Alai

Stabilire il range di temperatura

Le condizioni di laboratorio comunemente usate per le colture di Macrostomum lignano sono le seguenti: temperatura di 20 °C, umidità 60%, e ciclo luce/buio di 14 h/10 h. Queste condizioni sono state scelte principalmente perché sono ottimali per la crescita della diatomea Nitzschia curvilineata, che è la principale fonte di cibo per i vermi. Per valutare le condizioni di temperatura che possono essere utilizzate nell’esperimento, abbiamo prima stabilito l’intervallo di temperatura in cui i vermi sopravvivono. Mentre il congelamento dei vermi si è rivelato letale, essi potrebbero sopravvivere se tenuti a 4 °C per almeno due settimane. Tuttavia, poiché la diatomea non cresce in queste condizioni, abbiamo deciso di escludere i 4 °C da ulteriori esperimenti. Anche altre temperature sotto i 20 °C sono state escluse dall’esperimento, poiché l’obiettivo primario dello studio era quello di trovare condizioni che accelerassero la crescita e lo sviluppo. Dall’altro lato dello spettro delle temperature, i vermi si dissolvono quando vengono tenuti a 42 °C per due ore, e muoiono dopo una settimana di cultura a 37 °C. Pertanto, abbiamo deciso di utilizzare 20 °C, 25 °C, 30 °C e 35 °C come condizioni sperimentali per studiare gli effetti a lungo termine della temperatura su M. lignano (Fig. 1).

Risposta allo shock termico

Per studiare quali temperature inducono la risposta allo stress nei vermi, abbiamo controllato l’attività del promotore dello shock termico 20 (Mlig-hsp20). In primo luogo, abbiamo eseguito una RT-PCR quantitativa per misurare il livello di espressione di Mlig-hsp20 a 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C e 35 °C. Non c’era alcuna differenza significativa nel livello di espressione di Hsp20 tra 20 °C e 25 °C (Fig. 2a). Tuttavia, un piccolo (2 volte), ma significativo (P = 0,027, t-test), aumento dell’espressione è stato osservato a 30 °C rispetto a 20 °C (Fig. 2a). Più di un aumento di dieci volte nel livello di espressione è stato osservato a 33 °C, che è aumentato a più di 100 volte alla più alta temperatura testata di 35 °C (Fig. 2a). Nel secondo test abbiamo creato una linea transgenica che esprime la proteina mScarlet-I sotto il controllo del promotore Mlig-hsp20 (Fig. 2b) e misurato il livello di fluorescenza 24 ore dopo un’incubazione di 2 ore a diverse temperature che vanno da 20 °C a 37 °C (Fig. 2c, d). Più di due e dieci volte l’aumento della fluorescenza è stato osservato a 34 °C e 37 °C rispettivamente (Fig. 2c).

Velocità dello sviluppo embrionale

Secondo Morris et al. , ci vogliono circa 120 h (cinque giorni) per le uova di Macrostomum per svilupparsi completamente quando le uova sono tenute a 20 °C. Per studiare come la temperatura influisce sulla velocità dello sviluppo embrionale e della schiusa, abbiamo raccolto embrioni appena deposti e monitorato il loro sviluppo fino alla schiusa a diverse temperature. Per studiare le potenziali differenze dovute al background genetico, abbiamo usato due linee di M. lignano che sono attualmente utilizzate nella maggior parte degli studi su M. lignano, le linee DV1 e NL10. Queste linee sono derivate indipendentemente da popolazioni wild-type della stessa posizione geografica e differiscono per una duplicazione del cromosoma intero, ma altrimenti si comportano in modo molto simile in condizioni di laboratorio. Abbiamo prima studiato l’effetto della bassa temperatura. A 4 °C lo sviluppo delle uova è arrestato e possono essere conservate per almeno un mese, e riprendere il loro sviluppo una volta riportate a temperature più elevate. Successivamente, abbiamo studiato quanto velocemente le uova si sviluppano a temperature comprese tra 20 °C e 35 °C. Come mostrato in Fig. 3, quando mantenute in condizioni standard (20 °C) le uova hanno iniziato a schiudersi dopo sei giorni. L’aumento della temperatura ha portato a uno sviluppo embrionale proporzionalmente più veloce e a una schiusa più precoce, che era due volte più veloce a 35 °C rispetto a 20 °C e richiedeva solo tre giorni. Da notare che circa il 10% delle uova rimane non schiuso dopo otto giorni di incubazione a 20 °C, rispetto a meno del 5% a temperature più elevate, suggerendo che anche la più alta temperatura testata di 35 °C non ha effetti negativi sulla sopravvivenza degli embrioni.

Riproduzione

Il tasso di riproduzione è un fattore molto importante per un organismo modello, poiché gli animali con un tempo di generazione più breve permettono una generazione più veloce di dati negli esperimenti genetici. Inoltre, se gli animali producono un gran numero di figli, i dati generati avranno, nella maggior parte dei casi, una maggiore potenza statistica.

Per valutare l’impatto della temperatura sul tasso di riproduzione di M. lignano abbiamo confrontato il numero di figli generati nel corso di cinque settimane dai vermi tenuti a diverse condizioni di temperatura. L’esperimento è stato iniziato con gli schiuditoi per incorporare lo sviluppo postembrionale nello studio, e sono state utilizzate sia la linea DV1 che NL10. Gli schiuditoi di entrambe le linee hanno impiegato tre settimane per crescere e produrre la prima progenie a 20 °C, mentre a 25 °C gli schiuditoi sono stati osservati in due settimane per la linea NL10 ma non per DV1. A 30 °C e 35 °C entrambe le linee hanno prodotto progenie già dopo due settimane (Fig. 4). Da tre settimane in poi, il numero di schiuse prodotte per settimana è aumentato da meno di 200 a 20 °C a più di 300 a temperature superiori a 20 °C; il numero di schiuse era più alto per i vermi tenuti a 30 °C. Questo era vero per entrambi i background genetici, e non abbiamo osservato differenze significative tra le linee DV1 e NL10 (Fig. 4).

Anche se temperature di 30 °C e superiori hanno portato a più schiuse, attivano anche una risposta di shock termico (Fig. 2). Per studiare l’effetto a lungo termine della temperatura elevata e i potenziali stress che può avere sui vermi, abbiamo tenuto i vermi alle temperature selezionate e monitorato le aberrazioni morfologiche dopo tre e sei mesi di coltura. I vermi tenuti a 25 °C non hanno mostrato cambiamenti morfologici in entrambi i punti di controllo rispetto ai vermi tenuti a 20 °C (Fig. 5). Tuttavia, per entrambe le condizioni di temperatura di 30 °C e 35 °C, sono state osservate varie aberrazioni nella morfologia generale. Dopo tre mesi un maggior numero di cisti, tessuti danneggiati e testicoli ingranditi erano comunemente presenti in entrambe le linee DV1 e NL10 (Fig. 5). Nessuno dei vermi tenuti a 35 °C è sopravvissuto fino al checkpoint di sei mesi, e tutti i vermi sopravvissuti a 30 °C hanno mostrato aberrazioni morfologiche (Fig. 5). Pertanto, l’esposizione prolungata alle temperature superiori a 30 °C è dannosa per M. lignano.

Tempo di rigenerazione

Siccome l’attrazione principale di M. lignano come organismo modello è la sua capacità rigenerativa, abbiamo studiato come la temperatura influenza la rigenerazione. È comunemente accettato che una temperatura più alta porta ad un aumento dell’attività metabolica generale. Per valutare l’influenza della temperatura sul tempo necessario per un verme per rigenerare completamente il suo corpo dopo l’amputazione sopra la regione dei testicoli, abbiamo monitorato la rigenerazione dei testicoli e la comparsa di sperma nel seminale vescicolare utilizzando una linea transgenica NL22 precedentemente stabilita, che esprime GFP sotto il controllo del promotore ELAV specifico per testicoli e sperma. Utilizzando un tale marcatore transgenico fornisce una migliore precisione, coerenza ed efficienza nel valutare l’entità della rigenerazione. Infatti, non abbiamo osservato alcuna variazione significativa nel valutare il tempo di comparsa del segnale GFP dopo l’amputazione a tutte le temperature testate (Tabella 1).

Come previsto, la velocità di rigenerazione è aumentata con la temperatura (Tabella 1). Se prendiamo il tempo di rigenerazione a 20 °C come velocità standard, allora per la rigenerazione dei testicoli i coefficienti di temperatura calcolati sono Q10 = 4 a 25 °C e Q10 = 3 per 30 °C e 35 °C. Questo dimostra che l’effetto maggiore si ottiene quando si aumenta la temperatura a 25 °C, e la rigenerazione più veloce avviene a 30 °C, senza ulteriori benefici dell’aumento della temperatura sul tempo di rigenerazione. Quindi, le temperature di 25 °C e 30 °C dovrebbero essere considerate negli esperimenti di rigenerazione su M. lignano, poiché accorcia la durata di un esperimento da due a tre volte (Tabella 1).

Interferenza RNA

Il Knockdown dell’espressione genica tramite RNA interference (RNAi) è attualmente l’approccio primario per gli studi di perdita di funzione in M. lignano. In questo approccio gli animali sono impregnati di RNA a doppio filamento contro il gene bersaglio, e spesso sono necessari trattamenti prolungati per diverse settimane per osservare un fenotipo. Abbiamo testato come la temperatura influenza la velocità di sviluppo del fenotipo su trattamento RNAi. Per fare questo, abbiamo abbattuto Mlig-ddx39, un gene noto per la sua funzione nella proliferazione cellulare in M. lignano e un robusto fenotipo knockdown letale . Analogamente al test di riproduzione, abbiamo usato le linee DV1 e NL10 per questo esperimento (Tabella 2). A 20 °C, ci sono voluti circa 20 giorni per tutti gli animali per morire su Mlig-ddx39 knockdown. Quando i vermi sono stati tenuti a temperature più alte, la morte è avvenuta più velocemente: a 11 e 8 giorni per i vermi tenuti a 25 °C e 30 °C rispettivamente. Non c’era alcuna differenza visibile tra i due ceppi utilizzati per l’esperimento (Tabella 2). Successivamente, abbiamo indagato se l’aumento osservato nella velocità di manifestazione del fenotipo ddx39 RNAi a temperature più elevate è atrribuibile ad una maggiore efficienza di knockdown del gene da RNAi, o ad altri fattori. Per questo, abbiamo misurato tramite qRT-PCR l’abbondanza dei trascritti Mlig-ddx39 in diversi punti temporali dopo l’inizio dell’esperimento RNAi a diverse temperature (Fig. 6). Gli animali trattati con dsRNA contro gfp sono stati usati come controlli di riferimento. A tutte le temperature testate non sono state osservate variazioni significative nei livelli di espressione di Mlig-ddx39 tra i campioni di controllo nel corso dell’esperimento (Fig. 6). Allo stesso tempo, per gli animali trattati con Mlig-ddx39 dsRNA è stato osservato un calo di ~ 80% nel livello di trascrizioni ddx39 già dopo un giorno di trattamento a 20 ° C o 25 ° C, e anche un calo maggiore di ~ 90% a 30 ° C. Tuttavia, nei giorni successivi, i livelli di abbattimento si sono stabilizzati intorno al 95% a tutte le temperature. Così, concludiamo che la cinetica di RNAi stessa non è significativamente influenzata dalla temperatura. Invece, l’accorciamento del tempo osservato per la manifestazione del fenotipo Mlig-ddx39 RNAi a temperature più alte può essere spiegato dall’aumento del tasso di turnover cellulare.

Per verificare se l’accelerazione dello sviluppo di fenotipi RNAi a temperature elevate può essere generalizzato ad altri geni, abbiamo studiato Mlig-sperm1 gene, knockdown di cui porta alla morfologia dello sperma anormale e testicoli ingranditi. Questo è un fenotipo RNAi lento che richiede 2-3 settimane per sviluppare a 20 ° C. Per quantificare l’entità del fenotipo a diverse temperature, al giorno 4 del trattamento RNAi abbiamo contato la frazione di animali con testicoli ingranditi nella misura in cui si toccavano a vicenda. (Fig. 7). Simile ai risultati con Mlig-ddx39 RNAi, temperature più elevate hanno portato ad un più rapido sviluppo del fenotipo, e mentre nessun testicolo sufficientemente ingrandito è stato osservato dopo quattro giorni di trattamento con dsRNA a 20 °C, il 25 e l’85% degli animali aveva sviluppato testicoli ingranditi a 25 °C e 30 °C rispettivamente (Tabella 2). Quindi, in modo simile alla rigenerazione, i fenotipi RNAi possono essere accelerati con la temperatura in M. lignano e temperature più elevate possono essere utilizzate per abbreviare la durata degli esperimenti.