Alai

Il cancro della testa e del collo è il settimo tipo di cancro più comune per incidenza e mortalità, con 890.000 nuovi casi e 450.000 morti nel mondo nel 2018. Il trattamento rimane impegnativo con le attuali terapie che comportano tassi di sopravvivenza a cinque anni inferiori al 50% per i pazienti con malattia localmente avanzata. La resistenza ai farmaci e la tossicità limitano l’efficacia dei chemioterapici come cis- o carboplatino, 5-fluorouracile e taxani. L’introduzione di agenti mirati come cetuximab, nivolumab o pembrolizumab ha migliorato il risultato, ma non ha superato il problema della resistenza primaria o acquisita al trattamento nella maggior parte dei pazienti. Solo pochissimi biomarcatori sono attualmente utilizzati nella pratica clinica o hanno effettivamente proceduto verso la convalida per l’uso di routine. Modelli preclinici affidabili sono quindi fondamentali per comprendere meglio i meccanismi molecolari coinvolti nella resistenza e nella progressione del trattamento HNSCC e per sviluppare strategie terapeutiche più efficaci.

Le linee cellulari immortalate derivate dai tumori HNSCC rappresentano un valido strumento per l’analisi funzionale della resistenza al trattamento. Lo screening dei farmaci in colture cellulari monostrato rimane l’approccio comune per identificare nuovi agenti terapeutici. Tuttavia, le culture tridimensionali (3D) che rappresentano più da vicino l’architettura del tessuto tumorale e l’ambiente cellulare potrebbero essere superiori per prevedere l’efficacia della droga nei pazienti. Infatti, grandi variazioni nella sensibilità alle radiazioni e ai farmaci sono state mostrate in studi che utilizzano colture cellulari 3D, simili a quelle trovate con i tumori in vivo. Anche se le colture 3D sono utili per studiare le interazioni tra diverse popolazioni di cellule, non riproducono completamente la complessità del HNSCC. Quindi, lo sviluppo di nuove terapie potrebbe in definitiva richiedere modelli animali clinicamente rilevanti di HNSCC che rappresentano accuratamente i cambiamenti cellulari e molecolari associati con l’inizio e la progressione del cancro umano. A questo proposito, modelli HNSCC indotti da carcinogeni, animali transgenici e modelli xenotrapiantati sono entrati nel campo della ricerca HNSCC. Questa recensione descrive i modelli preclinici di HNSCC maggiormente utilizzati (schematicamente rappresentati nella Fig. 1) e fornisce una panoramica dei loro punti di forza e limiti. Discutiamo anche i nuovi approcci di selezione del trattamento personalizzato basato su questi modelli.

Modelli ex vivo

Linee cellulari HNSCC immortalate

Quattro decenni fa, sono stati riportati i primi protocolli per colture ex vivo di cellule HNSCC. Dopo aver risolto gli ostacoli precedenti come la crescita eccessiva dei fibroblasti e la dipendenza dagli strati di alimentazione con questi protocolli, le linee cellulari HNSCC sono state stabilite con successo. Tecniche di cultura sono state ulteriormente migliorate da allora, e varie linee cellulari HNSCC in crescita stabile su numerosi passaggi sono stati generati. Una descrizione dettagliata di tutte le linee cellulari HNSCC disponibili sarebbe oltre lo scopo di questa recensione. Vorremmo quindi rimandare il lettore a due precedenti articoli di revisione. Poiché le linee cellulari immortalizzate HNSCC possono essere facilmente mantenute ed espanse, sono state ampiamente utilizzate per studiare le alterazioni genetiche e le risposte biologiche alle perturbazioni chimiche e genetiche, per identificare potenziali bersagli molecolari, e per sviluppare nuove piccole molecole e terapie biologiche. Più recentemente, è stato dimostrato che queste linee cellulari possono anche essere utilizzate per studiare l’eterogeneità intratumorale e l’evoluzione clonale che si verifica sotto la pressione della terapia. I dati provenienti da tali studi molecolari e funzionali completi in questi modelli sono stati assemblati in librerie come la Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), che rappresenta un prezioso archivio della diversità del cancro umano.

Anche se le linee cellulari HNSCC coltivate in colture bidimensionali (2D) monostrato continuano ad essere modelli importanti nella ricerca di nuovi approcci terapeutici per questa malattia, generalmente soffrono della loro incapacità di riflettere la natura istologica, l’architettura tridimensionale (3D) e le differenze strutturali e funzionali del tumore in vivo. Queste limitazioni influenzano significativamente il valore informativo degli studi in vitro che valutano l’efficacia di modalità di trattamento stabilite e nuove per HNSCC in colture monostrato. Infatti, sono state riportate notevoli differenze nella sensibilità delle colture 2D rispetto a quelle 3D di linee cellulari HNSCC per la radiazione e il trattamento farmacologico, ad esempio con cisplatino, cetuximab e l’inibitore mTOR AZD8055 . L’analisi molecolare comparativa delle cellule che crescono in colture 2D rispetto a quelle 3D ha fornito possibili spiegazioni per la minore sensibilità delle cellule in colture 3D, come l’espressione e l’attivazione dei geni associati alla riparazione del DNA e l’aumento dei livelli di espressione dei geni associati alla transizione epiteliale-mesenchimale e alla staminalità in condizioni 3D.

L’instabilità genetica e il verificarsi di una selezione clonale durante la coltura in vitro sono ulteriori potenziali limitazioni delle linee cellulari di cancro e possono spiegare perché i risultati che coinvolgono le linee cellulari sono spesso difficili da riprodurre. Infatti, l’analisi completa dei ceppi delle linee cellulari di cancro al seno MCF7 e al polmone A549 comunemente usate ha rivelato un’ampia variazione genomica tra i ceppi che era associata alla variazione delle proprietà cellulari biologicamente significative. È importante notare che quando i ceppi sono stati testati contro 321 composti anticancro, sono state osservate risposte farmacologiche notevolmente diverse, con almeno il 75% dei composti che inibiscono fortemente alcuni ceppi ma sono completamente inattivi in altri. Questo studio sottolinea chiaramente l’urgente necessità di migliorare i modelli ex vivo per sostenere la ricerca sul cancro massimamente riproducibile.

Modelli avanzati ex vivo di HNSCC

Köpf-Maier e colleghi sono stati i primi a stabilire un metodo che ha permesso alle cellule di carcinoma umano di diverse entità istologiche tra cui i carcinomi a cellule squamose (SCC) della faringe di riorganizzarsi in vitro in “strutture organoidi” . Hanno dimostrato che queste colture organoidi hanno mantenuto le proprietà critiche dello stato in vivo, come l’architettura 3D, la crescita di tipi di cellule eterogenee da un singolo carcinoma e la differenziazione morfologica in condizioni sperimentali relativamente semplici. In uno studio successivo, lo stesso gruppo ha dimostrato che queste colture organoidi possono essere utilizzate per la sperimentazione di farmaci, e che i dati di risposta ottenuti erano concordanti con la risposta dei pazienti alla terapia. Gli autori sono stati i primi a proporre le colture organoidi come piattaforma personalizzata di test di farmaci in vitro, permettendo la previsione della chemiosensibilità individuale dei carcinomi in pochi giorni.

Da allora, le tecniche per coltivare i tessuti in vitro in 3D come strutture organotipiche sono state raffinate. Sono stati sviluppati protocolli per stabilire organoidi da cellule staminali adulte ed embrionali che sono in grado di auto-organizzarsi in strutture 3D che riflettono il tessuto di origine (per una revisione vedi Clevers, 2016). Le prime culture organoidi derivate da cellule staminali adulte sono state stabilite da cellule staminali intestinali di topo che sono state poste in condizioni che imitano la nicchia delle cellule staminali intestinali. La riprogrammazione condizionata indotta dall’aggiunta di R-spondin-1, fattore di crescita epidermico (EGF) e Noggin al mezzo di coltura, e l’incorporazione delle cellule in un estratto di membrane basali che fornisce matrice extracellulare, ha dimostrato di stimolare le cellule staminali adulte ad autorinnovarsi, proliferare e formare prole differenziata, simile all’epitelio intestinale. Questa tecnica, inizialmente sviluppata per studiare il tessuto infetto, infiammatorio e neoplastico del tratto gastrointestinale umano, è stata utilizzata non solo per la creazione di colture organoidi da una varietà di tessuto umano normale, ma anche di tessuto tumorale derivato da pazienti. Questi studi hanno significativamente ampliato e migliorato l’insieme dei modelli di cancro disponibili.

Più recentemente, le prime scoperte di Köpf-Maier e colleghi sulle colture organoidi HNSCC che sono una piattaforma adatta per la sperimentazione di farmaci in vitro sono state confermate da diversi studi indipendenti. Anche se sono state segnalate notevoli differenze nei tassi di successo della creazione di colture di organoidi primari in crescita a lungo termine da pazienti HNSCC (30% contro 65%), tutti gli studi finora hanno descritto all’unanimità che gli organoidi mantengono molte proprietà del tumore originale, tra cui eterogeneità intratumorale, profilo di mutazione e modelli di espressione proteica. Inoltre, è stato dimostrato che gli organoidi hanno mantenuto il loro potenziale tumorale dopo lo xenotrapianto. Le risposte al trattamento farmacologico in vivo sono risultate simili alle IC50 calcolate dagli organoidi mediante saggi di sensibilità ai farmaci in vitro Inoltre, i dati di radiosensibilità dai test sugli organoidi erano correlati alla risposta clinica nei pazienti. È importante notare che non solo gli effetti legati al trattamento nei tumori, ma anche gli effetti collaterali indesiderati della terapia nei tessuti normali possono essere studiati in modelli organoidi. Ad esempio, gli organoidi delle ghiandole salivari derivati dai pazienti sono stati utilizzati per la dissezione della base molecolare di iposalivazione, un frequente effetto collaterale grave di radiazioni.

Un ulteriore studio ha identificato le colture cellulari primarie 2D dai tumori dei pazienti HNSCC come ulteriore modello ex vivo HNSCC prezioso. Qui, lo screening individualizzato su larga scala di terapie anticancro ha identificato in modo riproducibile i farmaci che mostrano un’attività antitumorale in modelli xenotrapiantati derivati da pazienti (PDX) abbinati, fornendo così ulteriori prove che le colture primarie HNSCC potrebbero essere utilizzate per supportare il processo decisionale terapeutico in un contesto clinico di routine.

Sono state utilizzate anche colture origanoidi di tessuti umani normali, displastici e maligni della lingua per riprodurre le fasi principali della tumorigenesi della lingua. L’istomorfometria, l’immunoistochimica e le analisi al microscopio elettronico in co-culture 3D di cheratinociti primari derivati dalla lingua e fibroblasti in matrice di collagene hanno mostrato che la crescita stratificata, la proliferazione cellulare e la differenziazione erano comparabili tra le co-culture e i rispettivi tessuti nativi, tuttavia, differivano ampiamente nelle culture cresciute senza fibroblasti. Questi risultati supportano studi precedenti che mostrano un ruolo importante dei fibroblasti associati al cancro nella patogenesi di HNSCC. Questi dati, insieme all’ampia evidenza dalla letteratura sugli effetti di promozione del tumore del microambiente tumorale (TME), sostengono fortemente l’uso futuro di modelli preclinici più avanzati che comprendono tutti i principali componenti TME. Nuovi protocolli sono oggi disponibili per la generazione di organoidi contenenti accanto a cellule stromali anche le cellule immunitarie del paziente. Così, anche se la cultura organoide ha delle limitazioni, come il consumo di tempo e risorse considerevoli e l’incorporazione di fattori estrinseci indefiniti che possono influenzare il risultato degli esperimenti (Tabella 1), queste culture potrebbero rappresentare modelli adatti per sviluppare e ottimizzare le future strategie di trattamento tra cui i farmaci immuno-oncologici.

Modelli animali

Modelli animali di cancro orale indotti da cancerogeni

La maggior parte dei SCC umani sono noti per essere indotti dall’esposizione cronica a cancerogeni. Inizialmente, gli approcci sperimentali per indurre chimicamente i tumori maligni orali hanno sempre fallito, perché la mucosa orale era più resistente all’azione delle sostanze chimiche rispetto alla pelle. Infine, utilizzando 9, 10 dimetil-1, 2, benzantracene (DMBA) HNSCC potrebbe essere indotto con successo nel sacchetto guancia criceto come modello animale. Assomigliando allo scenario nei pazienti, la carcinogenesi della mucosa si è verificata in quattro fasi successive: iperplasia, iperplasia atipica, carcinoma in situ e carcinoma a cellule squamose. Tuttavia, ci sono state difficoltà nel distinguere tra i cambiamenti dell’epitelio causati dal contatto diretto con l’agente cancerogeno rispetto alla vera trasformazione premaligna perché i cambiamenti erano transitori e reversibili nei tumori delle guance indotti da DMBA. Inoltre, i tumori indotti da DMBA non possedevano molte delle caratteristiche istologiche del HNSCC differenziato e non assomigliavano molto alle lesioni umane precoci. Ancora più importante, il tumore si è verificato nel sacchetto guancia criceto che rappresenta una zona immunodeficiente assente negli esseri umani, quindi questo modello non ha imitato HNSCC umano molto bene. Anche se DMBA è stato successivamente ampiamente impiegato in modelli di cancro orale del criceto e del ratto, si è dimostrato difficile indurre il carcinoma orale con DMBA nei topi. Il 4-Nitrochinolina 1-ossido (4-NQO), un derivato chinolone solubile in acqua, è stato quindi introdotto come potente induttore di tumori orali. La somministrazione di 4-NQO con acqua potabile o la sua applicazione topica ha provocato molteplici lesioni displastiche, preneoplastiche e neoplastiche dopo un trattamento a lungo termine in entrambi i modelli di topi e ratti, e queste lesioni assomigliavano molto alla trasformazione neoplastica della cavità orale umana. Dopo diverse modifiche, il modello è stato standardizzato da Tang et al. che hanno dimostrato che la somministrazione di 4-NQO nell’acqua potabile dei topi C57BL/6 per 16 settimane promuove la carcinogenesi del cavo orale ad alta incidenza.

Ricostruendo la sequenza di eventi e il tipo di lesioni osservate durante la carcinogenesi umana, i modelli animali indotti da carcinogeni sopra descritti forniscono un eccellente sistema in vivo per studiare gli eventi chiave della carcinogenesi orale. Questi modelli sono stati anche ampiamente utilizzati per lo sviluppo di strategie di chemioprevenzione del cancro, mentre pochi studi hanno approfittato di questi modelli animali per valutare l’efficacia dei farmaci per il trattamento dei tumori stabiliti. Una grande limitazione come piattaforma di screening dei farmaci è il tempo esteso necessario per completare la valutazione degli effetti di un composto di prova (Tabella 1). La maggior parte dei modelli animali di HNSCC indotti da carcinogeni richiede fino a 40 settimane per sviluppare carcinomi completi, e anche di più se le metastasi sono l’endpoint dello studio. In questo contesto, un recente rapporto di Wang e colleghi offre una potenziale scorciatoia utilizzando xenotrapianti di tumori della lingua indotti dalla linea cellulare 4NQO come un modello di topo syngeneic alternativo più conveniente.

Il principale vantaggio del modello animale indotto da 4NQO è la sua idoneità a studiare gli effetti dei fattori cancerogeni e genetici nella tumorigenesi soprattutto in un ambiente immunocompetente. Fornisce quindi una piattaforma adatta per accelerare lo sviluppo di regimi immunoterapeutici in HNSCC. Il modello è stato anche utilizzato con successo per studiare il ruolo delle cellule staminali tumorali putative nella resistenza al trattamento, nella recidiva e nelle metastasi. È stato stabilito il suo potenziale per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche rivolte non solo alla massa tumorale proliferativa, ma anche alla sottopopolazione relativamente quiescente di cellule staminali tumorali.

Modelli di topo ingegnerizzati geneticamente

Mentre i danni al DNA causati da sostanze chimiche avvengono in modo casuale, secondo la teoria dell’evoluzione tumorale l’acquisizione casuale di mutazioni nel genoma è seguita dalla selezione di cloni che ospitano cambiamenti genetici che facilitano la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule. Studi di profiling molecolare hanno identificato diversi geni driver putativi che contribuiscono allo sviluppo del cancro in HNSCC. Tuttavia, questi studi molecolari non hanno fornito prove dirette di causalità o una visione dettagliata dei meccanismi biologici attraverso i quali questi geni guidano lo sviluppo del tumore. Anche se i modelli animali indotti da carcinogeni possono ricapitolare da vicino il paesaggio eterogeneo delle alterazioni genomiche nei tumori primari umani, solo una frazione di queste mutazioni guida la tumorigenesi colpendo oncogeni o geni soppressori del tumore, ma molte mutazioni sono passeggeri senza un chiaro contributo allo sviluppo del tumore. Questi studi inoltre non rivelano se i driver sono essenziali per il mantenimento del tumore e possono quindi essere di uso limitato per la progettazione di strategie terapeutiche efficaci. Al contrario, i sistemi di modelli preclinici come i modelli di topo geneticamente modificati (GEMM) forniscono un approccio sperimentalmente trattabile in cui gli effetti biologici di mutazioni specifiche possono essere studiati in dettaglio in uno sfondo genetico controllato. Nei prossimi capitoli, descriviamo i risultati chiave di studi precedenti basati su GEMMs in HNSCC.

Pochi GEMMs associati alla formazione spontanea di HNSCC in assenza di esposizione cronica ai carcinogeni sono stati descritti finora (Tabella 2). Un modello murino geneticamente ingegnerizzato di cancro orale è stato introdotto per la prima volta da Schreiber e colleghi. Dopo aver incrociato topi transgenici per il gene v-Ha-ras con topi transgenici che ospitavano E6/E7 del papilloma virus umano (HPV)-16, è stato osservato lo sviluppo di tumori alla bocca, all’orecchio e all’occhio a partire da circa 3 mesi di età. A 6 mesi, il 100% degli animali bi-transgenici aveva sviluppato tumori orali, mentre la prevalenza in uno dei due gruppi monotransgenici era dello 0%. Il prerequisito di un secondo colpo genetico per la tumorigenesi è stato segnalato anche per un modello transgenico di K-rasG12D, in cui una ricombinasi Cre tamoxifen-inducibile sotto il controllo del promotore della cheratina-14 (K14) è stato utilizzato per il targeting del locus K-ras endogeno. Nel modello monotransgene, solo grandi papillomi nella cavità orale e iperplasie nella lingua sono stati osservati dopo 1 mese di trattamento con tamoxifene. Tuttavia, se i topi sono stati incrociati con topi floxed p53 conditional knockout, il 100% dei topi composti ha sviluppato carcinomi della lingua già 2 settimane dopo l’induzione del tamoxifene. Oltre all’espressione degli oncogeni virali E6/E7 e la perdita di TP53, la delezione omozigote del fattore di trascrizione krüppel-like-factor 4 (KLF4) e la delezione eterozigote di SMAD4 sono stati identificati come secondi successi genetici che in concerto con una mutazione oncogenica driver promuovono la formazione di tumori orali ad alta prevalenza (Tabella 2).

Nonostante la ricapitolazione della progressione dell’HNSCC, l’idoneità dei modelli HNSCC sopra descritti come piattaforma per esplorare nuovi approcci terapeutici molecolari mirati rimane in qualche modo discutibile, considerando che le alterazioni genetiche che guidano la tumorigenesi in questi animali sono assenti o solo raramente presenti nei pazienti HNSCC. Nel complesso, le mutazioni in HRAS e KRAS sono state rilevate solo in 6 e 0,2% dei pazienti HNSCC, e la delezione omozigote di KLF4 e SMAD4 in 0 e 4% dei casi, rispettivamente. Inoltre, i casi che ospitano uno dei genotipi composti a tendenza tumorale dei GEMM sopra descritti non sono stati identificati nella coorte HNSCC del The Cancer Genome Atlas (TCGA). Un GEMM di HNSCC spontaneo che assomiglia più da vicino alle caratteristiche molecolari della malattia umana potrebbe essere il modello singolo gene-knockout di SMAD4 negli epiteli di testa e collo (HN-Smad4del/del) riportato da Bornstein e colleghi. Infatti, sebbene la delezione omozigote sia rara, la perdita eterozigote di SMAD4 viene rilevata nel 30-35% degli HNSCC primari associata alla downregulation dei livelli di espressione di Smad4. Più recentemente, è stata riportata una significativa eterogeneità intratumorale della perdita SMAD4 nei tumori HNSCC primari. È interessante notare che nelle colture ex vivo derivate da PDX, la sottopopolazione cellulare che mostra la perdita SMAD4 eterozigote per delezione o espressione ridotta ha superato le cellule con genotipo SMAD4 wildtype dal tumore parentale, suggerendo un vantaggio di sopravvivenza delle cellule Smad4-deficienti. A ulteriore sostegno dell’idoneità di questo GEMM single-knockout, HNSCC da topi HN-Smad4del/del ha esibito una maggiore instabilità genomica, che si correla con l’espressione downregulated e la funzione dei geni che codificano le proteine nel percorso di riparazione del DNA Fanconi anemia/BRCA, anche legato alla suscettibilità HNSCC negli esseri umani. Inoltre, sia il tessuto normale della testa e del collo che l’HNSCC dai topi HN-Smad4del/del hanno esibito una grave infiammazione che è stata anche collegata alla patogenesi nell’uomo dove i batteri orali e i mediatori infiammatori associati alla malattia parodontale possono essere cofattori nell’inizio e nella promozione dell’SCC orale.

Dal rapporto originale del 2009, il modello HN-Smad4del/del è stato utilizzato per analizzare in dettaglio i processi molecolari coinvolti nella tumorigenesi HNSCC. A nostra conoscenza, non è stato ancora sfruttato per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Questa limitazione potrebbe essere spiegata da un tempo mediano di inizio di 40 settimane per lo sviluppo del tumore in questo modello, una limitazione simile ai modelli animali indotti da carcinogeni del cancro orale (Tabella 2). L’integrazione del trattamento cancerogeno per accelerare la formazione del tumore in GEMMs singolo-transgene potrebbe quindi rappresentare un modo appropriato per risolvere questa limitazione, come già dimostrato con successo in studi di GEMMs che portano una delezione in un gene soppressore del tumore (GRHL3 , PTEN ) o sovraespressione di microRNA oncogeni (Tabella 1).

Modelli xenografici derivati dai pazienti

Lo sviluppo e il miglioramento di ceppi di topi gravemente immunodeficienti ha notevolmente aumentato la disponibilità di modelli PDX per la ricerca sul cancro. L’istituzione con successo di modelli PDX HNSCC è stata riportata da diversi gruppi di ricerca. Nella nostra serie, è stato osservato un tasso di incisione complessivo del 48%, tuttavia, i tassi di incisione sembravano variare ampiamente tra i diversi sottogruppi di pazienti. I fattori limitanti per l’incisione non sono ancora stati chiaramente identificati. Il sito di impianto e i ceppi di topi sembrano influenzare il tasso di incisione. Inoltre, i fattori di rischio patologico come l’istologia del tumore e lo stato di HPV sono importanti determinanti per la formazione di PDX. In generale, i tumori indifferenziati HPV-negativi che mostrano una crescita aggressiva hanno maggiori probabilità di incidere. Di conseguenza, il tasso e la cinetica di incisione PDX sono stati associati a una prognosi sfavorevole dei pazienti. Contrariamente ai tumori HPV-negativi, i tumori HPV-associati HNSCC spesso non riescono a incidere. Poiché questi tumori crescono in siti immuno-associati come le tonsille o la base della lingua, il loro trapianto in topi immunodeficienti privi di controllo immunologico delle cellule viralmente infette comporta il rischio di co-trasferire cellule B positive al virus di Epstein-Barr (EBV). Di conseguenza, si verifica frequentemente una proliferazione incontrollata delle cellule B e la trasformazione in linfoma EBV+. Poiché il tasso di proliferazione di questi linfomi artificiali è molto più alto della proliferazione delle cellule tumorali nei frammenti di tessuto trapiantati di SCC, i trapianti del tumore originale sono frequentemente sovraccarichi. Pertanto, la convalida istopatologica dei PDX da parte di un patologo certificato è essenziale per confermare l’istologia del carcinoma a cellule squamose del modello.

La questione di quanto bene i PDX assomiglino al tumore primario del paziente è stata affrontata da molti gruppi. Come dimostrato per altre entità tumorali, i modelli HNSCC stabiliti nei topi mostrano caratteristiche istopatologiche come il tumore originale del paziente. L’analisi genetica completa dei tumori primari e dei modelli PDX derivati dal sequenziamento della prossima generazione ha rivelato modelli simili e frequenze alleliche di aberrazioni molecolari. La correlazione tra i profili mutazionali dei tumori originali e dei modelli derivati era significativamente più alta per i PDX (R = 0,94) rispetto alle linee cellulari (R = 0,51). L’analisi del metiloma ha anche mostrato un’alta concordanza tra PDX e tumori dei pazienti. Infatti, una media di solo il 2,7% dei siti CpG valutati ha subito importanti cambiamenti di metilazione a seguito del trapianto di tumori nei topi. Inoltre, gli studi di espressione genica hanno mostrato la parentela complessiva dei tumori parentali con i loro PDX, come confermato dal loro raggruppamento insieme nell’analisi di clustering gerarchico non supervisionato. In contrasto con la crescente evidenza per la corrispondenza dei profili del genoma e del trascrittoma tra PDX e HNSCC primari, solo pochi dati esistono per l’espressione proteica. Una prima analisi preliminare del tessuto PDX utilizzando reverse-phase protein array (RPPA) ha rivelato profili proteici paragonabili ai dati di espressione proteica TCGA HNSCC, suggestivi della somiglianza tra tessuto originale e modello derivato anche a questo livello.

Una caratteristica chiave di PDX è la conservazione di un compartimento stromale. Anche se lo stroma umano viene sostituito dallo stroma del topo entro i primi passaggi, rimane uno stroma integrato che rende possibile la valutazione dei composti che hanno come bersaglio questo compartimento o il crosstalk tra il compartimento stromale e le cellule tumorali. Inoltre, i tumori cresciuti nei topi costruiscono la propria vascolarizzazione tumorale che offre l’opportunità di valutare la rete angiogenica e l’interferenza con composti che mirano all’angiogenesi. Dopo la creazione del modello, i tumori cresciuti nei topi possono essere raccolti, congelati vitalmente e, se necessario, scongelati e ritrapiantati nei topi. Nel complesso, PDX può essere considerato un metodo adatto per l’espansione del tessuto tumorale e un promettente sistema di modello preclinico per studi meccanicistici e lo sviluppo di strategie terapeutiche.

Con il recente avvento dell’immunoterapia nell’algoritmo di trattamento di molti tipi di cancro tra cui HNSCC, la mancanza di un ambiente immunitario funzionale in PDX è diventato un grande ostacolo da superare. Sono state proposte diverse strategie per implementare un sistema immunitario in topi immunodeficienti. Nello studio di riferimento di Mosier e colleghi, è stato dimostrato che l’iniezione di cellule mononucleate periferiche umane (PBMC) ha portato alla ricostituzione stabile a lungo termine di un sistema immunitario umano funzionale in topi con grave immunodeficienza combinata (SCID). Così, i modelli PDX immunoproficienti potrebbero essere generati dal trasferimento delle PBMC del paziente nei topi portatori di PDX. Tuttavia, il corretto sviluppo delle cellule immunitarie e il priming delle cellule T mancano in questo approccio, con conseguente assenza di alcuni lignaggi di cellule immunitarie umane nei topi. Protocolli di ricostituzione immunitaria più sofisticati sviluppati successivamente sono basati sul trasferimento di cellule staminali CD34+ umane in topi NSG, così come l’impianto di timo fetale umano e tessuto epatico sotto la capsula renale di questi topi. Questo approccio ha portato all’incisione a lungo termine e alla ricostituzione sistemica di un sistema immunitario umano completo, comprese le cellule immunitarie umane multilineage costituite da T-, B-, NK-, cellule dendritiche e macrofagi. Purtroppo, questo metodo non è fattibile per un gran numero di PDX a causa della complessità del modello. Una procedura più promettente è stata proposta nel melanoma dove i linfociti T infiltranti il tumore (TILs) isolati dal tessuto tumorale usato per la generazione di PDX sono stati espansi in vitro con interleuchina 2 umana (IL2) prima dell’iniezione in topi PDX portatori di tumore.

Il potenziale dei modelli PDX per guidare il trattamento del paziente

Il valore dei PDX per guidare la decisione di trattamento del singolo paziente rimane da chiarire. In generale, le correlazioni da paziente a PDX in diverse entità tumorali, confrontando le risposte al trattamento tra topi e pazienti, sono state fatte usando dati retrospettivi sull’esito clinico. A nostra conoscenza, nessun confronto di questo tipo a dimensioni del campione sufficientemente grandi è stato eseguito in HNSCC. Gli ostacoli alla validità di tali approcci comprendono il dosaggio del farmaco nei topi, che di solito riflette la dose massima tollerata, la variabilità della dose nei diversi ceppi di topi e soprattutto la definizione di un endpoint clinicamente significativo. Nel contesto clinico, le risposte tumorali sono determinate da RECIST. Nei topi, un insieme molto eterogeneo di possibili endpoint è stato utilizzato per determinare l’efficacia dei trattamenti con un singolo farmaco, compresa la regressione tumorale espressa come inibizione relativa della crescita, il volume tumorale rispetto a un gruppo di controllo, l’inibizione della crescita tumorale e il tempo fino all’endpoint. Altre limitazioni generali del modello sono l’alto costo della creazione di PDX, i tassi di incisione variabili e i tempi dal primo trapianto ai risultati dello screening del trattamento. Finora, nella nostra grande collezione di quasi 80 modelli PDX HNSCC non siamo stati in grado di stabilire un valore predittivo delle risposte tumorali specifiche ai farmaci nel modello xenotrapianto. Tuttavia, diverse aziende pubblicizzano il PDX come strumento per prevedere la risposta al trattamento. Nel 2016, Champions Oncology ha lanciato uno studio di fattibilità (NCT02752932) per esplorare il valore predittivo del PDX. Purtroppo, nessun risultato è stato pubblicato fino ad ora.

Il principale svantaggio del PDX è il tempo prolungato necessario per la creazione e l’espansione del modello rispetto agli organoidi, rendendo meno probabile il loro uso futuro come piattaforma di screening di farmaci individuali nella routine clinica. Inoltre, la ricostituzione con componenti TME derivati dal paziente che mancano in entrambi i modelli generati da protocolli attuali dovrebbe essere raggiunto molto più facile in organoidi che in modelli di topo xenograft. Questo permetterà l’inclusione di terapie anticancro che interessano il TME (ad esempio everolimus, bevacizumab, anticorpi anti-PD-1/PD-1 L) in futuri approcci di screening ex vivo.