Alai

Abstract

La sepsi è la risposta sistemica all’infezione da organismi microbici. Una diagnosi differenziale di infezione causata da batteri o da altri organismi microbici è essenziale per un trattamento efficace e una valutazione prognostica. Gli attuali metodi di laboratorio clinico nella diagnosi delle infezioni batteriche sono aspecifici o richiedono tempi di risposta più lunghi. La procalcitonina (PCT) è un biomarcatore che presenta una maggiore specificità rispetto ad altri marcatori proinfiammatori (es. citochine) nell’identificare i pazienti con sepsi e può essere utilizzato nella diagnosi delle infezioni batteriche. In questo articolo, passiamo in rassegna le conoscenze attuali della PCT e il suo utilizzo nel laboratorio clinico.

Identificare se la causa dell’infiammazione nei pazienti è di origine batterica è stata un’importante area di sviluppo nel laboratorio clinico. Diversi test di laboratorio clinico sono stati applicati alla diagnosi di sepsi.1 Il metodo della coltura in brodo è il gold standard per la diagnosi di infezione batterica, ma un risultato definitivo può richiedere 24 ore o più prima di una diagnosi definitiva. Un certo numero di marcatori infiammatori, come la conta delle cellule leucocitarie, la proteina C reattiva (CRP) e le citochine (TNF-α, IL-1β o IL-6), sono stati applicati nella diagnosi di infiammazione e infezione, ma la loro mancanza di specificità ha generato un interesse continuo per sviluppare test clinici di laboratorio più specifici.2 Un marcatore promettente è la procalcitonina (PCT), la cui concentrazione è stata trovata elevata nella sepsi. Grazie alla sua specificità per le infezioni batteriche, la PCT è stata proposta come un marcatore pertinente nella diagnosi rapida delle infezioni batteriche, specialmente per l’uso nei reparti di emergenza ospedaliera e nelle unità di terapia intensiva. Dalla sua identificazione e associazione con la sepsi negli anni ’90, è stato condotto un gran numero di studi sulla PCT e sulla sua applicazione clinica. Un test per determinare i livelli di PCT è disponibile in Europa da diversi anni e recentemente è stato approvato dalla FDA per l’uso negli Stati Uniti.3

Biochimica della PCT

La procalcitonina è un peptide di 116 aminoacidi che ha un MW approssimativo di 14,5 kDa e appartiene alla superfamiglia dei peptidi della calcitonina (CT). Può essere diviso in 3 sezioni, tra cui il terminale amminico della regione PCT, la calcitonina immatura e il peptide 1 del carbossiltermine della calcitonina (CCP-1, chiamato anche katacalcin) (Figura 1).4 La procalcitonina è codificata dal gene CALC-1 situato sul cromosoma 11. La scissione in 1 sito della trascrizione primaria del gene CALC-1 produce la pre-PCT, che subisce un’ulteriore scissione proteolitica della sua sequenza di segnale per produrre la PCT.5,6 Gli altri membri della superfamiglia dei peptidi CT comprendono il peptide legato al gene della calcitonina I, II (CGRP-I, CGRP-II), l’amilina e l’adrenomedullina. Il peptide legato al gene della calcitonina I è anche codificato dal gene CALC-1 ed è generato dallo splicing alternativo del trascritto primario dell’mRNA CALC-1. Il peptide II legato al gene della calcitonina, l’amilina e l’adrenomedullina sono codificati da altri geni (Tabella 1).

L’espressione della calcitonina avviene in modo tessuto-specifico. In assenza di infezione, la trascrizione del gene CALC-1 per la PCT nel tessuto non neuroendocrino è soppressa, tranne che nelle cellule C della tiroide dove la sua espressione produce PCT, il precursore della CT negli individui sani e non infetti.5 La PCT sintetizzata subisce poi un’elaborazione post-traslazionale per produrre piccoli peptidi e la CT matura, che viene generata in seguito alla rimozione della glicina C-terminale dalla CT immatura da parte della peptidilglicina α-amidante monoossigenasi (PAM).7 La CT matura viene immagazzinata nei granuli del segretario e viene secreta nel sangue per regolare la concentrazione di calcio. In presenza di un’infezione microbica, anche i tessuti non neuroendocrini esprimono il gene CALC-1 per produrre PCT. Un’infezione microbica induce un aumento sostanziale dell’espressione del gene CALC-1 in tutti i tessuti parenchimali e nei tipi di cellule differenziate del corpo che producono PCT.8 I suoi livelli aumentano significativamente nelle infezioni sistemiche gravi, rispetto ad altri parametri delle infezioni microbiche.9 La funzione della PCT sintetizzata nei tessuti non neuroendocrini in caso di infezione microbica non è attualmente chiara; tuttavia, la sua rilevazione ha aiutato nella diagnosi differenziale dei processi infiammatori.

Panoramica della sepsi

La sepsi si riferisce alla risposta sistemica all’infezione da agenti microbici, come batteri, funghi e lieviti, dove il paziente sviluppa tipicamente febbre, tachicardia, tachipnea e leucocitosi. Le colture microbiologiche dal sangue o dal sito di infezione sono spesso, anche se non invariabilmente, positive. La sepsi grave è associata all’ipoperfusione o alla disfunzione di almeno 1 organo. Quando la sepsi grave è accompagnata da ipotensione o da insufficienza di più organi, la condizione è nota come shock settico. Gli studi epidemiologici indicano un’incidenza di circa 750.000 casi di sepsi all’anno negli Stati Uniti.10 I segni e i sintomi della sepsi sono molto variabili e sono influenzati da molti fattori, tra cui la virulenza e il carico biologico dell’agente patogeno, il portale di ingresso e la suscettibilità dell’ospite. Le sedi principali sono le infezioni del tratto respiratorio, seguite dalle infezioni genitourinarie e gastrointestinali.11 Recentemente c’è stato un numero crescente di rapporti sulle infezioni batteriche dei pazienti ospedalizzati a causa dell’aumento delle infezioni nosocomiali da cateterismo e terapie immunosoppressive, oltre all’aumento delle cause di Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA).11 Distinguere l’infiammazione dovuta a infezioni batteriche, altre infezioni microbiche o al rigetto degli organi è importante nel trattamento della reazione immunitaria nei pazienti ospedalizzati. Un problema comune nella pratica clinica è che i segni e i sintomi delle infezioni batteriche e virali sono ampiamente sovrapponibili, specialmente nelle infezioni del tratto respiratorio. Occasionalmente l’incertezza diagnostica rimane ancora, anche dopo aver ottenuto un’anamnesi del paziente, eseguito un esame fisico, un esame radiografico del torace e test di laboratorio. Quindi, un test di laboratorio con più specificità migliorerebbe significativamente la diagnosi differenziale clinica in questi casi. Inoltre, la diagnosi differenziale di infezione aiuterebbe a decidere se il trattamento con antibiotici sarebbe utile. A questo proposito, circa il 75% di tutte le dosi di antibiotici sono prescritte per le infezioni respiratorie acute che hanno un’eziologia prevalentemente virale.5 L’uso eccessivo di antibiotici è la causa principale della diffusione di batteri resistenti agli antibiotici. Pertanto, diminuire l’uso di antibiotici è essenziale per combattere l’aumento dei microrganismi resistenti agli antibiotici.

Metodi diagnostici per la sepsi

Il metodo tradizionale di diagnosi per la sepsi include la coltura di campioni di sangue, urina, liquido cerebrospinale (CSF), o fluido bronchiale e di solito richiede dalle 24 alle 48 ore. Purtroppo, i sintomi clinici si manifestano spesso in assenza di una coltura positiva. I segni clinici tradizionali dell’infezione e i test di laboratorio di routine per la sepsi, come la CRP o la conta dei leucociti, mancano di accuratezza diagnostica e a volte sono fuorvianti. Nelle infezioni gravi, la maggior parte delle citochine pro-infiammatorie classiche, come TNF-α, IL-1β o IL-6, sono aumentate solo brevemente o in modo intermittente, se non del tutto. Alla luce dei suddetti dilemmi diagnostici e terapeutici, un test più inequivocabile per la diagnosi differenziale di infezioni e sepsi è di fondamentale importanza.

Misurazione della PCT nella diagnosi delle infezioni batteriche

Dalla metà degli anni 90, c’è stato un uso crescente delle misurazioni della PCT nell’identificazione delle infezioni batteriche sistemiche.3 La breve emivita (25-30 ore nel plasma) della PCT, unita alla sua virtuale assenza di salute e specificità per le infezioni batteriche, le conferisce un chiaro vantaggio rispetto agli altri marcatori di infezione batterica.3,4 Gli studi hanno anche dimostrato che un aumento dei livelli di PCT è minimo nelle infezioni virali, mentre i livelli aumentano rapidamente dopo una singola iniezione di endotossina.12,13 Inoltre, gli aumenti di PCT non sono associati a specifici ceppi batterici, anche se in uno studio di Rowther e colleghi, sono stati identificati ed elencati i ceppi di pazienti settici con livelli sierici di PCT >2 ng/mL.14 Recentemente, Jacquot e colleghi hanno dimostrato che la misurazione rapida della PCT potrebbe aiutare a escludere un’infezione nosocomiale nei neonati ricoverati in unità di terapia intensiva.15

In un altro studio, de Jager e colleghi hanno esaminato il valore della misurazione dei livelli di PCT nel sangue di pazienti infettati da una polmonite acquisita in comunità (CAP) causata da Legionella pneumophila rispetto ad altri parametri convenzionali come la CRP e la conta dei globuli bianchi.16 Hanno scoperto che i livelli iniziali elevati di PCT erano indicativi di una malattia più grave, e questo si rifletteva in una permanenza più lunga del paziente nell’unità di terapia intensiva (ICU) e/o in una morte in ospedale. Inoltre, livelli persistentemente elevati di PCT erano sempre indicativi di un esito sfavorevole. Quindi, la determinazione dei livelli di PCT ha fornito informazioni preziose sulla prognosi del paziente che non potevano essere determinate da parametri infiammatori convenzionali come la CRP e la conta dei WBC. Inoltre, l’uso delle misurazioni PCT per trattare efficacemente i pazienti con antibiotici ha dimostrato di ridurre la degenza ospedaliera del paziente. Kristoffersen e colleghi hanno riferito che nei pazienti con malattia polmonare ostruttiva cronica, una singola determinazione della PCT nel siero al momento del ricovero ha ridotto la durata media della degenza da 7,1 giorni a 4,8 giorni.17

Misurazione della PCT

La procalcitonina può essere misurata utilizzando un test quantitativo omogeneo (BRAHMS, Hennigsdorf, Germania). Il test si basa sulla tecnologia TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) (Figura 2). Un laser ad azoto a 337 nm è diretto verso un campione contenente PCT e 2 anticorpi marcati con fluorescenza che riconoscono diversi epitopi del peptide PCT. Il principio del test si basa sul trasferimento di energia non radiativa tra le molecole “donatore” e “accettore”. La molecola donatrice, dopo l’eccitazione, emette un segnale fluorescente a lunga durata nell’intervallo di milli-secondi a 620 nm, mentre la molecola accettore dopo l’eccitazione emette un segnale a breve durata nell’intervallo di nano-secondi a 665 nm. Quando entrambe le molecole sono portate in stretta vicinanza dal legame con PCT, il segnale risultante è amplificato a 665 nm e prolungato per durare alcuni microsecondi. Questo prolungamento assicura che il segnale possa essere misurato dopo che la fluorescenza di fondo (comune nei campioni biologici) è decaduta. Nel saggio BRAHMS’, la molecola donatrice è un anticorpo policlonale di pecora marcato con Europio Criptato che riconosce gli epitopi nella regione della CT immatura, mentre la molecola accettore è un anticorpo monoclonale marcato con XL665 cresciuto contro la regione CCP-1 della PCT.18,19

I campioni adatti al test possono essere siero o plasma usando EDTA o eparina come anticoagulanti, ma non citrato, poiché è stato dimostrato che questo sottostima i livelli di PCT.18

Misurazioni della PCT in altre malattie

L’utilità della PCT come marker diagnostico in altri stati infiammatori è stata valutata e rivista da Becker e collaboratori.20 Nella malaria, i livelli di PCT sono elevati sia nella malaria grave che in quella non complicata da Plasmodium falciparum, ma non possono essere utilizzati per differenziare i due tipi e sono quindi di utilità limitata nella diagnosi.21,22 Anche il valore della PCT nella diagnosi della tubercolosi polmonare (PTB) è stato studiato e ha dimostrato di avere poco valore.19 Baylan e collaboratori hanno scoperto che i livelli sierici di PCT erano leggermente alti all’ammissione nei pazienti con PTB attiva rispetto ai controlli e ai pazienti in chemioterapia antitubercolare. Sebbene questa differenza fosse statisticamente significativa, i livelli di PCT della maggior parte dei casi con PTB (58,7%) erano inferiori al livello di cut-off usuale (0,5 ng/mL).23 Quindi, la PCT non era un indicatore affidabile nella diagnosi di PTB attiva e non poteva essere sostituita da dati microbiologici, epidemiologici, clinici e radiologici.23 Nyamande e Lalloo, tuttavia, hanno scoperto che i livelli di PCT potrebbero essere utili per distinguere la polmonite acquisita in comunità (CAP) dovuta a batteri comuni, come il Mycobacterium tuberculosis (TB) e lo Pneumocystis jirovecii (PJP) in un contesto ad alta prevalenza di HIV, dove le presentazioni atipiche spesso confondevano la diagnosi clinica empirica.24 Il loro studio ha dimostrato che i livelli di PCT differiscono significativamente nei pazienti con CAP dovuta a TB, PJP e batteri.

Le determinazioni della procalcitonina hanno trovato un valore considerevole nell’identificare se l’infiammazione successiva a un trapianto d’organo è dovuta a un’infezione batterica o al rigetto dell’organo. Mendonca e colleghi hanno dimostrato che nei riceventi di un trapianto di fegato, i livelli plasmatici di PCT erano significativamente aumentati nei pazienti infetti rispetto a quelli con rigetto epatico acuto, nei quali i livelli erano simili a quelli dei pazienti non complicati.25 Madershahian e colleghi hanno dimostrato che i livelli di PCT dopo un trapianto di cuore potrebbero servire come un utile marker di prognosi.26 I livelli di procalcitonina sono risultati costantemente bassi (<10 ng/mL) nei pazienti con un decorso non complicato dopo il trapianto, ma più frequentemente aumentati nei pazienti con complicazioni postoperatorie e persino associati a un aumento della mortalità nel primo periodo postoperatorio quando i valori superano 80 ng/mL. Quindi, i livelli di PCT nei primi giorni dopo il trapianto cardiaco potrebbero aiutare a identificare i pazienti a rischio di complicazioni, quando le concentrazioni superano il range “normale” post-trapianto.26

Pitfalls in PCT Measurement

Ci sono anche rapporti in letteratura dove gli aumenti dei livelli di PCT non erano collegati a infezioni batteriche. La crisi addisoniana causata da insufficienza surrenale è stata associata a livelli elevati di PCT.27 L’aumento dei livelli di PCT, paragonabile a quello osservato nella sepsi grave, è stato osservato anche in pazienti trapiantati sottoposti a terapia con anticorpi Pan T-cellulari.28 Più recentemente, Brodska e colleghi hanno riportato marcati aumenti dei livelli di PCT e CRP in pazienti programmati per il trapianto di cellule staminali ematopoietiche e che ricevevano globulina anti-timociti durante il condizionamento.29

Sommario

Negli ultimi 15 anni, l’uso della PCT per identificare l’origine batterica o non batterica dell’infiammazione sistemica ha ottenuto un ampio sostegno ed è probabile che questa tendenza continui. Sebbene la PCT abbia dimostrato di essere un interessante marcatore di sepsi, il suo ruolo fisiologico rimane ancora incerto. Ci sono prove che suggeriscono che l’uso della PCT nel monitoraggio dei pazienti con sepsi porta a una riduzione della morbilità e della mortalità di questi pazienti. La somministrazione di PCT a criceti settici ha aumentato il loro tasso di mortalità, mentre la somministrazione di anticorpi anti-PCT ha aumentato il loro tasso di sopravvivenza.30 La quasi assenza di espressione di PCT nello stato di salute e la sua espressione praticamente in ogni organo durante la sepsi alimenta la nozione che sia intrinsecamente associata al caratteristico “arresto d’organo” della sepsi grave. Ulteriori ricerche volte a chiarire il ruolo della PCT nella sepsi aiuterebbero a comprendere la patogenesi della sepsi con l’obiettivo di sviluppare regimi terapeutici migliori e più efficaci.

Gli autori desiderano ringraziare Chris Ciotti, Stephen Barnes e Jim Bromley (BRAHMS USA) per le utili discussioni sugli aspetti tecnici e clinici del test PCT.