HCoV-229E (VR-740) e HCoV-OC43 (VR-1558) sono stati propagati in fibroblasti polmonari diploidi umani MRC-5 (CCL-171) e WI-38 (CCL-75), rispettivamente (tutti da ATCC, Manassas, VA). Entrambe le linee cellulari umane sono state coltivate in MEM integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamina, 100 U/ml penicillina e 100 μg/ml streptomicina (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Il mezzo di infezione virale consisteva in MEM o RPMI-1640 più 2% di FBS inattivato al calore per HCoV-229E e HCoV-OC43, rispettivamente. I ceppi virali sono stati propagati mediante inoculazione di fiaschette contenenti cellule ospiti vecchie di 24 ore, che erano confluenti all’80-90%. Dopo un’ora di incubazione, il monostrato di cellule è stato lavato e incubato in un mezzo di infezione fresco per tre o quattro giorni a 35 °C per HCoV-229E e a 33 °C per HCoV-OC43. Il surnatante contenente lo stock virale di lavoro è stato poi raccolto per centrifugazione (300 g per 15 minuti). Il titolo del virus è stato determinato dal 50% di coltura del tessuto dose infettiva TCID50 valutando effetti citopatici (CPE), che sono stati segnati in un microscopio a campo chiaro (10 ×) come vacuolizzazione del citoplasma, arrotondamento delle cellule e sloughing.
Camera di irradiazione aerosol da banco
Un unico passaggio, dinamico aerosol / virus camera di irradiazione è stato utilizzato per generare, esporre e raccogliere campioni aerosol come precedentemente descritto23. Aerosol virale sono stati generati aggiungendo una soluzione di virus in un nebulizzatore di terapia respiratoria di aerosol esteso ad alta potenza (Westmed, Tucson, AZ) e utilizzando una pompa dell’aria con una portata di ingresso di 11 L/min. Il virus scorreva nella camera ed era mescolato con aria secca e umidificata per mantenere l’umidità tra circa il 50-70%. L’umidità relativa, la temperatura e la distribuzione granulometrica dell’aerosol sono state monitorate durante il funzionamento. L’aerosol è stato esposto alla luce UV lontano e infine raccolto utilizzando un BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
La lampada UV lontano è stato posizionato a circa 22 cm di distanza dalla camera di esposizione UV e diretto al 26 cm × 25,6 cm × 254 μm UV-trasmissione finestra di plastica (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Firenze, KY). Coerentemente con i nostri precedenti esperimenti utilizzando questa camera 23, la portata attraverso il sistema era 12,5 L/min. Il volume della regione di esposizione UV era 4,2 L così ogni aerosol è stato esposto per circa 20 secondi come ha attraversato la finestra. L’intera camera di irradiazione era contenuta in un armadio di livello 2 di biosicurezza e tutti gli ingressi e le uscite dell’aria erano dotati di filtri HEPA (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) per evitare che la contaminazione indesiderata entrasse o uscisse dal sistema.
Prestazioni della camera di irradiazione
La camera di irradiazione personalizzata ha simulato la trasmissione di virus aerosolizzati prodotti tramite tosse e respirazione umana. La camera ha funzionato con un’umidità relativa media del 66% e una temperatura media di 24 °C per tutte le corse. La distribuzione delle dimensioni medie delle particelle era 83% tra 0.3 μm e 0.5 μm, 12% tra 0.5 μm e 0.7 μm, e 5% >0.7 μm (tabella 3). I virus aerosolizzati sono stati efficacemente trasmessi attraverso il sistema come evidenziato dal controllo (esposizione zero) che mostra una chiara integrazione del virus (Figg. 2 e 3, pannelli in alto a sinistra).
Lampada Far-UVC e dosimetria
La sorgente far-UVC usata in questo studio era un modulo di lampada ad eccimeri KrCl da 12 W 222-nm prodotto da USHIO America (Item #9101711, Cypress, CA). La lampada è dotata di una finestra di filtraggio ottico proprietario per ridurre le emissioni della lampada al di fuori del picco di emissione 222 nm KrCl. La lampada è stata posizionata a 22 cm di distanza dalla finestra della camera di esposizione e diretto al centro della finestra. Le misure di potenza ottica sono state eseguite utilizzando un fotorivelatore al silicio 818-UV/DB a bassa potenza potenziato UV con un misuratore di potenza ottica 843-R (Newport, Irvine, CA). Dosimetria è stata eseguita prima di iniziare un esperimento per misurare la fluenza all’interno della camera nella posizione dell’aerosol.
La distanza tra la lampada e la camera di irradiazione permesso una singola lampada per irradiare uniformemente l’intera area della finestra di esposizione. Le misurazioni con il fotorivelatore al silicio hanno indicato un’intensità di esposizione di circa 90 μW/cm2 in tutta l’area di esposizione. La camera è dotata di una superficie in alluminio riflettente di fronte alla finestra di esposizione. Come nel nostro lavoro precedente con questa camera 23, la riflettività di questa superficie era circa il 15%. Abbiamo quindi conservativamente stimato l’intensità in tutta l’area di esposizione per essere 100 μW / cm 2. Con la lampada posizionata a 22 cm dalla finestra e dato i 20 secondi necessari per una particella di aerosol per attraversare la finestra di esposizione, abbiamo calcolato la dose totale di esposizione a una particella di essere 2 mJ / cm2. Abbiamo usato ulteriori fogli di finestre di plastica a trasmissione UV per ridurre uniformemente l’intensità in tutta la regione di esposizione per creare diverse condizioni di esposizione. Mentre nel nostro lavoro precedente con questi fogli abbiamo misurato una trasmissione più vicino al 65%23, per questi test abbiamo misurato la trasmissione 222-nm di ogni foglio di essere circa il 50%. Questa diminuzione della trasmissione è probabilmente dovuta alla fotodegradazione della plastica nel tempo4. L’aggiunta di uno o due fogli di plastica che copre la finestra di esposizione diminuisce la dose di esposizione a 1 e 0,5 mJ/cm2, rispettivamente.
Protocollo sperimentale
Come precedentemente descritto23, la soluzione di virus nel nebulizzatore consisteva di 1 ml di Modified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) contenente 107-108 TCID50 di coronavirus, 20 ml di acqua deionizzata, e 0,05 ml di Hank soluzione salina bilanciata con calcio e magnesio (HBSS + +). La camera di irradiazione è stato azionato con particelle di virus aerosolizzato che scorre attraverso la camera e il canale di bypass per 5 minuti prima di ogni campionamento, al fine di stabilire il valore desiderato RH. La raccolta del campione è stata avviata cambiando il flusso d’aria dal canale di bypass al BioSampler utilizzando la serie di valvole a tre vie. Il BioSampler è stato inizialmente riempito con 20 ml di HBSS++ per catturare l’aerosol. Durante ogni tempo di campionamento, che è durato per 30 minuti, l’interno della camera di irradiazione è stato esposto alla luce 222-nm far-UVC che entra attraverso la finestra di plastica. La variazione della dose di UV lontano consegnata alle particelle di aerosol è stata ottenuta inserendo ulteriori film plastici UV-trasparenti come descritto sopra, fornendo così le tre dosi di prova di 0,5, 1,0 e 2,0 mJ/cm2. Gli studi di controllo a dose zero sono stati condotti con la lampada ad eccimeri spenta. Dopo il periodo di campionamento è stato completato la soluzione dal BioSampler è stato utilizzato per il virus infettività assays.
Virus infettività assays
TCID50
Abbiamo usato il 50% tessuto cultura infettiva dose test per determinare il virus infettività28. Brevemente, 105 cellule ospite sono stati placcati in ogni pozzo di piastre a 96 pozzetti il giorno prima dell’esperimento. Le cellule sono state lavate due volte in HBSS + + e seriale 1:10 diluizioni in mezzo di infezione del virus esposto dal BioSampler è stato sovrapposto sulle cellule per due ore. Le cellule sono state poi lavate due volte in HBSS++, coperte con terreno di infezione fresco, e incubate per tre o quattro giorni a 34 °C. Gli effetti citopatici (CPE) sono stati valutati al microscopio a campo chiaro (10×) come vacuolizzazione del citoplasma, arrotondamento delle cellule e sloughing. Il TCID50 è stato calcolato con il metodo Reed e Muench28,38. Per confermare i punteggi CPE, i campioni sono stati fissati in metanolo al 100% per cinque minuti e colorati con 0,1% crystal violet. I risultati sono riportati come la stima delle unità formanti placca (PFU)/ml utilizzando la conversione PFU/ml = 0,7 TCID50 applicando la distribuzione di Poisson29.
Immunofluorescenza
Per valutare se dosi crescenti di luce 222-nm ridotto il numero di cellule infette, abbiamo eseguito un protocollo standard immunostaining fluorescente per rilevare un antigene virale nelle cellule umane ospite23. Brevemente, 2 × 105 cellule ospiti (cellule MRC-5 per HCoV-229E e WI-38 per HCoV-OC43) sono state placcate in ogni pozzetto di piastre a 48 pozzetti il giorno prima dell’esperimento. Dopo aver attraversato la camera di irradiazione per 30 minuti, 150 μl di sospensione di virus raccolti dal BioSampler sono stati sovrapposti al monostrato di cellule ospiti. Le cellule sono state incubate con il virus per un’ora, poi lavato tre volte con HBSS + +, e poi incubato per una notte in mezzo fresco di infezione. Le cellule infettate sono state poi fissate in 100% metanolo freddo a 4 ° C per 5 minuti e marcato con anti-human coronavirus spike glicoproteina (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 in HBSS + + contenente 1% di sieroalbumina bovina (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) a temperatura ambiente per un’ora con lieve agitazione. Le cellule sono state lavate tre volte in HBSS + + e marcato con capra anti-mouse Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 in HBSS + + contenente 1% BSA, a temperatura ambiente per 30 minuti al buio con agitazione delicata. Dopo tre lavaggi in HBSS + +, le cellule sono state colorate con Vectashield contenente DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e osservato con l’obiettivo 10 × di un microscopio fluorescente Olympus IX70 dotato di un Photometrics PVCAM ad alta risoluzione, fotocamera digitale ad alta efficienza e software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Per ogni dose di 222-nm e genere di virus, i risultati rappresentativi sono stati ripetuti due volte. Per ogni campione, sono stati acquisiti fino a dieci campi di vista di immagini DAPI e Alexa Fluor-488 fusi.
Analisi dei dati
La frazione sopravvissuta (S) del virus è stata calcolata dividendo la frazione PFU/ml ad ogni dose UV (PFUUV) per la frazione a dose zero (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Valori di sopravvivenza sono stati calcolati per ogni esperimento ripetuto e log naturale (ln) trasformato per portare la distribuzione degli errori più vicino alla normale39. Robusta regressione lineare utilizzando iterato ri-pesato minimi quadrati (IWLS) 40,41 è stata eseguita in R 3.6.2 software utilizzando questi valori ln normalizzati come variabile dipendente e la dose UV (D, mJ / cm 2) come variabile indipendente. Usando questo approccio, la sopravvivenza del virus è stata descritta dalla cinetica di primo ordine secondo l’equazione4:
dove k è la costante di velocità di inattivazione UV o fattore di suscettibilità (cm2/mJ). La regressione è stata eseguita con il termine di intercetta impostato su zero che rappresenta la definizione di sopravvivenza relativa al 100% a zero dose UV, separatamente per ogni ceppo di virus studiato. I dati a dose zero, che per definizione rappresentano ln = 0, non sono stati inclusi nella regressione. Le incertezze (intervalli di confidenza al 95%, CI) per il parametro k per ogni ceppo virale sono state stimate tramite bootstrapping per ogni metodo di regressione perché il bootstrapping può portare a stime di incertezza più realistiche, rispetto all’approssimazione analitica standard basata sulla normalità asintotica, in piccoli set di dati come quelli usati qui (n = 3 HCoV-229E e n = 4 per HCoV-OC43). La bontà dell’adattamento è stata valutata dal coefficiente di determinazione (R2). L’analisi dei residui per l’autocorrelazione e per l’eteroskedasticità è stata eseguita utilizzando il test Durbin-Watson42 e il test Breusch-Pagan (implementato dal pacchetto R lmtest)43 , rispettivamente. Le stime dei parametri (k) per ogni ceppo di virus sono state confrontate tra loro in base agli IC al 95% e direttamente con il test t, utilizzando le dimensioni del campione, i valori k e i loro errori standard. La sezione trasversale di inattivazione del virus, D90, che è la dose UV che inattiva il 90% del virus esposto, è stata calcolata come D90 = – ln/k. Altri valori D sono stati calcolati in modo simile.