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Abstract

Questo studio ha cercato di determinare se la fase follicolare accorciata nelle donne anziane ovulatorie è secondaria ad una follicologenesi avanzata (cioè più precoce) o accelerata (cioè più rapida). Donne ovulatorie normali, di età compresa tra 40-45 anni (n = 15) e 20-25 anni (n = 13), sono state sottoposte a venipuntura quotidiana e a ecografia transvaginale durante la fase follicolare di un ciclo mestruale spontaneo (ciclo di controllo) e dopo la down-regolazione ipofisaria con un agonista GnRH (ciclo di studio). Come previsto, i soggetti più anziani nei cicli di controllo hanno dimostrato un elevato d 3 FSH e una fase follicolare più breve rispetto ai soggetti più giovani. Dopo il rilascio dalla soppressione dell’asse ipotalamo-ipofisi-ovaio, il picco iniziale della fase follicolare FSH si è verificato prima (6.8 vs. 9.8 d; P < 0.01) ed era di una maggiore entità (12.1 vs. 6.5 mIU/ml; P < 0.01) nei soggetti più anziani. Il tempo dal rilascio della soppressione fino al successivo aumento di LH era anche più breve (17,5 vs. 20,8 d; P < 0,01) nel gruppo più anziano. Tuttavia, il tempo dal picco FSH al picco LH era simile nei gruppi più anziani e più giovani (10.7 vs. 11.0 d; P = 0.74). Rispetto alle donne più giovani, i soggetti più anziani avevano livelli normali di fase follicolare di estradiolo e inibina A e livelli più bassi di inibina B in entrambi i cicli di controllo e di studio. Concludiamo che la fase follicolare abbreviata osservata nelle donne ovulatorie più anziane è dovuta a una più precoce selezione del follicolo dominante, indipendente dalle influenze ormonali della precedente fase luteale.

L’INVECCHIAMENTO PRODUTTIVO È un continuum che inizia molti anni prima che si verifichi una disfunzione assoluta. Un’importante manifestazione del processo di invecchiamento è un progressivo declino della fertilità femminile che inizia nell’ultima parte della terza decade e diventa esponenziale dopo i 35 anni (1, 2). Tale compromissione della fertilità precede segni evidenti di disfunzione dell’asse ipotalamo-ipofisi-ovaio (HPO) come l’irregolarità mestruale, con la maggior parte delle donne che continuano ad avere cicli mestruali regolari e ovulatori fino ai 40 anni (3, 4). Negli anni che precedono la transizione menopausale, l’ovulazione regolare viene mantenuta, mentre i cicli mestruali si accorciano progressivamente (4-6). Questo fenomeno è dovuto ad un accorciamento della fase follicolare senza alcun cambiamento associato alla lunghezza della fase luteale (5, 7). Un ulteriore segno distintivo dell’avanzare dell’età riproduttiva è l’aumento dell’FSH non accompagnato da un aumento dell’LH (aumento FSH monotropo) (6-9). L’inizio dell’aumento monotropo dell’FSH e l’ovulazione più precoce sembrano essere associati temporalmente a un’accelerazione del tasso di atresia follicolare che porta infine all’esaurimento della riserva follicolare (10). Pertanto, l’aumento monotropo dell’FSH e la fase follicolare abbreviata servono come indicatori clinici dell’avanzare dell’età riproduttiva e del rapido declino della fertilità (11).

Durante il normale ciclo mestruale, l’FSH aumenta nella tarda fase luteale o nella prima fase follicolare e tipicamente raggiunge un picco nella prima fase follicolare (12, 13). Con la selezione e il successivo sviluppo del follicolo dominante, l’FSH scende a un livello relativamente basso fino al picco gonadotropinico di metà ciclo. Il follicolo dominante nelle donne eumenorroiche in età riproduttiva avanzata è relativamente sano, cresce a dimensioni normali, produce livelli normali o elevati di estradiolo (E2) e secerne livelli normali di progesterone dopo la luteinizzazione (7, 8, 14). Queste caratteristiche normali del follicolo anziano dominante suggeriscono che l’ovulazione anticipata nelle donne anziane non è dovuta a un difetto intrinseco del follicolo, ma all’ambiente ormonale extrafollicolare. I cambiamenti endocrinologici più coerentemente descritti negli studi sull’invecchiamento riproduttivo sono un aumento del livello assoluto di FSH (6-9), un aumento più precoce della fase follicolare precoce di FSH (7), e un calo dei livelli di inibina B nella fase follicolare precoce (15-18).

Lo studio attuale è stato condotto per determinare se la fase follicolare ridotta nelle donne anziane che ovulano è secondaria a una follicologenesi avanzata (cioè anticipata) o accelerata (cioè più rapida). Abbiamo ipotizzato che il più precoce sviluppo del follicolo dominante nelle donne anziane sia secondario al più precoce aumento dell’FSH follicolare rispetto a quello dei controlli più giovani, e che il tasso assoluto di crescita follicolare sia simile nelle due età. In altre parole, abbiamo ipotizzato che lo sviluppo dei follicoli nelle donne in età riproduttiva avanzata sia avanzato piuttosto che accelerato. Gli effetti ormonali e intraovarici del precedente ciclo mestruale possono potenzialmente confondere gli studi sul reclutamento e la maturazione dei follicoli dominanti. Per eliminare tale influenza dal ciclo precedente, abbiamo soppresso l’asse HPO di ogni soggetto tramite down-regulation standard dell’agonista GnRH. Dopo che la soppressione dell’asse HPO è stata documentata, abbiamo confrontato il recupero della funzione ormonale, follicolare e mestruale in soggetti anziani e ovulatori rispetto a un gruppo di controllo più giovane.

Soggetti e metodi

Soggetti sperimentali

Come parte di una serie di studi sul normale invecchiamento riproduttivo, abbiamo reclutato donne ovulatorie sane, di età compresa tra 40-45 anni (n = 16) e 20-25 anni (n = 15), per partecipare. A tutti i soggetti è stato richiesto di avere cicli mestruali regolari (intervalli di ciclo di 21-35 d), un normale indice di massa corporea (18-24 kg/m2), e l’assenza di disturbi medici o riproduttivi (compresa qualsiasi storia di infertilità) e di dimostrare livelli sierici medio-luteali di PRL inferiori a 20 ng/ml, progesterone maggiore di 10 nmol/litro, e testosterone inferiore a 3 nmol/litro in un ciclo pre-studio. Per tutta la durata dello studio, tutti i soggetti erano in astinenza sessuale o utilizzavano metodi contraccettivi non ormonali (ad esempio, metodo di barriera o dispositivo intrauterino). Il consenso scritto è stato ottenuto da ogni partecipante, e un compenso monetario è stato fornito per tutti i volontari. Il protocollo è stato rivisto e approvato dalla University of Washington human subjects review board.

Materiali e metodi

Protocollo di studio.

Come ciclo di controllo, tutti i soggetti sono stati sottoposti a venipuntura giornaliera e ultrasonografia transvaginale seriale per valutare lo sviluppo del follicolo dominante nella fase follicolare di un ciclo spontaneo, naturale. Per il ciclo di studio, nafarelin acetato (400 μg, per via intranasale, al giorno) è stato avviato 7 d dopo LH urinario kit rilevato il picco gonadotropina metà ciclo nel ciclo precedente. Quando la soppressione dell’asse HPO è stato confermato da un livello sierico E2 sotto il limite di rilevamento del test (73 pmol / litro), nafarelin è stato continuato per un ulteriore 5 d per garantire una uniforme down-regolazione dell’asse HPO. A partire dal giorno dopo l’interruzione di nafarelin, è stata eseguita una venipuntura quotidiana per l’analisi dell’E2. Una volta che la concentrazione sierica di E2 ha raggiunto o superato 367 pmol/litro, sono stati eseguiti esami ecografici transvaginali quotidiani fino a quando è stato osservato il collasso del follicolo dominante. Il ciclo di studio è stato iniziato entro 6 mesi dal ciclo di controllo.

Saggi.

Tutti i campioni di siero di un particolare soggetto sono stati analizzati in duplicato nello stesso saggio per ridurre al minimo gli effetti della variabilità intra-test. I livelli di FSH nel siero sono stati determinati utilizzando un ELISA monoclonale a due siti in fase solida (DELFIA, Wallac Inc., Gaithersburg, MD). I coefficienti di variazione (CV) inter- e intra-saggio erano rispettivamente del 4,6% e del 2,3%. Il RIA per l’E2 sierico è stato eseguito utilizzando i reagenti forniti da ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA). Il CV inter- e intra-saggio era del 18% e del 9%, rispettivamente. Per misurare l’inibina B è stato utilizzato un ELISA a sandwich in fase solida (Serotec, Oxford, UK), basato sull’uso di piastre rivestite con un anticorpo monoclonale specifico per la subunità β dell’inibina. L’inibina B viene rilevata utilizzando un secondo anticorpo monoclonale specifico per la subunità α dell’inibina, e la procedura di dosaggio, secondo il produttore, prevede il pretrattamento dei campioni con i reagenti forniti nei kit (sodio dodecil solfato e perossido). La sensibilità analitica (ad esempio il minimo per la subunità βA dell’inibina) è stata determinata con un anticorpo monoclonale marcato con perossidasi di rafano specifico per la subunità α utilizzata per la rilevazione. Lo standard del test fornito dal produttore è stato calibrato utilizzando il primo standard internazionale dell’OMS per l’inibina (inibina umana ricombinante; lotto 91/624) e i risultati sono riportati come unità internazionali per millilitro di questo materiale di riferimento. Il test è stato controllato in duplicato utilizzando aliquote di campioni contenenti rispettivamente 2,00 o 9,56 UI/ml. Sulla base di questi controlli di qualità, il CV tra i test è stato dell’8,7% e del 3,3%, rispettivamente, sui 57 test utilizzati per ottenere i dati qui riportati.

Analisi statistica.

Per i risultati con un singolo valore di dati da ciascun individuo (ad esempio la lunghezza della fase follicolare), le medie delle due coorti sono state confrontate utilizzando un test t a due lati. Un α = 0,05 è stato scelto per indicare una differenza significativa. Per i risultati con diversi valori di dati da ciascun individuo (ad esempio, livelli seriali di E2), le medie dei campioni sono state confrontate mediante ANOVA con misure ripetute. Sulla base dei risultati degli studi precedenti, ci aspettavamo che la variabilità nel tempo di insorgenza dell’impulso LH fosse di circa il 20%. Pertanto, assumendo un coefficiente di variazione del 20%, abbiamo stimato che avremmo avuto l’80% di possibilità di trovare una differenza pari al 20% con 15 soggetti in ogni gruppo.

Risultati

Due donne più giovani e una più anziana sono state eliminate dallo studio a causa del mancato raggiungimento della soppressione dell’asse HPO. Le caratteristiche di base del ciclo di controllo per i soggetti rimanenti sono mostrate nella tabella 1. Come previsto, i soggetti più anziani hanno dimostrato una fase follicolare abbreviata così come un FSH elevato e diminuito inibina B sul ciclo d 3 del ciclo di controllo rispetto ai soggetti più giovani. In entrambi i cicli di controllo e di studio, tutti i soggetti in ogni gruppo di età hanno sviluppato un follicolo dominante con evidenza ecografica di successivo collasso del follicolo dopo il picco di LH a metà ciclo, dimostrando apparentemente normale sviluppo del follicolo dominante e l’ovulazione in entrambi i cicli naturali e dopo la sospensione della soppressione GnRH. La durata di Synarel (Searle, Skokie, IL) necessaria per ottenere la soppressione come definito dal protocollo di studio era un po ‘più lungo per i controlli più giovani (gamma, 9-20 d; media, 12.8 ± 0.8 d; dose totale, 5.1 ± 0.3 mg) rispetto ai soggetti più anziani (gamma, 9-13 d; media, 11.0 ± 0,3 d; dose totale, 4,4 ± 0,1 mg; P = 0,05 sia per la durata che per la dose).