Alai

RTT fibroblasts show a defective autophagy activation under starving conditions

In order to verify the hypothesis regarding a defective autophagy in RTT patients, abbiamo analizzato l’attivazione dell’autofagia in condizioni di fame in fibroblasti primari della pelle isolati da pazienti RTT (n = 4) e soggetti sani (n = 4)17,19.

Abbiamo innanzitutto definito la vitalità nel tempo dei fibroblasti sani e di quelli con RTT coltivati in un mezzo di inedia mediante i test di esclusione MTT e Trypan blue. Rispetto alla vitalità dei fibroblasti RTT coltivati in terreno standard, la vitalità dei fibroblasti RTT è diminuita dopo 4 ore di inedia (20 ± 3,3% di cellule morenti, p < 0,05); questa percentuale è aumentata notevolmente dopo 6-8 ore di inedia (60 ± 5,1% di cellule morenti, p < 0,05) (Fig. 1a). Al contrario, i fibroblasti sani erano ancora completamente vitali dopo 4 ore di inedia con solo una riduzione molto bassa della vitalità dopo 6-8 ore (10 ± 1,2% di cellule morenti, p < 0,01) rispetto alla vitalità dei fibroblasti cresciuti in terreno standard (Fig. 1a). Così, come da un confronto diretto della vitalità delle due linee cellulari ad ogni time-point, è venuto fuori che la vitalità dei fibroblasti RTT è stata gravemente compromessa a partire dal tempo 4 h (vedi dettagli nella figura legenda, p < 0,05). Inoltre, un’analisi Western blotting (WB) ha evidenziato che nei fibroblasti RTT che erano stati affamati per 4 h, una banda corrispondente al frammento p25 della polimerasi-1 (PARP) è stata notevolmente aumentata (96 ± 4%, p < 0,001) rispetto alla debole rilevazione al tempo 0. Questo frammento viene rilasciato dalla degradazione caspasi-dipendente della proteina durante la fase iniziale di induzione dell’apoptosi (Fig. 1b)35 . Il frammento p25 era quasi non rilevabile nei fibroblasti sani nelle stesse condizioni sperimentali.

Questi dati hanno confermato che i fibroblasti RTT non hanno tollerato la crescita in un mezzo di inedia, e rapidamente subirono l’apoptosi. Pertanto, abbiamo ulteriormente studiato il flusso autofagico monitorando la clearance del marker LC3B-II in presenza e in assenza di un inibitore del lisosoma, come la clorochina (CQ)24,25,26,27,28,29,30.

Dopo aver escluso un effetto citotossico legato alla CQ (Fig. S1 supplementare), i fibroblasti sani e RTT sono stati coltivati in mezzi di riposo o di inedia per 2 ore in presenza o assenza di 20 µM di CQ per quantificare il rapporto LC3B-II/GAPDH tramite WB (Fig. 2a). L’andamento del rapporto LC3B-II/GAPDH (o qualsiasi altro controllo interno non modulato dall’autofagia) in condizioni di attivazione dell’autofagia e in presenza e in assenza di CQ (o qualsiasi altro inibitore lisosomiale) è considerato una valida strategia per monitorare il flusso dell’autofagia.

In fibroblasti sani, coltivati in terreno standard, LC3B-I era chiaramente immuno-detected, mentre LC3B-II era debole. Il rapporto LC3BII/GAPDH dei fibroblasti sani coltivati in terreno standard in assenza e in presenza di CQ era comparabile (Fig. 2a, pannello sinistro). Questa osservazione suggerisce che l’autofagia basale era quasi impercettibile nei fibroblasti sani (Fig. 2a, pannello sinistro).

Quando queste cellule sono state coltivate nel mezzo di inedia e in assenza di CQ per 2 ore, il rapporto LC3B-II/GAPDH è aumentato (60 ± 4.8%, p < 0,05) rispetto a quello dei fibroblasti sani coltivati in terreno standard sia in assenza che in presenza di CQ (che era, come già detto, identico) (Fig. 2a, pannello sinistro e destro). Questo comportamento, infatti, indica che LC3-I ha effettivamente subito una lipidazione per formare LC3B-II, che è un marker precoce di attivazione dell’autofagia24,25,26,27,28,29,30. Per verificare la presenza di questa attivazione dell’autofagia, abbiamo coltivato le cellule in un mezzo di inedia in presenza di CQ per 2 ore e hanno mostrato un ulteriore aumento del rapporto LC3B-II/GAPDH (94 ± 5,5%, p < 0,001) rispetto ai fibroblasti sani coltivati in mezzo standard (Fig. 2a, pannello sinistro e destro).

Inoltre, la differenza tra il rapporto LC3B-II/GAPDH dei fibroblasti sani coltivati in terreno di inedia in assenza e in presenza di CQ era statisticamente significativa (p < 0,05, Fig. 2a, pannello sinistro)

Quindi, secondo l’interpretazione standard del pattern LC3B-II mediante analisi WB, il risultato complessivo indica che, in assenza di nutrienti, i fibroblasti sani stimolano la formazione di autofagosomi che vanno incontro ad accumulo in presenza di CQ. Questo comportamento è compatibile con un normale flusso autofagico24,25,26,27,28,29,30. È interessante notare che nel caso dei fibroblasti RTT coltivati in terreno standard, mentre LC3B-I è stato chiaramente immuno-rilevato, LC3B-II era molto debole nelle cellule sia in assenza che in presenza di CQ (Fig. 2a, pannello sinistro). In condizioni di fame e in assenza di CQ, la comparsa di una debole banda corrispondente a LC3B-II nei fibroblasti RTT solo dopo una lunga esposizione del filtro ha suggerito che almeno una lipidazione minima di LC3B-I si è verificato (Fig. 2a, pannello sinistro). Quindi, il rapporto LC3B-II/GAPDH tra i fibroblasti RTT cresciuti in mezzo di inedia in assenza di CQ era aumentato (93 ± 5,5%, p < 0,001) rispetto a quello dei fibroblasti RTT cresciuti in mezzo standard in assenza di CQ (Fig. 2a, pannello destro).

Tuttavia, la somministrazione di CQ ai fibroblasti RTT cresciuti in mezzo di inedia non ha aumentato ulteriormente il rapporto LC3B-II/GAPDH che era aumentato (95 ± 3,5%, p < 0,001) rispetto alle cellule cresciute in mezzo standard in assenza di CQ, ma non era significativamente aumentato rispetto al rapporto LC3B-II/GAPDH dei fibroblasti RTT coltivati in mezzo di inedia in assenza di CQ (Fig. 2a, pannello sinistro). Questo risultato ha suggerito che nessun accumulo di autofagosomi si verifica nelle cellule RTT e l’analisi WB ha sostenuto un blocco, ad un certo livello, del flusso di autofagia24,25,26,27,28,29,30,31.

Per rafforzare ulteriormente la nostra ipotesi riguardante un possibile flusso autofagico difettoso, abbiamo verificato la degradazione di due substrati reporter di autofagia riconosciuti in fibroblasti sani e RTT affamati per 2 e 4 ore in assenza di CQ, cioè: (i) la proteina p62/SQSMT1, che assiste l’eliminazione degli aggregati proteici poli-ubiquitinati e viene degradata dalle idrolasi lisosomiali36; (ii) il proteasoma 20 S, che viene rapidamente degradato in condizioni di fame37,38. Rispetto al livello basale delle due proteine (cioè il tempo 0), una diminuzione nel tempo del rapporto p62/tubulina (44 ± 10% dopo 4 h, p < 0,001) e del rapporto PSMA-3/GAPDH (cioè la subunità α7 del proteasoma 20 S) (45 ± 3,1% dopo 2 h, 11 ± 5,2% dopo 4 h, in entrambi i casi p < 0,001) è stato osservato in fibroblasti sani (Fig. 2b, pannello superiore).

Nel caso dei fibroblasti RTT, la diminuzione del rapporto p62/tubulina nel tempo non era statisticamente significativa anche dopo 4 h (89 ± 9%), mentre la diminuzione del rapporto PSMA3/GAPDH a 2 h (81 ± 4,4%, p < 0,05) e 4 h (78 ± 5,1%, p < 0,05) era significativamente diversa rispetto al livello basale della proteina (cioè il tempo 0) (Fig. 2b, pannello inferiore). Tuttavia, le differenze tra i gruppi sani e RTT erano statisticamente significative nel caso del rapporto p62/tubulina solo a 4 ore (p < 0,05), mentre il rapporto PSMA3/GAPDH era significativamente diverso tra i gruppi sperimentali sia a 2 ore (p < 0.05) e 4 h (p < 0,001) (Fig. 2b, pannello inferiore).

Interessante, i modelli di β-tubulina e GAPDH, utilizzati come controlli interni per la colorazione p62 e la colorazione PSMA3, rispettivamente, erano inalterati su 4 h di fame nei fibroblasti sani. Tuttavia, l’intensità della banda β-tubulina, così come quella della banda GAPDH, è diminuita significativamente nei fibroblasti RTT affamati per 4 ore rispetto a quanto osservato al tempo 0 o al tempo 2 ore per queste cellule (Fig. 2b, pannello superiore). Questa riduzione era probabilmente dovuta al minor numero di fibroblasti RTT vivi raccolti in questo momento (in accordo con la scarsa vitalità dei fibroblasti RTT a 4 ore di inedia riportati in Fig. 1a) e non a causa di una down-regolazione della β-tubulina nel tempo. Nel complesso, è stato riscontrato che i fibroblasti RTT non hanno degradato in modo efficiente questi substrati autofagia reporter, sostenendo l’ipotesi di un’autofagia difettosa.

Per fare ulteriore luce sulle caratteristiche di questo blocco, abbiamo eseguito un’analisi di immuno-fluorescenza utilizzando l’anticorpo LC3B. Abbiamo analizzato fibroblasti sani e RTT coltivati in terreno standard in assenza di CQ (condizione di riposo) e nel terreno di inedia per 2 ore in presenza o assenza di 20 µM CQ (Fig. 2c). Coerentemente con il lento tasso metabolico delle cellule primarie, abbiamo trovato che i fibroblasti sani a riposo e RTT hanno mostrato una debole e diffusa colorazione LC3B+ con una bassa percentuale di cellule che mostrano più di 10 punti (cioè autofagosomi) (8 ± 5% e 1 ± 0,5%, rispettivamente) indicando che, con l’immuno-fluorescenza, l’autofagia basale era poco rilevabile in accordo con i dati riportati in Fig. 2a.

Rispetto alle cellule cresciute in terreno standard, la percentuale di fibroblasti sani cresciuti in terreno di inedia (in assenza di CQ) che mostravano almeno 10 autofagosomi LC3B+ era marcatamente aumentata (82 ± 10%, p < 0,005), mentre i fibroblasti RTT cresciuti in terreno di inedia mostravano un leggero aumento (17 ± 8%, p < 0,001). Infatti la percentuale di fibroblasti sani cresciuti in mezzo di inedia che mostravano almeno 10 autofagosomi era significativamente più alta di quella dei fibroblasti RTT cresciuti nelle stesse condizioni sperimentali (p < 0,005). Gli autofagosomi erano principalmente localizzati nella regione perinucleare. In presenza di CQ un’attesa colorazione diffusa e intensa LC3B+ è stata ulteriormente osservata, anche se in questo caso, la colorazione diffusa non ha permesso di quantificare con precisione il numero di punti.

La somministrazione di CQ era inefficace nei fibroblasti RTT, indicando chiaramente una biogenesi dell’autofagosoma gravemente compromessa (Fig. 2c).

Data la rilevanza della putativa compromissione della biogenesi dell’autofagosoma, è stato adottato un ulteriore approccio per confermare questa osservazione. Sia i fibroblasti sani che quelli RTT, affamati per 2 ore in assenza di CQ, sono stati colorati con un colorante specifico (Cyto-ID) per la membrana autofagosomica e analizzati in immunofluorescenza. Anche in questo caso, mentre nei fibroblasti sani sono stati effettivamente rilevati diversi autofagosomi, nei fibroblasti RTT è stato osservato solo un numero limitato di vescicole piccole e isolate (Fig. supplementare S2). La differenza nella percentuale di cellule che mostravano almeno 5 punti positivi Cyto-ID tra i fibroblasti sani e RTT era marcatamente significativa (80 ± 4% vs 8 ± 6%, rispettivamente, p < 0,001). Pertanto, l’analisi complessiva ha fornito la prova che una biogenesi difettosa dell’autofagosoma si verifica nei fibroblasti primari RTT.

Le RBC mature di pazienti RTT portatori della mutazione R255X MeCP2 conservano i mitocondri

Allora abbiamo cercato di determinare se ulteriori segni di autofagia difettosa potevano essere osservati ex vivo nei pazienti RTT. Dato che la clearance dei mitocondri è un classico meccanismo basato sull’autofagia che si verifica nei reticolociti circolanti nella fase finale della maturazione in RBCs32,33,34 abbiamo esteso la nostra indagine anche alle RBCs umane ex vivo per verificare se i mitocondri sono trattenuti in queste cellule.

Quindi, le RBCs da pazienti RTT (n = 15) e da donatori sani (n = 11) sono state analizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). L’indagine TEM ha evidenziato la presenza di strutture simili ai mitocondri (SRM) nelle RBC di forma bi-concava isolate dalla maggior parte dei pazienti RTT (11 su 15). Tra questi 11 pazienti RTT, tre di loro hanno mostrato la coorte più grave di sintomi e anche un’alta frequenza di RBCs (20 ± 4%) (Fig. 3a-h). Come previsto, SRM non erano rilevabili in RBC sani (Fig. 3I). Le differenze tra i soggetti sani e RTT erano statisticamente significativi (p < 0.0004; Fig. 3, pannello inferiore).

Nonostante, la gravità dei sintomi è stata basata sulla valutazione clinica e, di conseguenza, quei tre pazienti con il più grave dei sintomi tutti portavano la mutazione R255X del gene MeCP2 che è associato ad una prognosi grave39.

Come conseguenza e in considerazione del fatto che non avevamo la possibilità di arruolare un numero maggiore di soggetti portatori di altre mutazioni con una frequenza bassa o nulla di RBC contenenti mitocondri, abbiamo concentrato la nostra attenzione sull’analisi di questi tre pazienti. L’analisi TEM ha documentato, in questi tre casi, la presenza di strutture che assomigliano a mitocondri intatti o parzialmente digeriti (elettron-densi o lucenti), che erano di forma normale o a manubrio (allungato), e generalmente piccoli con deboli cristae (Fig. 3a-h). Infatti, la dimensione e la forma complessiva di queste strutture sono stati trovati per essere coerente con quelli di mitocondri trattenuti in RBC maturi in non-RTT modelli murini di macroautofagia difettoso (cioè, il Ulk1-/- topi) o mitofagia (cioè il Nix-/- topi) riportati da altri autori 32,33. È interessante notare che le alterazioni morfologiche dei mitocondri che abbiamo osservato, come la dimensione ridotta, la struttura allungata (cioè a forma di manubrio) e, in particolare, la presenza di deboli cristae sono già state descritte nel muscolo e nel cervelletto di pazienti RTT20,21. Per confermare l’identità mitocondriale della SRM, abbiamo colorato i RBC di donatori sani e di questi pazienti RTT con sintomi gravi con un anticorpo anti-COX-IV (citocromo c ossidasi). Un numero statisticamente significativo di RBC dai tre pazienti RTT rispetto alle RBC di soggetti sani (35 ± 5% vs 0.2 ± 0.01%, rispettivamente, p < 0.005) ha mostrato un modello punteggiato COX-IV+ che ha suggerito la ritenzione dei mitocondri (Fig. 4). Il contenuto medio di mitocondri per cellula è stato calcolato come 1,2 ± 0,2 organelli per RBC in pazienti RTT e 0,002 ± 0,0002 in soggetti sani (p < 0,005) (Fig. 4). Le differenze nella percentuale di RBCs che mostrano mitocondri tra TEM e le indagini IF possono essere messi a causa del fatto che la possibilità di rilevare gli organelli da TEM è strettamente dipendente dalla sezione sottile della cellula, che può ostacolare la loro presenza, mentre l’approccio IF non è limitato in questo modo.

Per confermare ulteriormente questi risultati, abbiamo eseguito un’analisi citofluorimetrica delle RBC di entrambi i soggetti sani e i tre pazienti RTT utilizzando un anti-CD71 (recettore della transferrina) e anticorpi anti-COX-IV. La frequenza di positività CD71, un marcatore di RBC immature, non era significativamente diversa nei soggetti sani e nei pazienti RTT (1,34 ± 0,13% vs 1,03 ± 0,3%; Fig. S3 supplementare). Va sottolineato che i pazienti RTT inclusi nello studio presentavano parametri ematologici normali e, anche se l’indice dei reticolociti era, almeno in un paio di soggetti, inferiore a quello riscontrato nei soggetti sani, le differenze complessive tra i due gruppi di pazienti non erano statisticamente significative (Tabella 1). Al contrario, una popolazione COX-IV+ molto debole è stata osservata nelle RBC sane, mentre una maggiore frequenza di cellule COX-IV+ è stata rilevata nelle RBC RTT (0,056 ± 0,004% vs 1,15 ± 0,19%, rispettivamente, p < 0,01). Questi risultati sono stati ulteriormente confermati utilizzando Mitotracker Green (MT) colorazione (Supplementary Fig. S3), che ha documentato un aumento di MT + RBCs in un paziente RTT (recante la mutazione R255X MeCP2) vs uno sano pazienti (0.37% vs 0.16%), simile a quello osservato con l’anticorpo COX-IV precedentemente descritto.

Al fine di convalidare ulteriormente l’identità di SRM, un numero uguale di RBC è stato lisato e analizzato da WB in condizioni denaturanti e riducenti. I filtri sono stati colorati con anticorpi contro sirtuina-3, una de-acetilasi specificamente espressa nella matrice mitocondriale40. Sirtuin3 è stato scelto come marcatore mitocondriale in questo approccio perché, a differenza di COX-IV e altri marcatori mitocondriali, il suo peso molecolare non si sovrappone a quello delle catene di emoglobina o oligomeri di emoglobina nel modello elettroforetico. Nei tre pazienti RTT esaminati, un aumento statisticamente significativo del rapporto sirtuina-3/GAPDH è stato osservato per ogni paziente rispetto allo stesso rapporto nei lisati di RBC sani (p < 0. 001) (Fig. supplementare S4).

Questi tre pazienti, tutti con la mutazione MeCP2 (cioè R255X), hanno mostrato il fenotipo peggiore, con una percentuale molto alta di RBC che mostrano almeno 1 mitocondrio. Tuttavia, il numero molto limitato di pazienti a nostra disposizione ha reso difficile trarre conclusioni statisticamente significative sulla possibilità di una relazione tra la gravità della malattia e l’entità della ritenzione mitocondriale all’interno delle RBC mature. Un altro punto, che sembra essere degno di nota, è che la ritenzione di mitocondri all’interno di RBC maturi nei modelli murini Ulk1-/- e Nix-/- precedentemente citati ha portato all’anemia o ad altre patologie del sangue probabilmente determinate dall’aumento della clearance di questi eritrociti anormali da parte dei macrofagi della milza32,33. Nei pazienti RTT arruolati in questo studio, è stata registrata solo una diminuzione molto limitata e non statisticamente significativa dei valori ematologici, ed essi non sembravano essere anemici o soffrire di altre patologie del sangue. La discrepanza tra i nostri risultati e quelli dei modelli murini potrebbe essere dovuta al fatto che il knock-down dei geni della macroautofagia o della mitofagia (cioè i topi Ulk1-/- e Nix-/-, rispettivamente) induce una percentuale molto alta di RBC contenenti mitocondri e la ritenzione di diversi organelli all’interno delle RBC, che è un difetto notevolmente più grave rispetto a quello documentato nei pazienti RTT32,33. Anche se abbiamo osservato un numero significativamente elevato di mitocondri contenenti RBC in pazienti portatori della mutazione R255X (Fig. 4), il numero di organelli in ogni cella era molto basso in RTT RBC (Fig. 4). Questo potrebbe non essere sufficiente per guidare importanti alterazioni morfologiche e funzionali nelle RBC. Vale la pena ricordare che, anche se la ritenzione mitocondriale all’interno delle RBC potrebbe essere almeno un fattore che determina il grave squilibrio redox osservato nelle RBC RTT in associazione con un cambiamento significativo dello stato energetico e del metabolismo (cioè, ATP/ADP e rapporto NADH/NAD), studi recenti hanno riferito che la cinetica dei legami di ossigeno all’emoglobina e la diffusione dell’ossigeno sono quasi sovrapponibili a quelle dei pazienti sani16,17,23,41.

L’apparente discrepanza tra i nostri risultati e quelli derivanti da modelli murini potrebbe anche trovare una spiegazione nel fatto che la sindrome RTT è un disturbo X-linked che colpisce quasi esclusivamente il genere femminile e l’inattivazione di una delle due copie del cromosoma X (XCI) è un fenomeno casuale che si verifica durante l’embriogenesi, come ampiamente documentato42,43. Così, nel caso della sindrome RTT, l’XCI casuale dovrebbe produrre, nelle cellule somatiche, un mosaicismo con metà delle cellule che esprimono l’allele wild-type e la restante metà che esprime l’allele mutato del gene MeCP2. È interessante notare che la possibilità che almeno alcune mutazioni di MeCP2 possano essere associate ad una XCI non casuale nel tessuto neuronale è in accordo con la variabilità fenotipica dei pazienti RTT (e anche per i casi familiari di RTT), una caratteristica che è stata ampiamente documentata42,43. Teoricamente, se la metà dei progenitori ematologici nel midollo osseo conserva il cromosoma X con la mutazione MeCP2, solo la metà dei globuli rossi maturi circolanti sarebbe portatrice dell’allele patologico, limitando così il numero di globuli rossi circolanti contenenti mitocondri. Tuttavia, una maggiore prevalenza di XCI non casuale a favore dell’allele wild-type è stata osservata nei leucociti circolanti in pazienti sporadici RTT42,43. Per quanto riguarda questo punto, sarebbe molto impegnativo affrontare se i pazienti che mostrano o meno un basso numero di RBC contenenti mitocondri mostrano anche una compromissione meno significativa della mitofagia o l’XCI non casuale, che porterebbe alla selezione positiva dei progenitori ematologici che portano l’allele wild-type MeCP2.

Pertanto, data la complessità della patologia RTT, preferiamo affermare che i pazienti RTT, insieme ai pazienti affetti dalla sindrome di Pearson, potrebbero rappresentare i primi casi di ritenzione di mitocondri nelle RBC umane mature44.

Evidenza di autofagia difettosa nel cervelletto dei topi Mecp2-null

Dato che la RTT è un disordine del neurosviluppo, per sostenere ulteriormente i nostri risultati che puntano verso un’autofagia difettosa sistemica, abbiamo eseguito analisi immuno-istochimiche per p62 e ubiquitina del cervelletto (cioè un organo in cui i mitocondri vengono conservati in un’area di sviluppo).cioè un organo in cui sono state osservate alterazioni dei mitocondri e altre importanti anomalie istologiche)21,45 di topi wild-type di 9 settimane e topi Mecp2 -/y di 5 settimane (asintomatici) e 9 settimane (sintomatici). Per ogni condizione sperimentale, l’organo isolato da tre animali è stato analizzato. Rispetto a wt, il cervelletto RTT ha mostrato un aumento dell’intensità della colorazione di p62 (Fig. 5a) e Ub (Fig. 5b) in tutti gli strati (cioè, granuli, Purkinje e strati corticali), che era lineare con l’età degli animali. Inoltre, le strutture ipercolorate assomigliavano ad aggregati intracellulari. Secondo la valutazione semiquantitativa dell’intensità della colorazione di p62/SQSTM1 e Ub, le differenze tra il cervelletto di animali di 5 settimane vs animali sani, e di animali di 9 settimane vs animali di 5 settimane erano statisticamente significative (p < 0.05).

La differenza istologica tra animali asintomatici e sintomatici suggerisce che l’alterazione dell’autofagia potrebbe essere assente o debole alla nascita, mentre aumenta progressivamente durante le prime settimane di vita (e forse quando l’attività MeCP2 raggiunge un picco), dando origine ai sintomi.