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La medicina di laboratorio ha fatto progressi significativi negli ultimi due decenni. I dosaggi della carica virale si sono evoluti dai dosaggi PCR annidati all’amplificazione mediata dalla trascrizione alla PCR in tempo reale e continuano ad evolversi con metodi come la PCR digitale. Questo progresso ha portato a saggi di carica virale più sensibili con una gamma dinamica più ampia, che permette ai medici una migliore comprensione della risposta di un paziente alla terapia e alla progressione della malattia.

Un esempio di migliore gestione del paziente con il progresso della diagnostica molecolare è stata la gestione dei pazienti HIV-1. Secondo le attuali linee guida sul trattamento, il successo del trattamento è definito come una concentrazione di HIV-1 RNA inferiore a 75 copie/mL.1 La definizione di fallimento del trattamento varia in base alle linee guida globali, nazionali e specifiche del paese, ma è solitamente definita come una concentrazione di HIV-1 RNA tra 50-1000 copie/mL.1-3

Questi cut-off di trattamento sono all’estremità bassa del range dinamico dei test PCR in tempo reale, dove la precisione e la riproducibilità possono essere messe in discussione. I fattori che potrebbero influenzare le prestazioni del test della carica virale sono la piattaforma automatizzata, la chimica di estrazione dell’acido nucleico, la selezione e la progettazione del primer/sonda della PCR, le condizioni di amplificazione della PCR e la strategia di calibrazione del test. Qui esamineremo diversi approcci di progettazione e il loro potenziale impatto sulle prestazioni del test e sull’esito clinico. (Figura 1)

Processo di estrazione

Si dovrebbe considerare attentamente il tipo di campione e l’analita quando si seleziona la chimica di estrazione. Per esempio, nei casi di HIV-1, il Department of Health and Human Services (DHHS) consiglia di utilizzare l’HIV-1 RNA come marker della viremia di HIV-1.1

La distinzione tra HIV-1 RNA e DNA provirale è importante poiché quest’ultimo non è un marker della replicazione virale attiva, ma piuttosto del rilascio di un reservoir latente dal virus, che è già stato integrato nelle cellule. Una chimica di estrazione che purifica sia l’HIV-1 RNA che il DNA provirale non fornirebbe al medico una rappresentazione accurata della vera replicazione virale; quindi, nel caso di questo virus, dovrebbe essere usata solo la chimica di estrazione che purifica specificamente l’HIV-1 RNA per escludere il DNA provirale dalla quantificazione a valle.

In alternativa, l’uso della chimica di estrazione dell’acido nucleico totale (TNA) per la quantificazione dell’HIV-1 potrebbe potenzialmente portare a risultati falso-positivi o a una quantificazione imprecisa, che avrebbe effetti negativi sulla gestione del paziente. La chimica di estrazione TNA può essere utilizzata per i tipi di campioni più difficili come le urine o le feci o per i test che devono rilevare entrambi i target RNA/DNA.

Selezione del target

L’estrema diversità virale riscontrata tra i ceppi di HIV, HBV e HCV è della massima preoccupazione per garantire che i test di diagnosi molecolare (MDx) diano il risultato corretto indipendentemente dal ceppo (o dai ceppi) presenti in un campione.

Per affrontare questa preoccupazione, la progettazione ottimale del test dovrebbe iniziare con la selezione del target del primer/sonda in una regione geneticamente conservativa dove la diversità virale avrà il minor impatto potenziale. Le regioni geneticamente conservative possono essere determinate solo confrontando le sequenze di diversi ceppi virali.

Per soddisfare questa esigenza, un programma di sorveglianza globale è fondamentale per valutare in modo completo la diversità virale esistente in circolazione per i ceppi di HIV, HBV e HCV.4 In un programma di sorveglianza, le sequenze generate da ceppi raccolti in regioni geograficamente diverse vengono utilizzate per determinare quali regioni di un genoma virale sono maggiormente conservate e idonee ad essere rilevate da un test diagnostico molecolare. Usando le sequenze virali circolanti per informare la progettazione del test, il rischio che i ceppi non siano rilevati da un test è significativamente ridotto.

Progettazione della sonda e condizioni di ciclo della PCR

Oltre alla selezione della regione bersaglio, la progettazione della sonda e le condizioni di ciclo della PCR sono fondamentali per garantire un’accurata quantificazione della carica virale. La progettazione della sonda deve essere tollerante ai polimorfismi naturali e, a sua volta, ai potenziali mismatch che possono verificarsi all’interno della regione bersaglio. Nel corso del tempo, la tecnologia della sonda si è evoluta, così come la metodologia della PCR. La più ampia gamma di applicazioni MDx basate sulla tecnologia PCR oltre la quantificazione virale richiedono l’utilizzo di diversi disegni sonda. Le sonde che legano le scanalature minori sono tipicamente utilizzate per la genotipizzazione e il rilevamento del polimorfismo a singolo nucleotide.

Le sonde TaqMan sono spesso utilizzate in saggi in cui le regioni target hanno un alto grado di conservazione. Le sonde parzialmente a doppio filamento, che tollerano meglio alti livelli di eterogeneità genetica dovuti principalmente alla lunghezza della sonda e alle condizioni di legame, vengono utilizzate in aree in cui vi è un alto grado di eterogeneità.5

Oltre alla progettazione della sonda, le condizioni di ciclaggio sono spesso oggetto di ottimizzazione della progettazione, al fine di raggiungere il requisito di prestazione (ad esempio la tolleranza di potenziali mismatch). Il ciclaggio in fase corrispondente è un approccio che incorpora cicli a una temperatura inferiore per ridurre la severità iniziale, che è seguita da cicli ad alte temperature per preservare la specificità. Questo approccio mitiga l’effetto negativo sulla quantificazione del campione da potenziali mismatch del primer. Nel caso in cui sia difficile evitare l’impatto significativo di polimorfismi rari, il rilevamento di un secondo target può essere incorporato nel progetto del test. Quando la diversità di sequenza influenza il rilevamento di una regione del genoma virale, il rilevamento di una seconda regione assicura un risultato accurato. Data la complessità dei test molecolari e l’alto livello di diversità virale, quando si progettano i test molecolari si dovrebbe considerare un approccio globale che utilizzi la sorveglianza globale e la progettazione di sonde specifiche per il target. Semplicemente adattando una strategia come il dual-target può fornire un falso senso di sicurezza.

Strategia di calibrazione

La strategia di calibrazione è una componente integrale della progettazione del test molecolare ed è fondamentale per garantire la riproducibilità in un ampio intervallo dinamico. La maggior parte delle metodologie quantitative per la gestione della terapia utilizzano attualmente una curva di calibrazione esterna per determinare la concentrazione di un analita.

In questi test, il segnale dell’analita in un campione del paziente viene confrontato con un insieme di campioni con una concentrazione nota e viene utilizzata una semplice regressione lineare (y=mx+b) per calcolare la carica virale. Questo approccio utilizza tipicamente calibratori che vengono elaborati come campioni del paziente attraverso l’intero processo, consentendo la calibrazione dei reagenti e degli strumenti sia di estrazione che di amplificazione.

In alternativa, si potrebbero utilizzare calibratori che non vengono elaborati attraverso l’estrazione, tuttavia, questo approccio comporta il rischio che la differenza di recupero o un cambiamento nella composizione del reagente non vengano presi in considerazione, portando potenzialmente a differenze nella quantificazione.

Un’altra strategia meno utilizzata è uno standard quantitativo interno. Questa applicazione utilizza una linea di regressione polinomiale di 3° ordine (y = ax3 + bx2 + cx + d) attraverso l’intervallo lineare con una differenza massima ammissibile dalla linearità. Studi precedenti hanno suggerito che la differenza ammissibile accettabile dalla linearità per alcuni test era ± 0,2 Log10.6 Questa differenza ammissibile dalla linearità e l’approccio di calibrazione spiegano anche la distorsione spesso osservata tra le metodologie, così come la maggiore imprecisione all’estremità bassa dell’intervallo dinamico dove spesso vengono prese le decisioni cliniche.

Conclusione

Le prestazioni accurate e precise del test molecolare sono fondamentali per una gestione appropriata della terapia. Risultati imprecisi della carica virale potrebbero portare a una gestione inappropriata e il paziente potrebbe essere lasciato in terapia fallimentare. Questa diagnosi errata ha implicazioni molto più ampie rispetto alla gestione di un singolo paziente, poiché potrebbe anche portare a un aumento della trasmissione del ceppo virale resistente. Dal punto di vista della gestione della terapia, un virus con mutazioni associate alla resistenza è più difficile da trattare con opzioni terapeutiche più limitate. Inoltre, i tassi di falsi positivi possono aggiungere costi inutili per ripetere i test o test di resistenza più costosi, così come l’ansia per il paziente e il medico.

1. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV developed by Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Accessed September 2019.
2. European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
3. National Department of Health, South Africa, April 2015, accessed August 2, 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
4. Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development. Giornale di virologia medica. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
5. Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Sonde di DNA lineare parzialmente a doppio filamento: nuovo design per il rilevamento sensibile di obiettivi geneticamente polimorfici. Giornale dei metodi virologici. 2007;144(1-2):1-11.
6. Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Development of a second version of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan hepatitis C virus quantitative test with improved genotype inclusivity. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.

Riconoscimento: L’autore desidera riconoscere e ringraziare Mary Rodgers e Shihai Huang per la loro revisione di questo articolo.