Gli antigeni leucocitari umani (HLA) sono molecole di superficie cellulare che si trovano su tutte le cellule nucleate. Ogni individuo ha un set unico di questi antigeni, ereditato per metà da ogni genitore, e la loro tipizzazione diventa importante prima del trapianto di organi. La tipizzazione è anche usata per identificare i marcatori di malattie specifiche, come l’HLA B27, che è noto per essere strettamente associato a condizioni come la spondilite anchilosante.
Sono riconosciute due classi principali di antigeni HLA: HLA classe I e HLA classe II. Gli antigeni HLA di classe I (A, B e C nell’uomo) rendono ogni cellula riconoscibile come “self”, mentre gli antigeni HLA di classe II (DR, DP e DQ nell’uomo) stimolano il sistema immunitario.1 Entrambi sono stati implicati nel rigetto di organi trapiantati.
Tre processi principali sono utilizzati per eseguire la tipizzazione HLA. Il primo è il più convenzionale metodo di citotossicità sierologica in cui piccoli campioni di linfociti (prelevati dal sangue o dalla milza) vengono aggiunti alle piastre Terasaki. Queste piastre contengono pozzetti individuali che contengono diversi anticorpi specifici (da sieri materni o anticorpi monoclonali prodotti). Le cellule migliori per la tipizzazione di classe II sono i linfociti B, e la tipizzazione di classe I può essere eseguita con i leucociti rimanenti. Per purificare le cellule necessarie dal sangue o dalla milza si usano perline magnetiche.
Se l’antigene HLA e l’anticorpo specifico si legano e si aggiunge il complemento, le cellule in quel pozzetto vengono uccise. Lo schema dei pozzetti che mostrano questa morte cellulare permette di dedurre quale combinazione di antigeni HLA erano presenti sulle cellule del tessuto originale.
Un altro potenziale metodo usato per la tipizzazione HLA è la citometria a flusso, in particolare quando si cercano alleli specifici. Qui i leucociti freschi nucleati vengono aggiunti ad anticorpi monoclonali che sono etichettati con una molecola che diventa fluorescente. Le cellule con antigeni di superficie che si legano all’anticorpo diventano fluorescenti. Il citometro a flusso rileva le cellule fluorescenti rilevando la luce emessa da esse mentre passano attraverso un raggio laser. La citometria a flusso richiede circa 30 minuti per essere completata – il tempo necessario per preparare le cellule e poi far funzionare la macchina.
Un terzo processo sta guadagnando favore dove è richiesta una tipizzazione molto dettagliata – per esempio, per una corrispondenza precisa nel trapianto di midollo osseo. Questo processo comporta l’estrazione del DNA dalle cellule e l’amplificazione dei geni che codificano per i peptidi HLA usando tecniche di reazione a catena della polimerasi. I geni possono essere abbinati a sequenze nucleotidiche HLA note che si trovano memorizzate in diversi database di banche genetiche, tra cui il database IMGT/HLA.