Alai

1Introduzione

Il sanguinamento complica spesso il corso clinico della cirrosi. Il sito di sanguinamento più frequente e potenzialmente pericoloso per la vita è il tratto gastrointestinale. Potrebbe derivare da una varietà di lesioni tra cui le varici gastro-esofagee e la gastropatia ipertensiva portale o altre lesioni viste nella popolazione generale come l’esofagite, le lacerazioni di Mallory-Weiss e la malattia dell’ulcera peptica. I tassi di mortalità legati al sanguinamento gastrointestinale sono alti; fino al 30% degli episodi iniziali di sanguinamento da varici sono fatali. I pazienti con cirrosi possono anche sperimentare emorragie cutanee o associate alle mucose, tra cui lividi, porpora, epistassi, sanguinamento gengivale, menorragia e sanguinamento associato a procedure invasive come la biopsia epatica. Per molto tempo si è pensato che questo aumento del rischio emorragico fosse legato a disturbi emostatici acquisiti nei pazienti cirrotici. Infatti, il fegato sintetizza quasi tutti i fattori di coagulazione ad eccezione del fattore VIII. Si è pensato che la ridotta sintesi dei fattori di coagulazione fosse responsabile di test di laboratorio convenzionali anormali che esplorano l’attivazione globale della coagulazione, come il tempo di protrombina (PT) e la tromboplastina parziale attivata (aPTT). Tuttavia è stato notato che, nonostante il PT e l’aPTT prolungati, molti pazienti cirrotici non sperimentano emorragie anche dopo la biopsia epatica o altre procedure potenzialmente emorragiche. Inoltre, alcuni pazienti cirrotici sperimentano eventi tromboembolici nonostante i test di laboratorio convenzionali anormali. Finora, solo pochi studi hanno indagato l’impatto dei disturbi della coagulazione sul rischio di sanguinamento nei pazienti cirrotici.

Questo studio mira a valutare la relazione tra i disturbi emostatici e il rischio di sanguinamento nei pazienti cirrotici attraverso l’indagine dell’equilibrio emostatico nei pazienti cirrotici con e senza sanguinamento rispetto ai controlli.

2Materiali e metodi

Lo studio è stato eseguito in conformità con la Dichiarazione di Helsinki dell’Associazione medica mondiale ed è stato approvato dal comitato etico locale. Tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato prima dell’inclusione nello studio.

2.1Popolazione di pazienti e disegno dello studio

Cinquantuno pazienti cirrotici costituivano il gruppo di casi e 50 controlli sani abbinati per età e sesso sono stati inclusi in uno studio cross-sectional. I dati riguardanti gli episodi di sanguinamento, le caratteristiche della cirrosi e i farmaci sono stati estratti dalle cartelle cliniche. La gravità della cirrosi è stata stimata secondo il punteggio di Child Turcotte Pugh. Sono stati identificati i pazienti che hanno avuto episodi di sanguinamento entro 2 mesi prima o dopo l’inclusione. Per ognuno di questi pazienti, sono state determinate la sede e la gravità del sanguinamento. I pazienti che hanno avuto un’emorragia con deglobulizzazione (caduta dell’emoglobina di 2g/dl o più) richiedendo o meno una trasfusione sono stati considerati come aventi un’emorragia grave. I criteri di esclusione erano il carcinoma epatocellulare o qualsiasi altra neoplasia, l’infezione batterica, la malattia infiammatoria cronica, la sindrome nefrosica, l’insufficienza renale, le anomalie di coagulazione ereditarie note e l’uso di farmaci anticoagulanti o antipiastrinici. I pazienti sono stati divisi in due gruppi: Il gruppo (H+) comprendeva i pazienti che avevano avuto episodi di sanguinamento e il gruppo (H-) comprendeva i pazienti che non li avevano avuti.

2.2Raccolta del sangue

Il campione di sangue è stato prelevato tramite venipuntura in provette di plastica contenenti citrato di sodio al 3,2% come anticoagulante nella proporzione da una a nove parti di anticoagulante/sangue. Il plasma piastrinico povero (PPP) è stato ottenuto dopo una doppia centrifugazione del sangue a 2500×g per 15 minuti. Il PPP è stato aliquotato e congelato a -80°C fino all’esecuzione dei test di coagulazione.

2.3Test di laboratorio2.3.1Test di laboratorio convenzionali

Il tempo di protrombina (PT) e il tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT) sono stati misurati, rispettivamente, con la tromboplastina umana (neoplastina, STAGO) e il reagente APTT automatizzato (APTT, STAGO). Il fibrinogeno è stato misurato con (STA fibrinogen, STAGO).

2.3.2Fattori pro e anticoagulanti

Le attività dei fattori pro e anticoagulanti sono state determinate come attività funzionali utilizzando i reagenti STAGO: Le attività dei fattori VIII e XII sono state misurate con test di coagulazione standard basati sull’aPTT (rispettivamente con DEFICIENT VIII e IMMUNODEF XII). Le attività dei fattori VII, V e II sono state misurate con test di coagulazione basati sul PT (rispettivamente con DEFICIENT VII, DEFICIENT V, IMMUNODEF II). Le attività della proteina C (PC) e della proteina S (PS) sono state misurate con test di coagulazione (STACLOT PC e STACLOT PS). L’attività dell’antitrombina (AT) è stata determinata utilizzando il test cromogenico (STACHROM AT). Tutti i test sono stati eseguiti su STA COMPACT MAX (STAGO; Asnières France). La conta delle piastrine è stata eseguita su un analizzatore ematologico (SYSMEX XT 2000i; Cobe, Giappone).

2.3.3Generazione di trombina

La generazione di trombina (TG) è stata misurata con il metodo automatico calibrato della trombina (trombiniscopo-Thermosystem). La coagulazione è stata innescata nel PPP dopo l’aggiunta di fattore di tessuto 1pmol/L e fosfolipidi (PPP reagente basso-STAGO) in due fasi: in assenza poi in presenza di attivatore della proteina C (PROTAC; STACLOT PC STAGO). La registrazione della trombina generata nel tempo è stata effettuata con un substrato fluorogenico (FLUCAT, STAGO). La TG è stata espressa come potenziale di trombina endogena (ETP) in nmol×min.

2.3.4L’equilibrio emostatico

L’equilibrio emostatico è stato valutato tramite i rapporti tra fattori procoagulanti e anticoagulanti e il rapporto ETP con/senza attivatore PC.

2.4Analisi statistica

Il software Statistical Package for Social Science (SPSS) versione 21.0 (IBM Corp., Armonk. New York, USA) è stato utilizzato per l’analisi dei dati. I dati sono stati riassunti come media e percentuale. I gruppi di studio sono stati confrontati usando il test χ2 per le variabili qualitative. I test t e ANOVA di Student sono stati utilizzati per l’analisi dei dati parametrici. I test Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis H sono stati utilizzati per l’analisi dei dati non parametrici. Il valore p inferiore o uguale a 0,05 è stato considerato significativo.

3Risultati

L’età media dei pazienti all’inclusione era di 57,8 anni (16-91 anni). L’età media alla diagnosi di cirrosi era di 55 anni (6-88 anni). C’erano 24 maschi e 27 femmine. L’eziologia principale della cirrosi era l’epatite virale (64,7%). I pazienti sono stati classificati secondo il punteggio di Child-Pugh come classe A in 14 pazienti (27,5%), classe B in 22 pazienti (43,2%) e classe C in 15 pazienti (29,3%). Il gruppo (H+) comprendeva 9 pazienti (17,6%). Gli episodi di sanguinamento erano emorragia variceale (n=6), sanguinamento gastrointestinale secondario a ulcere gastriche (n=1) e duodenali (n=1) e gengivorragia (n=1). L’emorragia è stata giudicata da lieve a moderata in 6 pazienti e grave in altri 3. Entrambi i gruppi di pazienti erano comparabili per quanto riguarda l’età, il sesso e il punteggio di Child-Pugh.

Ovviamente, per quanto riguarda i controlli, non si sono verificati episodi di sanguinamento entro 2 mesi prima o dopo l’inclusione.

3.1Esami di laboratorio convenzionali

Non c’era alcuna differenza significativa nei livelli medi di PT, aPTT e fibrinogeno tra i gruppi (H+) e (H-). La conta delle piastrine era significativamente più bassa nei pazienti (H+) che nei pazienti (H-) (p=0,01) (Tabella 1).

3.2Fattori coagulanti e anticoagulanti

I livelli medi dei fattori pro e anticoagulanti erano significativamente più bassi nei pazienti cirrotici che hanno avuto episodi di sanguinamento (H+) che nei controlli. Tuttavia, il fattore VIII era significativamente più alto nei pazienti cirrotici che nei controlli (166% contro 94,5%; p=0,045). Non c’era alcuna differenza significativa tra entrambi i gruppi (H+) e (H-) per quanto riguarda i livelli di fattori pro e anticoagulanti (Tabella 2).

3.3Generazione di trombina

Non c’era differenza significativa tra i pazienti (H+) e i controlli per quanto riguarda il livello medio di ETP senza attivatore PC (716,1 vs 811nmol×min rispettivamente; p=0,5). In presenza dell’attivatore PC, l’ETP era sorprendentemente più alta nei pazienti (H+) che nei controlli (725 vs. 387nmol×min; p=0.05).

Tuttavia, non c’era una differenza significativa tra i gruppi di pazienti per quanto riguarda l’ETP con e senza attivatore PC.

3.4Equilibrio emostatico3.4.1I rapporti dei fattori pro- e anticoagulanti

Rispetto ai controlli, i fattori VIII/anticoagulanti (VIII/PC, VIII/PS, VIII/AT), VII/PC e XII/PC erano significativamente più alti nei pazienti (H+). Tutti gli altri rapporti erano all’incirca agli stessi livelli.

Nessuna differenza significativa per quanto riguarda tutti i rapporti tra i pazienti che hanno avuto un’emorragia (H+) e quelli che non l’hanno avuta (H-) è stata rilevata (Tabella 3).

3.4.2 Rapporto ETP

ETP con/senza attivatore PC era significativamente più alto nei pazienti (H+) che nei controlli (0.97 vs. 0,51; p=0,017) (Fig. 1A).

Tuttavia, non c’era una differenza significativa tra i gruppi di pazienti per quanto riguarda il rapporto ETP (Fig. 1B).

4Discussione

Lo studio attuale ha dimostrato che l’equilibrio emostatico valutato dai rapporti dei fattori pro- e anticoagulanti e dal rapporto ETP con/senza attivatore PC era a favore di uno stato di ipercoagulabilità anche nei pazienti cirrotici che hanno avuto eventi di sanguinamento. Quando si confrontano entrambi i gruppi di pazienti, i pazienti cirrotici che hanno avuto un’emorragia hanno generato all’incirca la stessa quantità di trombina di quelli che non l’hanno avuta. A nostra conoscenza, non ci sono stati studi pubblicati che indagano l’impatto del test di generazione di trombina nella valutazione del rischio di sanguinamento nella cirrosi.

Tuttavia, la principale limitazione di questo studio è il piccolo numero di pazienti cirrotici che hanno avuto sanguinamenti.

La tendenza al sanguinamento nei pazienti cirrotici e in particolare in quelli con malattia epatica avanzata è stata supportata da molte osservazioni cliniche. Gli eventi emorragici più rilevanti in tali pazienti derivano dalla rottura delle varici esofagee e dalla gastropatia ipertensiva portale. Il sanguinamento può verificarsi anche dalle stesse lesioni viste nella popolazione generale, come l’ulcera peptica, epistassi, gengivorragia, lividi o da procedure invasive. Nel nostro studio, l’emorragia variceale è stata la sede più comune di emorragia, poiché si è verificata in due terzi dei pazienti.

Storicamente, le anomalie emostatiche dovute all’insufficienza epatica, come il PT e l’aPTT prolungati, sono state ritenute il riflesso dei disturbi emorragici che si verificano frequentemente nei pazienti cirrotici. Così, il PT è stato spesso corretto per mezzo di plasma fresco congelato prima della biopsia epatica o di altre procedure potenzialmente emorragiche.

Nel presente studio, non c’è stata alcuna differenza significativa tra i pazienti che hanno avuto un’emorragia e quelli che non l’hanno avuta per quanto riguarda i livelli medi di PT e aPTT. I nostri risultati sono in accordo con quelli di molti articoli che suggeriscono che questi test convenzionali non sono così buoni nel predire il sanguinamento nelle coagulopatie acquisite rispetto a quelle congenite. Infatti, Segal et al. non hanno trovato alcuna prova per concludere che il PT prolungato possa predire il sanguinamento durante le procedure diagnostiche invasive. Inoltre, Tripodi ha notato che, paradossalmente, i pazienti cirrotici con PT quasi normale potrebbero sanguinare mentre i pazienti con PT relativamente anormale comunemente non lo fanno. La mancanza del suo potere predittivo di sanguinamento può essere spiegata dal fatto che solo l’attività procoagulante ma non quella anticoagulante (PC, PS, AT) viene riflessa dal PT. Poiché sia i fattori procoagulanti che quelli anticoagulanti sono diminuiti nella cirrosi, il PT e l’aPTT non potrebbero rappresentare l’equilibrio tra i fattori pro e anticoagulanti.

Per quanto riguarda la conta delle piastrine valutata nel presente studio, i pazienti che hanno subito un’emorragia avevano livelli significativamente più bassi dei pazienti che non l’hanno avuta (p=0,01). I nostri risultati erano in accordo con quelli di El Bokl et al. dove la conta delle piastrine è stata trovata significativamente più bassa nei pazienti cirrotici che hanno avuto ematemesi e melena rispetto a quelli che non hanno avuto episodi di sanguinamento (p

0.0001). Questi risultati potrebbero essere supportati dalle molteplici alterazioni quantitative e qualitative che potrebbero influenzare le piastrine nei pazienti con malattia epatica cronica. L’aumento del sequestro delle piastrine nella milza causato dall’ipertensione portale e la diminuzione della produzione di trombopoietina da parte del fegato malato sono i principali meccanismi della trombocitopenia nei pazienti cirrotici. Oltre alla trombocitopenia, è stata riscontrata anche una funzione piastrinica difettosa, poiché l’adesione, l’aggregazione e la capacità di sostenere la generazione di trombina sono compromesse nei pazienti cirrotici. Questi risultati sono stati supportati da diverse osservazioni cliniche che dimostrano che una conta piastrinica 3 è stata associata a un rischio significativamente aumentato di sanguinamento legato a procedure invasive. Così, la conta delle piastrine sembra essere più affidabile di altri test emostatici convenzionali (TP o aPTT) nella valutazione del rischio di sanguinamento. Anche se non ci sono studi prospettici che determinano la soglia di conta piastrinica per la trasfusione profilattica nei pazienti cirrotici, le linee guida AASLD per la biopsia epatica raccomandano di prendere in considerazione la trasfusione di piastrine prima della biopsia epatica per una conta piastrinica 3 (Classe I livello C).

Nello studio attuale, non vi era alcuna differenza tra (H+) e (H-) pazienti per quanto riguarda il livello di fibrinogeno plasmatico. Tuttavia, Siddiqui et al. hanno trovato una correlazione significativa per la diminuzione del livello di fibrinogeno con il sanguinamento gastrointestinale nei pazienti cirrotici (RR=1,47; 95% CI, 0,64-3,35) .

In effetti, l’ipofibrinogenemia che si osserva frequentemente nei pazienti con cirrosi avanzata è ritenuta aumentare il rischio di sanguinamento poiché il fibrinogeno serve sia come precursore della fibrina che come mediatore dell’aggregazione piastrinica. Il rischio di sanguinamento è considerato particolarmente elevato quando i livelli di fibrinogeno sono inferiori a 1g/L. Nel presente studio, i nostri risultati per quanto riguarda i livelli di fibrinogeno potrebbero essere spiegati dal fatto che la maggior parte dei pazienti aveva una malattia epatica stabile.

Nel presente studio, i fattori procoagulanti (II, V, VII e XII) e anti-coagulanti (PC, PS e AT) erano significativamente più bassi nei pazienti cirrotici che avevano sanguinamento rispetto ai controlli. Tuttavia, il FVIII era notevolmente aumentato nel primo gruppo. Diversi studi precedenti erano in accordo con i nostri risultati indipendentemente dallo stato di sanguinamento o trombotico dei pazienti cirrotici.

Confrontando i pazienti (H+) e (H-), non è stata rilevata alcuna differenza nei livelli di fattori pro e anticoagulanti. In linea con i nostri risultati, El Bokl et al. non hanno mostrato alcuna differenza significativa tra i due gruppi di pazienti per quanto riguarda il livello di FVIII. Tuttavia, paradossalmente, la PC era significativamente più bassa nei pazienti cirrotici che hanno avuto un’emorragia rispetto a quelli che non l’hanno avuta (36,4% vs. 65%; p=0,018). Questi risultati suggeriscono che gli eventi emorragici nei pazienti cirrotici non sono legati ai livelli plasmatici dei fattori di coagulazione. Infatti, gli studi randomizzati controllati forniscono prove contro l’efficacia dell’infusione del fattore VII attivato ricombinante nel controllo delle emorragie da varici o durante l’epatectomia .

Nel presente studio, per quanto riguarda l’equilibrio emostatico, i fattori VIII/anticoagulanti (VIII/PC; VIII/PS e VIII/AT), VII/PC e XII/PC erano significativamente più alti nei pazienti (H+) che nei controlli. Tutti gli altri rapporti erano approssimativamente agli stessi livelli tra i pazienti (H+) e i controlli. Allo stesso modo, gli studi precedenti hanno mostrato che i rapporti tra fattori pro e anticoagulanti (II/PC, V/PC, VIII/PC e VIII/AT) erano significativamente più alti nei pazienti cirrotici che nei controlli.

Nello studio attuale, tutti i rapporti tra fattori pro e anticoagulanti erano agli stessi livelli tra entrambi i gruppi di pazienti. Tuttavia, El Bokl et al. hanno mostrato paradossalmente un livello significativamente più alto di FVIII/PC nei pazienti cirrotici che hanno avuto eventi emorragici rispetto ai pazienti che non hanno avuto .

Per quanto riguarda la generazione di trombina valutata nello studio attuale, non vi era alcuna differenza tra i controlli e i gruppi di pazienti.

Dopo l’attivazione della PC, il rapporto ETP era significativamente più alto nei pazienti (H+) che nei controlli (p=0,017). Questi risultati erano in accordo con quelli di Tripodi et al. suggerendo uno stato di resistenza all’effetto anticoagulante della PC attivata nei pazienti cirrotici. Questo “stato di ipercoagulabilità” potrebbe anche avere un effetto protettivo contro il sanguinamento nei pazienti cirrotici. Nello stesso contesto, il rapporto ETP non ha raggiunto la significatività statistica tra i due gruppi di pazienti. Questo risultato fornisce un ulteriore argomento contro il principio tradizionale secondo cui i disturbi della coagulazione rilevati nei pazienti cirrotici sono predittori di sanguinamento.

Sembra che il sanguinamento gastrointestinale possa essere spiegato da alterazioni emodinamiche legate all’ipertensione portale. La malattia epatica avanzata, le grandi varici, la tensione della parete delle varici e la presenza di una marcatura rossa delle balle sono state segnalate come fattori di rischio per il sanguinamento delle varici nei pazienti cirrotici. Disfunzioni endoteliali, infezioni batteriche e insufficienza renale possono anche contribuire al sanguinamento gastrointestinale. Altri eventi emorragici come l’epistassi, la gengivorragia e le ecchimosi possono essere spiegati dalla trombocitopenia, che a sua volta è dovuta principalmente all’ipertensione portale.

Prima di concludere, vale la pena notare che nei pazienti con malattia epatica cronica, la carenza di vitamina K è uno dei principali fattori implicati nei disturbi della coagulazione sopra descritti. Infatti, la carenza di vitamina K può comportare non solo una diminuzione della sintesi dei fattori di coagulazione, ma anche la produzione di precursori sottocarbossilati di queste proteine che sono funzionalmente inattivi. Queste proteine sono note come proteine indotte dalla mancanza di vitamina K (PIVKA) come la protrombina sottocaboxilata (PIVK-II) che ha dimostrato di essere secreta dalle cellule del carcinoma epatocellulare nei pazienti cirrotici. Anche se è stato riportato in alcuni studi precedenti che la somministrazione di vitamina K in tali pazienti non ha migliorato i disturbi della coagulazione, i dati riguardanti la sensibilità della protrombina sottocabossilata sono ancora contrastanti. Quindi, potremmo ipotizzare che sarebbe probabilmente saggio non somministrare la vitamina K in pazienti cirrotici al fine di prevenire una significativa diminuzione del livello di protrombina sottocarbossilata che può svolgere un ruolo nella diagnosi precoce del carcinoma epatocellulare in tali pazienti.

In conclusione, anche se i nostri risultati devono essere interpretati con cautela a causa del piccolo numero di pazienti (H+), essi possono sostenere il concetto che i test di laboratorio convenzionali anormali come PT e aPTT prolungati non correlano con il rischio di sanguinamento nei pazienti cirrotici. Tuttavia, la conta delle piastrine sembra essere un miglior predittore di sanguinamento rispetto al PT e all’aPTT. L’equilibrio emostatico è spostato verso uno stato di ipercoagulabilità anche nei pazienti cirrotici che hanno avuto un’emorragia. Sospettiamo che il sanguinamento gastrointestinale in tali pazienti sia principalmente emodinamico dovuto all’ipertensione portale. Ulteriori studi dovrebbero prendere in considerazione il sistema fibrinolitico. Infatti, l’iperfibrinolisi è stata riportata in alcuni casi come causa di sanguinamento nei pazienti cirrotici, anche se questo concetto rimane controverso.AbbreviazioniETP

potenziale di trombina endogena

PC

proteina C

PT

tempo di protrombina

aPTT

tromboplastina parziale attivata

PPP

pompo piastrinico

PS

proteina S

AT

antitrombina

TG

generazione della trombina

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Io, l’autore sottoscritto, certifico che la mia istituzione ha approvato il protocollo per qualsiasi indagine che coinvolge esseri umani o animali e che tutta la sperimentazione è stata condotta in conformità con i principi etici e umani della ricerca.

Contributi degli autori

Asma labidi, Hela Baccouche, Monia Fekih e Neila BenRomdhane hanno progettato lo studio.

Hela Baccouche ha effettuato i test biologici.

Asma Labidi e Hela Baccouche hanno analizzato i dati.

Asma labidi ha scritto il manoscritto con il supporto di Hela Baccouche.

Tutti gli autori hanno discusso i risultati e hanno contribuito al manoscritto finale.

Conflitto di interessi

Nessuno.

Consenso informato

Tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato alla pubblicazione dei dettagli del caso.