrazione delle cellule è stata regolata a circa 2 × 106/ml, e 3 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (Solarbio, Cina) è stato aggiunto per sciogliere i globuli rossi per meno di 5 min. Poi, le cellule sono state centrifugate a 1200 rpm per 5 min, lavate due volte con tampone FBS-PBS che contiene 10% di siero fetale bovino, e poi centrifugato a 1200 rpm per 5 min. Ogni 100 μL di sospensione cellulare è stata posta in provette da centrifuga. I linfociti sono stati seguiti dalla colorazione con anti-CD3-FITC (No. 557354; BD, USA), anti-CD4-APC (No. 565432; BD, USA), anti-CD8-PerCP (No. 558824; BD, USA), e anti-CD25-PE (No. 554866; BD, USA). Gli anticorpi monoclonali sono stati aggiunti a ciascuna provetta, rimescolati e lasciati in ghiaccio per 30 minuti. Il buffer FBS-PBS (1 ml) è stato aggiunto a ciascuna provetta e centrifugato a 1200 rpm per 5 min, e il surnatante è stato abbandonato. Il passo precedente è stato ripetuto due volte in modo che le cellule senza legame agli anticorpi monoclonali fossero eluite completamente. Le cellule sperimentali sono state mescolate con 500 μL di buffer FBS-PBS. I rapporti di cellule T CD25+/CD4+ e CD4+/CD8+ sono stati determinati utilizzando un citometro a flusso FACS Canto (BD, USA). Analisi statistica

I dati sono stati analizzati statisticamente usando SPSS10.0. I dati sono stati presentati come media ± deviazione standard della media (S.D.M). La significatività delle differenze tra ogni gruppo è stata analizzata mediante ANOVA a una via seguita da un test di Tukey. In particolare, il punteggio dell’artrite e il punteggio istopatologico sono stati analizzati con il test di somma di rango Wilcoxon. I valori di sono stati considerati statisticamente significativi.

3. Risultati

3.1. WV ha alleviato il sintomo dell’artrite nei ratti CIA

I sintomi artritici sono stati indotti con successo nei ratti iniettando collagene di tipo II come da istruzioni, che si è incarnato in significativi segni macroscopici di grave rossore e gonfiore nella zampa secondaria e nell’articolazione della caviglia dei ratti CIA in Figura1(a), se confrontato con il gruppo di controllo sano. Lo spessore e il perimetro dell’articolazione della caviglia erano apparentemente aumentati nei veicoli il giorno 14 (Figura 1(b)) rispetto a quelli nei controlli; tuttavia, erano notevolmente diminuiti dopo TwHF e tutti i gruppi trattati WV il giorno 28 rispetto a quelli del gruppo modello (tutti ) (Figura 1(b)). Quando abbiamo misurato lo spessore e il perimetro delle articolazioni della caviglia sia nel piede infiammatorio che nel piede secondario, l’evidente cedimento del gonfiore è stato mostrato in base ai dati (Figura 1(b)). I risultati del grado di gonfiore hanno indicato che WV potrebbe controllare l’edema della zampa e alleviare l’infiammazione secondaria sulla zampa e sull’articolazione della caviglia corrispondente all’effetto TwHF.

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Figura 1

Effetto del WV sui sintomi artritici di ogni gruppo. (a) Grado di gonfiore delle zampe in tutti i gruppi. (b) Lo spessore e il perimetro delle articolazioni della caviglia sia nel piede infiammato che nel piede secondario in tutti i gruppi. (c) Confronto del punteggio di artrite tra tutti i gruppi.

Inoltre, il punteggio di artrite è stato diminuito con vari gradi attraverso il trattamento di WV a seconda della quantità di dose come mostrato nella Figura 1(c). Il punteggio di artrite del gruppo veicolo era 6,5 ± 1,0 il giorno 14 (rispetto al giorno 0, ). L’indice è stato significativamente diminuito nel gruppo trattato con TwHF il giorno 28, mostrando 2,8 ± 0,8 (vs giorno 14, ). Allo stesso modo, la diminuzione degli indici da WV era significativa e dose-dipendente (3.2 ± 0.6 a 0.5 mg/kg, 4.3 ± 0.7 a 0.25 mg/kg, e 5.6 ± 0.7 a 0.125 mg/kg) (in modo grave vs 14 giorni, ). Questo ha indicato che la potenza di WV a 0,5 mg/kg era commisurata a quella del gruppo trattato con TwHF.

3.2. WV ha alleviato i cambiamenti patologici delle articolazioni nei ratti CIA

H&E colorazione (Figura 2(a)) ha mostrato che la membrana sinoviale delle articolazioni della caviglia dei ratti di controllo aveva una disposizione cellulare regolare, senza alcuna iperplasia sinovietica, infiltrazione di cellule infiammatorie, e una superficie cartilaginea liscia. In confronto, l’architettura istologica delle articolazioni nei ratti del gruppo veicolo era marcatamente anormale con infiltrazione di cellule immunitarie, iperplasia sinovietica, aumento del numero di vasi ed erosione della cartilagine e dell’osso. Le articolazioni dei gruppi TwHF e WV erano significativamente attenuate da quelle del gruppo veicolo e si sono spostate verso quelle del gruppo di controllo. I punteggi istopatologici (Figura 2(b)) indicavano (gruppo veicolo) la cellula di rivestimento sinoviale anormale e l’infiltrazione di cellule infiammatorie nelle articolazioni artritiche; i trattamenti TwHF e WV hanno abbassato significativamente il punteggio istopatologico medio e ripristinato la cartilagine rispetto al gruppo veicolo ().

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Figura 2

Effetti del WV sulla progressione dell’artrite e sull’istologia articolare nei ratti CIA. (a) Istopatologia di sezioni di tessuto articolare di ratti CIA trattati con diverse dosi di WV e TwHF e ratti normali mediante colorazione H&E. Ingrandimento originale ×200. a, distruzione ossea; b, infiltrazione di cellule immunitarie; c, sinovia ipertrofica. (b) Punteggi istopatologici di iperplasia sinoviale e infiltrazione di cellule infiammatorie in tutti i gruppi. , rispetto al gruppo di controllo; , rispetto al gruppo veicolo.

3.3. Effetti di WV sull’indice viscerale e sui livelli di globulina sierica immunitaria nei ratti CIA

Rispetto al gruppo di controllo, l’indice epatico del gruppo veicolo è diminuito significativamente () e WV (0,25 e 0,5 mg/kg) è aumentato notevolmente (). Rispetto al gruppo di controllo, l’indice della milza e l’indice del timo del gruppo veicolo sono aumentati notevolmente (); TwHF e WV hanno avuto un effetto inibitorio su di loro che si riflette particolarmente nell’effetto della dose di 0,5 mg/kg di WV sull’indice del timo (Figura 3(a)).

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Figura 3

Effetti del WV sull’indice dei visceri e sui livelli di immunoglobulina nel siero dei ratti CIA. (a) Cambiamenti nell’indice della milza, del timo e del fegato in tutti i gruppi. (b) I livelli di espressione IgG, IgA e IgM nel siero di tutti i gruppi.

I livelli di espressione IgG, IgA e IgM sono stati migliorati notevolmente nei ratti CIA () rispetto al controllo, mentre sono diventati più bassi dopo l’elaborazione TwHF (). E i livelli di IgG nel siero erano diminuiti nel gruppo WV (0,5 mg/kg) rispetto al gruppo veicolo (). Questa inibizione è stata applicata anche a IgA e IgM nei gruppi WV (0,25 e 0,5 mg/kg) (Figura 3(b)).

3.4. Effetti di WV sui sottogruppi di cellule T nella milza di ratti CIA

Il numero di cellule T CD4+ è aumentato significativamente nei gruppi di veicoli rispetto al gruppo di controllo (), mentre quelli nei gruppi TwHF e WV (0,5 mg/kg) erano significativamente inferiori al gruppo di veicoli (Figura 4(a)). Rispetto al gruppo di controllo, il numero di cellule T CD4+CD25+ nel gruppo veicolo era significativamente diminuito (), mentre erano significativamente aumentati nei gruppi TwHF e WV (0,5 mg/kg) () ma non ovvio negli altri gruppi (Figura 4(a)). Rispetto al gruppo di controllo, la riduzione nel gruppo veicolo del numero di cellule T CD8+ era notevole, ma solo WV (0.125 e 0.25 mg/kg) ha fatto aumentare i numeri (, ) nella Figura 4(b).

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Figura 4

Il numero di sottoinsiemi di cellule T nelle cellule della milza mediante citometria a flusso. (a) I risultati della FCM sul numero di cellule Th e Tc (a sinistra); i risultati della FCM sul numero di cellule Treg (a destra). (b) Il grafico a barre indica l’effetto negativo di WV e TwHF sulle cellule Th e l’effetto positivo sulle cellule Tc e Treg. (b) Il grafico a barre ha indicato l’effetto negativo del WV e del TwHF sulle cellule Th e l’effetto positivo sulle cellule Tc e sulle cellule Treg, rispetto al gruppo di controllo; rispetto al gruppo veicolo. WV Regulated Serum Cytokines and Mediators in CIA Rats

Il kit ELISA (Figura 5) ha mostrato che, rispetto al gruppo di controllo, i livelli sierici di IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2, e IL-8 sono stati significativamente aumentati nel gruppo veicolo e sono stati notevolmente ripristinati da TwHF (9 mg/kg) e WV (0.5 mg/kg) (). Nel frattempo, le espressioni di IL-6 e PGE2 sono state soppresse dal dosaggio di 0,125 e 0,25 mg/kg di WV (). WV (0.125 e 0.25 mg/kg) ha analogamente ridotto l’espressione di COX-2 e IL-8 rispetto al veicolo (, ). Questo ha indicato che l’infiammazione indotta da CCII ha probabilmente mediato i cambiamenti patologici visti nei ratti artritici, e WV potrebbe alleviare la risposta infiammatoria.

Figura 5

Effetti del WV sui livelli di IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 e COX-2 nel siero dei ratti CIA. Il WV è stato usato per il trattamento dell’artrite reumatoide, rispetto al gruppo di controllo, rispetto al gruppo veicolo.

4. Discussione

L’AR è una malattia cronica autoimmune caratterizzata da dolore, gonfiore e graduale distruzione delle articolazioni, con conseguente perdita di funzionalità. cAlthough methotrexate (MTX) tablets are offen considered as a treatment medicine for rheumatoid arthritis, they are usually associated with adverse drug reactions (ADRs) . Quindi, abbiamo cercato di valutare se il veleno di vespa (WV) potrebbe rappresentare un potenziale farmaco alternativo per RA.

Lo studio attuale è stato il primo, a nostra conoscenza, a indagare il ruolo terapeutico di WV (da Vespa magnifica) nell’artrite indotta da collagene (CIA) nei ratti SD e confrontato con l’effetto clinicamente provato di TwHF. Il Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), noto anche come Lei Gong Teng in TCM, è stato usato per trattare l’AR per molti anni in Cina, e gli estratti di TwHF hanno mostrato attività antinfiammatorie e immunosoppressive sia in vivo che in vitro. Abbiamo stabilito il modello di ratti CIA per 14 giorni e rimosso 12 incompetenze apparenti che potevano essere dovute al fallimento dell’iniezione da 52 ratti, cioè i ratti CIA avevano un tasso di artrite del 77%. Il gruppo di controllo non ha mostrato segni di edema o infiammazione (figure 1 e 5), e i nostri risultati sono in accordo con gli studi precedenti di RA e CIA, che hanno riferito che CCII emulsionante indotto la gravità dell’edema e danni infiammatori nelle articolazioni . Poi, i sintomi migliorati nel gruppo WV (0,5 mg / kg) erano simili a quelli del farmaco positivo TwHF, che è stato segnalato per inibire la risposta infiammatoria di RA , ma l’effetto della bassa dose non era significativo sulla riduzione del gonfiore e l’inibizione di IL-1β e TNF-α (figure 1 e 5). Inoltre, abbiamo notato che i ratti nel gruppo veicolo avevano una pelliccia più ruvida e uno stato mentale più povero rispetto a quelli del gruppo di controllo; queste condizioni erano diventate tanto migliori nel gruppo di trattamento.

Per valutare ulteriormente l’efficacia terapeutica di WV, la colorazione H&E è stata eseguita in campioni di tessuto delle articolazioni della caviglia posteriore sinistra per analizzare la caratteristica patologica, e abbiamo trovato che le cellule sinoviali causano infiammazione, proliferazione e invasione della cartilagine localizzata e osso nel gruppo veicolo (Figura 2), e questi cambiamenti macroscopici sono coerenti con i rapporti precedenti. Inoltre, TwHF e WV che trattano per 14 giorni hanno ridotto significativamente l’iperplasia delle cellule sinoviali e l’infiltrazione di cellule infiammatorie rispetto al non trattato (Figura 2). La sinovite cronica è la base patologica dell’AR. L’infiammazione sinoviale è guidata da una complessa interazione tra sinoviociti e cellule infiltranti del sistema immunitario innato e adattativo. Pertanto, l’indice viscerale degli organi immunitari come la milza e il timo è stato calcolato in questo esperimento. Vale la pena ricordare che non abbiamo trovato la differenza significativa nel peso tra il veicolo e il gruppo di trattamento; così abbiamo usato l’indice viscerale rappresentativo per riflettere la salute generale dei ratti. Abbiamo scoperto che TwHF e WV potrebbero diminuire l’aumento dell’indice viscerale della milza e del timo nei ratti CIA (Figura 3(a)); questo potrebbe riflettere il loro ruolo nell’alleviare il potenziamento immunitario causato dall’RA. Abbiamo anche notato il cambiamento dell’indice epatico durante questo processo; i nostri risultati hanno mostrato che il TwHF non ha fatto rivivere l’indice epatico anche se il suo trattamento è stato efficace, il che ci ha ricordato la sua tossicità per il fegato nella relazione precedente. Fortunatamente, questo non è stato riscontrato nel gruppo WV (Figura 3(a)). Con l’eccezione della diminuzione dell’indice epatico nel veicolo e nel gruppo TwHF, non sono stati osservati effetti collaterali in questi ratti, il che potrebbe essere dovuto al basso dosaggio che abbiamo usato. Inoltre, abbiamo anche rilevato i fattori reumatoidi (RFs), come marker diagnostico per l’AR, includendo principalmente gli isotipi IgG, IgA e IgM; ha un alto tasso di rilevamento nei pazienti con AR. Questo studio ha trovato che i ratti CIA non trattati avevano livelli significativamente più alti di anticorpi IgG, IgA e IgM nel siero rispetto a quelli dei gruppi TwHF e WV (Figura 3(b)); questi risultati concordavano bene con i dati clinici riportati. Così, si è potuto vedere che TwHF e WV (0,5 mg/kg) potrebbero ridurre la risposta autoimmune eccessiva dei ratti CIA ad un livello vicino al normale. Al contrario, l’effetto di WV (0,125 e 0,25 mg/kg) non era ovvio, mentre resta da vedere se una dose più alta migliorerà l’effetto piuttosto che agire come un veleno, quindi ci siamo ancora concentrati su queste tre dosi per esplorare l’effetto di WV su RA in questo esperimento.

La ricerca precedente ha dimostrato che l’infiammazione sinoviale recluta e attiva le cellule immunitarie producendo mediatori, e le cellule T svolgono ruoli fondamentali nella regolazione di RA. Per quanto riguarda il ruolo delle citochine proinfiammatorie nell’autoimmunità, è essenziale considerare l’equilibrio tra i diversi sottoinsiemi di cellule T, principalmente divisi in due ipotesi secondo la loro funzione e fenotipi: Cellule T helper CD4+ (Th) e cellule T citotossiche CD8+ (Tc). Le cellule Th e le cellule Tc, caratterizzate dalla produzione di varie citochine specifiche, facilitano la risposta immunitaria adattativa. Al contrario, le cellule T (Treg) CD4+CD25+ hanno una funzione fondamentale nel mantenimento della tolleranza immunitaria controllando le risposte infiammatorie e sopprimendo l’attività delle suddette cellule immunitarie. In questo studio, abbiamo trovato una grande concentrazione di cellule Th e Tc nelle cellule spleniche e abbiamo anche notato una funzione compromessa delle cellule Treg nei ratti CIA. Fortunatamente, l’equilibrio tra i sottoinsiemi di cellule T è stato protetto dal trattamento con TwHF e WV (Figura 4). Da notare che l’accumulo di cellule immunitarie è il promotore dell’infiammazione articolare locale, e le cellule immunitarie attivate rilasciano una grande quantità di citochine proinfiammatorie, che poi inducono l’attivazione e la proliferazione delle cellule sinoviali e aggravano ulteriormente la progressione dell’infiammazione articolare. Studi precedenti hanno dimostrato che IL-6 è la citochina più dominante nella patogenesi dell’AR, e quantità eccessive di IL-1β, così come TNF-α e IL-8, sono state trovate nel liquido sinoviale dei pazienti AR. Anche la produzione di COX-2 e PGE2 in seguito alla stimolazione con IL-1β è aumentata, e il loro blocco ha alleviato significativamente i sintomi dell’AR. Risultati simili sono stati osservati nei nostri risultati sperimentali, e abbiamo confermato che TwHF e WV (0.5 mg/kg) potrebbero ridurre efficacemente i livelli di IL-6, IL-8, PGE2 e COX-2; inoltre, le maggiori concentrazioni di IL-1β e TNF-α indotte da RA sono state soppresse tranne che per WV (0.125 e 0.25 mg/kg) (Figura 5).

Questi risultati hanno suggerito che WV ha le funzioni di alleviare il gonfiore articolare, inibire l’infiammazione sinoviale, sopprimere la risposta immunitaria eccessiva e proteggere l’omeostasi immunitaria, che possono migliorare i sintomi e diventare rimedi efficaci per RA. È stato riportato che il veleno di vespa contiene una serie di molecole bioattive, tra cui ammine, piccoli peptidi, e anche enzimi, allergeni e tossine di alta massa molecolare. Ciò che rende WV diverso da BV è che BV ha principalmente effetti antinfiammatori, antiossidativi e analgesici su RA, e contiene una varietà di diversi peptidi, tra cui melittina, fosfolipasi A2, apamina, e così via. I meccanismi di trattamento dell’AR con questi due veleni possono essere diversi e meritano ulteriori studi. Anche se non sono stati osservati effetti collaterali nella gamma da 0,125 a 0,5 mg/kg di WV, è stata necessaria un’ulteriore valutazione dei principi attivi e della sicurezza dell’estratto di WV.

5. Conclusioni

Il veleno di vespa ha alleviato l’iperplasia sinoviale e la distruzione della cartilagine causata dalla CIA, probabilmente a causa della riduzione del fattore proinfiammatorio e dell’effetto di immunoregolazione. Questo studio ha dimostrato che il veleno di vespa potrebbe essere una potenziale alternativa terapeutica per la RA. Oltre ad essere una prescrizione popolare per molti anni, il WV merita ulteriori studi per essere scoperto, esplorato e riconosciuto.

Data Availability

I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono inclusi nell’articolo e possono essere resi liberamente disponibili.

Approvazione etica

Lo studio è stato approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Dali University.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse riguardanti la pubblicazione di questo articolo.

Contributi degli autori

YG ha scritto il manoscritto e ha assistito nella costruzione e nel raggruppamento dei modelli animali. WXY e HL hanno eseguito la colorazione H&E e la citometria a flusso. XMD e LLN erano responsabili dei kit ELISA. ZBY, HRZ e HX hanno contribuito in modo determinante alla stesura del manoscritto. ZBY e CGZ hanno amministrato e supervisionato il progetto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

Riconoscimenti

Parte di questo lavoro è stata sostenuta dal Centro di Innovazione Collaborativa per l’Entomoceutica della Provincia dello Yunnan 2011. Il presente studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzione n. 81360679 e 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (sovvenzione n. 2016FD074), Natural Science Foundation of Yunnan Province (sovvenzione n. 2017FA050), e Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (sovvenzione n. ZKLX2019101).