Organizzazione ed espressione del genoma
Gli RNA genomici dei luteoviridi contengono da cinque a sette ORF conservate (Fig. 3). Le ORF 1, 2, 3 e 5 sono condivise tra tutti i membri del Luteoviridae. I luteoviridi mancano di ORF0. Gli Enamovirus mancano di ORF4. I genomi di luteo- e polerovirus contengono una piccola ORF (ORF3a) a monte di ORF3. I genomi dei luteovirus contengono una piccola ORF (ORF6) a valle di ORF5. Il genoma PLRV contiene ORF 6 e 7, all’interno di ORF5 e ORF8 all’interno di ORF1. Negli enamovirus e nei polerovirus, ORF0 si sovrappone a ORF1 per più di 600 nt, che si sovrappone anche a ORF2 per più di 600 nt. Nei luteovirus, ORF1 si sovrappone a ORF2 per meno di 50 nt. Nella maggior parte delle sequenze del genoma di luteo- e polerovirus, ORF4 è contenuta completamente all’interno di ORF3. Un singolo codone di terminazione in-frame ambra (UAG) separa ORF5 da ORF3.
Fig. 3. Mappe dei genomi dei virus dei generi della famiglia Luteoviridae. Le singole ORF sono mostrate con caselle aperte. Le ORF sono sfalsate verticalmente per mostrare le diverse cornici di lettura occupate da ciascuna ORF. Le caselle gialle indicano i prodotti proteici con le dimensioni previste elencate a destra di ciascuno. Le poliproteine codificate da ORF1 di enamo e polerovirus contengono la proteasi e la proteina legata al genoma (VPg). Le sequenze previste di aminoacidi delle proteine codificate da ORF2 sono simili alle RNA polimerasi RNA-dipendenti. ORF3, che codifica la principale proteina del mantello, è separata da ORF5 da un codone di terminazione ambrato. ORF4, quando presente, è il più delle volte contenuta in ORF3 e codifica una proteina necessaria per il movimento da cellula a cellula del virus. I luteo-virus e i polerovirus contengono una ORF3a per la quale la traduzione è iniziata con un codone non AUG. Le regioni 3′ non codificanti dei luteovirus contengono elementi potenziatori di traduzione (BTE). In PLRV, ORF7 è in-frame con il C-terminale di ORF5, e la traduzione di ORF8 è mediata da un sito interno di entrata del ribosoma di iniziazione (IRES). Luteo- e polerovirus producono tre RNA sub-genomici (sgRNA), ma gli enamovirus producono un singolo sgRNA.
I luteoviridi hanno sequenze non codificanti 5′ e intergeniche relativamente brevi. La prima ORF è preceduta da 21 nt nell’RNA di CABYV e 142 nt nell’RNA del virus nano della soia (SbDV). Le ORF 2 e 3 sono separate da 112-200 nt di RNA non codificante. C’è una considerevole variazione nella lunghezza della sequenza a valle di ORF5, che varia da 167 nt per CYDV-RPV a 650 nt per SbDV.
I luteoviridi impiegano una vasta gamma di strategie per esprimere i loro genomi compatti. Le ORF 0, 1, 2 e 8 sono espresse direttamente dagli RNA genomici. Le ORF a valle sono espresse da RNA sub-genomici (sgRNA) che sono trascritti da siti di iniziazione interni da RNA polimerasi RNA-dipendenti codificate dal virus (RdRps) da RNA a filamento negativo e sono 3′ co-terminali con l’RNA genomico. Poiché il codone di inizio per ORF0 dei polero- ed enamovirus è a monte di quello di ORF1, la traduzione di ORF1 è iniziata da una “scansione a perdita” in cui i ribosomi bypassano l’AUG di ORF0 e continuano a scansionare l’RNA genomico fino a raggiungere l’AUG di ORF1. I prodotti proteici di ORF2 sono espressi come una fusione traslazionale con il prodotto di ORF1. Con una frequenza bassa ma significativa durante l’espressione di ORF1, la traduzione continua in ORF2 attraverso un frameshift -1 che produce una grande proteina contenente sequenze codificate da entrambe le ORF 1 e 2 in un singolo polipeptide. Il frameshift è mediato da una “sequenza epta-nucleotidica scivolosa” (nella forma X XXY YYZ) e da una struttura secondaria dell’RNA a valle, chiamata pseudoknot, che fa sì che i ribosomi facciano una pausa e poi si spostino indietro di un nt prima di continuare la traduzione nel nuovo frame di lettura. ORF8, che è stata identificata solo in PLRV, risiede interamente all’interno di ORF1 in una struttura di lettura diversa e codifica una proteina associata alla replicazione di 5 kDa. Per esprimere l’ORF8, le sequenze all’interno dell’ORF si ripiegano in una struttura chiamata sito interno di ingresso del ribosoma (IRES), che recluta i ribosomi per iniziare la traduzione circa 1600 nt a valle del termine 5′ dell’RNA di PLRV.
Le ORF 3a, 3, 4, e 5 sono espresse attraverso un meccanismo di scansione leaky dal 5′ terminale di sgRNA1, che si trova circa 200 nt a monte di ORF3 alla fine di ORF2 e si estende al 3′ terminale del genoma. La traduzione di ORF3a è iniziata ad un codone non-AUG. L’ORF4 della maggior parte dei luteovirus e dei polerovirus è contenuta all’interno dell’ORF3. In tutti i luteoviridi, l’ORF5 è espressa solo come fusione traslazionale con i prodotti dell’ORF3 tramite il readthrough del codone di stop UAG alla fine dell’ORF3, che produce una proteina con il prodotto dell’ORF3 al suo N-termine e il prodotto dell’ORF5 al suo C-termine. Il readthrough è regolato da interazioni RNA-RNA locali e a lunga distanza e nel caso dei luteovirus e di alcuni polerovirus richiede la presenza di ripetizioni CCXXXX (dove X è una base qualsiasi) a valle del codone di stop ORF3. I luteovirus e i polerovirus producono secondi sgRNA più piccoli in grado di esprimere le ORF 6 e 7. I terzi sgRNA, che non sembrano codificare proteine, sono prodotti a livelli molto alti nei luteovirus, ma solo a bassi livelli in PLRV.
Mentre gli RNA di enamo e polerovirus contengono 5′ VPgs che interagiscono con i fattori di inizio della traduzione, gli RNA dei luteovirus contengono solo un 5′ fosfato. I termini 5′ non modificati sono riconosciuti male per l’iniziazione della traduzione. Per aggirare questo problema, il genoma BYDV-PAV contiene una breve sequenza (elemento di traduzione BYDV; BTE) situata nella regione non codificante 3′ a valle di ORF5 che interagisce con sequenze vicino ai termini 5′ dell’RNA genomico e sgRNA1 per promuovere l’iniziazione della traduzione indipendente dal cappuccio.
Il silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS) è una difesa antivirale innata e altamente adattativa presente in tutti gli eucarioti che viene attivata dagli RNA a doppio filamento (dsRNA), che vengono prodotti durante la replicazione del virus. La ricerca sulle funzioni delle proteine codificate dai luteoviridi ha dimostrato che le proteine 28-34 kDa codificate da ORF0 sono forti soppressori della PTGS locale e sistemica per polero- ed enamovirus. I genomi dei luteovirus mancano di ORF0, ma il prodotto di ORF4 nei luteovirus funziona per sopprimere la PTGS sistemica.
Le proteine codificate da ORF1 di enamo- e polerovirus contengono la VPg e una serina proteasi simile alla chimotripsina che è responsabile del processo proteolitico delle poliproteine codificate da ORF1. La proteasi scinde la proteina ORF1 internamente per liberare il VPg, che è covalentemente attaccato all’RNA genomico. La proteina espressa da ORF8 di PLRV è necessaria per la replicazione del virus. Le ORF2 dei luteoviridi hanno una capacità di codifica di 59-67 kDa per proteine che sono molto simili alle RdRps conosciute e quindi probabilmente rappresentano la porzione catalitica della replicasi virale.
Per i luteoviri e i polerovirus ORF3a produce proteine altamente conservate di 4,8-5,3 kDa che sono essenziali per il movimento a lunga distanza. ORF3 codifica la principale CP dei luteoviridi, che varia in dimensioni da 21 a 23 kDa. ORF5 ha una capacità di codifica di 29-56 kDa. Tuttavia, ORF5 è espressa solo come una fusione traslazionale con il prodotto di ORF3 quando, circa il 10% delle volte, la traduzione non si ferma alla fine di ORF3 e continua fino alla fine di ORF5. La porzione ORF5 di questa proteina readthrough è stata implicata nella trasmissione agli afidi e nella stabilità del virus. Esperimenti con PLRV e BYDV-PAV hanno dimostrato che la regione N-terminale della proteina ORF5 readthrough determina la capacità delle particelle virali di legarsi alle proteine prodotte dai batteri endosimbiotici dei vettori afidi. Le interazioni delle particelle virali con queste proteine sembrano essere essenziali per la persistenza dei virus negli afidi. I cambiamenti di sequenza nucleotidica all’interno dell’ORF5 del PEMV-1 aboliscono la trasmissibilità agli afidi. Le porzioni N-terminali delle proteine ORF5 sono altamente conservate tra i luteoviridi mentre i C-termini sono molto più variabili.
I genomi dei luteo- e polerovirus possiedono una ORF4 che è contenuta nella ORF3 e codifica proteine di 17-21 kDa. I virus che contengono mutazioni in ORF4 sono in grado di replicarsi in protoplasti di piante isolate, ma sono carenti o in ritardo nel movimento sistemico in piante intere. Quindi, il prodotto di ORF4 sembra essere richiesto per il movimento del virus all’interno delle piante infette. Questa ipotesi è supportata dall’osservazione che gli enamovirus mancano di ORF4. Mentre i luteo-virus e i polerovirus sono limitati al floema e ai tessuti associati, l’enamovirus PEMV-1 è in grado di muoversi sistematicamente attraverso altri tessuti vegetali in presenza di PEMV-2, che in condizioni naturali coesiste invariabilmente con PEMV-1.
Alcuni genomi di luteo- e polerovirus contengono piccole ORF all’interno e/o a valle di ORF5. Nei luteovirus, nessun prodotto proteico è stato rilevato da queste ORF nelle cellule infettate. I genomi BYDV-PAV che non esprimono ORF6 sono ancora in grado di replicarsi nei protoplasti. Le dimensioni previste delle proteine espresse dalle ORF 6 e 7 di PLRV sono 7,1 e 14 kDa, rispettivamente. Sulla base di studi mutazionali, è stato proposto che queste regioni del genoma possano regolare la trascrizione in ritardo nell’infezione.