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I coronavirus hanno causato due pandemie su larga scala negli ultimi due decenni, SARS e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS)8,9. È stato generalmente pensato che il SARSr-CoV – che si trova principalmente nei pipistrelli – potrebbe causare una futura epidemia10,11. Qui riportiamo una serie di casi causati da un’epidemia di polmonite non identificata a Wuhan, provincia di Hubei, Cina centrale. Questo focolaio di malattia – che ha iniziato da un mercato locale di frutti di mare – è cresciuto sostanzialmente per infettare 2.761 persone in Cina, è associato a 80 morti e ha portato all’infezione di 33 persone in 10 paesi aggiuntivi come del 26 gennaio 202012. I sintomi clinici tipici di questi pazienti sono febbre, tosse secca, difficoltà respiratorie (dispnea), mal di testa e polmonite. L’insorgenza della malattia può comportare un’insufficienza respiratoria progressiva a causa del danno alveolare (come osservato dalle immagini di tomografia computerizzata del torace trasversale) e persino la morte. La malattia è stata determinata dai clinici in base ai sintomi clinici e ad altri criteri, tra cui l’aumento della temperatura corporea, la diminuzione del numero di linfociti e di globuli bianchi (anche se i livelli di questi ultimi erano talvolta normali), nuovi infiltrati polmonari alla radiografia del torace e nessun miglioramento evidente dopo il trattamento con antibiotici per tre giorni. Sembra che la maggior parte dei primi casi abbia avuto una storia di contatto con il mercato dei frutti di mare originale; tuttavia, la malattia è ora progredita per essere trasmessa da contatto umano a umano.

I campioni di sette pazienti con polmonite grave (sei dei quali sono venditori o fattorini del mercato dei frutti di mare), che sono stati ricoverati nel reparto di terapia intensiva del Wuhan Jin Yin-Tan Hospital all’inizio dell’epidemia, sono stati inviati al laboratorio del Wuhan Institute of Virology (WIV) per la diagnosi del patogeno causale (Extended Data Table 1). In quanto laboratorio che indaga sul CoV, abbiamo innanzitutto utilizzato primer PCR pan-CoV per testare questi campioni13 , dato che il focolaio si è verificato in inverno e in un mercato, lo stesso ambiente delle infezioni da SARS. Abbiamo trovato cinque campioni positivi alla PCR per i CoV. Un campione (WIV04), raccolto dal liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF), è stato analizzato mediante analisi metagenomica utilizzando il sequenziamento di prossima generazione per identificare potenziali agenti eziologici. Delle 10.038.758 letture totali – di cui 1.582 sono state trattenute dopo il filtraggio delle letture dal genoma umano – 1.378 (87,1%) sequenze corrispondevano alla sequenza di SARSr-CoV (Fig. 1a). Con l’assemblaggio de novo e la PCR mirata, abbiamo ottenuto un genoma CoV di 29.891 paia di basi che condivideva il 79,6% di identità di sequenza con SARS-CoV BJ01 (numero di accesso GenBank AY278488.2). L’alta copertura del genoma è stata ottenuta rimappando le letture totali a questo genoma (Dati estesi Fig. 1). Questa sequenza è stata presentata a GISAID (https://www.gisaid.org/) (numero di adesione EPI_ISL_402124). Seguendo il nome dato dall’Organizzazione mondiale della sanità (OMS), lo chiamiamo provvisoriamente novel coronavirus 2019 (2019-nCoV). Altre quattro sequenze complete del genoma del 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 e WIV07) (numeri di accesso GISAID EPI_ISL_402127-402130), identiche tra loro per oltre il 99,9%, sono state successivamente ottenute da altri quattro pazienti utilizzando il sequenziamento di prossima generazione e la PCR (Tabella dati estesa 2).

Il genoma del virus consiste di sei principali open-reading frame (ORF) che sono comuni ai coronavirus e un certo numero di altri geni accessori (Fig. 1b). Ulteriori analisi indicano che alcuni dei geni del 2019-nCoV condividono meno dell’80% di identità di sequenza nucleotidica con il SARS-CoV. Tuttavia, le sequenze di aminoacidi dei sette domini conservati della replicasi in ORF1ab che sono stati utilizzati per la classificazione delle specie di CoV erano identici al 94,4% tra 2019-nCoV e SARS-CoV, suggerendo che i due virus appartengono alla stessa specie, SARSr-CoV.

Abbiamo poi scoperto che una breve regione di RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) da un coronavirus di pipistrello (BatCoV RaTG13) – che è stato precedentemente rilevato in Rhinolophus affinis dalla provincia dello Yunnan – ha mostrato un’alta identità di sequenza con 2019-nCoV. Abbiamo effettuato il sequenziamento della lunghezza completa su questo campione di RNA (numero di adesione GISAID EPI_ISL_402131). L’analisi Simplot ha mostrato che 2019-nCoV era altamente simile in tutto il genoma a RaTG13 (Fig. 1c), con un’identità complessiva di sequenza del genoma del 96,2%. Utilizzando le sequenze del genoma allineate di 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV e dei SARSr-CoV dei pipistrelli precedentemente riportati, non è stata rilevata alcuna prova di eventi di ricombinazione nel genoma di 2019-nCoV. L’analisi filogenetica del genoma completo e delle sequenze geniche di RdRp e spike (S) ha mostrato che – per tutte le sequenze – RaTG13 è il parente più prossimo di 2019-nCoV e forma una linea distinta dagli altri SARSr-CoV (Fig. 1d e Extended Data Fig. 2). La proteina spike legata al recettore codificata dal gene S era altamente divergente dagli altri CoV (Dati estesi Fig. 2), con meno del 75% di identità di sequenza nucleotidica con tutti i SARSr-CoV precedentemente descritti, tranne un’identità nucleotidica del 93,1% con RaTG13 (Dati estesi Tabella 3). I geni S del 2019-nCoV e del RaTG13 sono più lunghi degli altri SARSr-CoV. Le principali differenze nella sequenza del gene S del 2019-nCoV sono le tre brevi inserzioni nel dominio N-terminale e i cambiamenti in quattro dei cinque residui chiave nel motivo di legame al recettore rispetto alla sequenza di SARS-CoV (Dati estesi Fig. 3). Se le inserzioni nel dominio N-terminale della proteina S del 2019-nCoV conferiscono attività di legame agli acidi sialici come nel MERS-CoV deve essere ulteriormente studiato. La stretta relazione filogenetica con RaTG13 fornisce la prova che 2019-nCoV può aver avuto origine nei pipistrelli.

Abbiamo rapidamente sviluppato un metodo di rilevamento basato sulla qPCR sulla base della sequenza del dominio di legame al recettore del gene S, che era la regione più variabile del genoma (Fig. 1c). I nostri dati mostrano che i primer potevano differenziare il 2019-nCoV da tutti gli altri coronavirus umani, compreso il pipistrello SARSr-CoV WIV1, che condivide il 95% di identità con il SARS-CoV (Dati estesi Fig. 4a, b). Dei campioni ottenuti dai sette pazienti, abbiamo scoperto che sei campioni di BALF e cinque campioni di tampone orale erano positivi al 2019-nCoV durante il primo campionamento, come valutato dalla qPCR e dalla PCR convenzionale. Tuttavia, non abbiamo più potuto rilevare campioni positivi al virus nei tamponi orali, nei tamponi anali e nei campioni di sangue prelevati da questi pazienti durante il secondo campionamento (Fig. 2a). Tuttavia, raccomandiamo di utilizzare altri target qPCR, tra cui i geni RdRp o dell’involucro (E) per il rilevamento di routine del 2019-nCoV. Sulla base di questi risultati, proponiamo che la malattia potrebbe essere trasmessa per via aerea, anche se non possiamo escludere altre possibili vie di trasmissione, poiché sono necessarie ulteriori indagini, compreso un maggior numero di pazienti.

Per il rilevamento sierologico del 2019-nCoV, abbiamo usato una proteina del nucleocapside (N) precedentemente sviluppata dal pipistrello SARSr-CoV Rp3 come antigene per i test di immunosorbimento enzimatico (ELISA) IgG e IgM, poiché questa proteina condivideva il 92% di identità aminoacidica con la proteina N del 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) e non ha mostrato alcuna reattività incrociata contro altri coronavirus umani tranne SARSr-CoV7. Siamo stati in grado di ottenere solo cinque campioni di siero dai sette pazienti con infezioni virali. Abbiamo monitorato i livelli di anticorpi virali in un paziente (ICU-06) 7, 8, 9 e 18 giorni dopo l’inizio della malattia (tabella 2 dei dati estesi). Una chiara tendenza è stata osservata nei titoli IgG e IgM, che sono aumentati nel tempo, tranne che il titolo IgM è diminuito nell’ultimo campione (Fig. 2b). Come seconda analisi, abbiamo testato i campioni di 5 dei 7 pazienti positivi al virus circa 20 giorni dopo l’inizio della malattia per la presenza di anticorpi virali (Tabelle dei dati estesi 1, 2). Tutti i campioni dei pazienti – ma non i campioni di individui sani – erano fortemente positivi per le IgG virali (Fig. 2b). C’erano anche tre campioni IgM-positivi, indicando un’infezione acuta.

Allora abbiamo isolato con successo il virus (chiamato 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) sia da cellule Vero E6 che Huh7 usando il campione BALF del paziente ICU-06. Sono stati osservati chiari effetti citopatogeni nelle cellule dopo l’incubazione per tre giorni (Extended Data Fig. 6a, b). L’identità del ceppo WIV04 è stata verificata in cellule Vero E6 mediante microscopia ad immunofluorescenza utilizzando l’anticorpo N virale cross-reattivo (Dati estesi Fig. 6c, d) e mediante sequenziamento metagenomico, la maggior parte delle letture del quale ha mappato al 2019-nCoV, e l’analisi qPCR ha mostrato che la carica virale è aumentata dal giorno 1 al giorno 3 (Dati estesi Fig. 6e, f). Le particelle virali nelle sezioni ultrasottili delle cellule infettate hanno mostrato una morfologia tipica dei coronavirus, come visualizzato dalla microscopia elettronica (dati estesi Fig. 6g). Per confermare ulteriormente l’attività di neutralizzazione dei campioni virali IgG-positivi, abbiamo condotto test di siero-neutralizzazione in cellule Vero E6 utilizzando i cinque sieri dei pazienti che erano IgG-positivi. Dimostriamo che tutti i campioni erano in grado di neutralizzare 100 TCID50 (50% di dose infettiva in coltura di tessuti) del 2019-nCoV ad una diluizione di 1:40-1:80. Abbiamo anche dimostrato che questo virus potrebbe essere neutralizzato in modo incrociato dal siero di cavallo anti-SARS-CoV (dono di L.-F. Wang) a diluizioni di 1:40; tuttavia, il potenziale di reattività incrociata con gli anticorpi anti-SARS-CoV deve essere confermato con il siero anti-SARS-CoV degli esseri umani (Tabella dati estesa 4).

ACE2 è noto per essere un recettore cellulare per SARS-CoV14. Per determinare se 2019-nCoV utilizza anche ACE2 come recettore di ingresso cellulare, abbiamo condotto studi di infettività del virus utilizzando cellule HeLa che esprimevano o meno le proteine ACE2 dell’uomo, dei pipistrelli a ferro di cavallo cinesi, degli zibetti, dei maiali e dei topi. Mostriamo che 2019-nCoV è in grado di utilizzare tutte le proteine ACE2, tranne l’ACE2 del topo, come recettore di ingresso per entrare nelle cellule che esprimono ACE2, ma non nelle cellule che non esprimono ACE2, indicando che ACE2 è probabilmente il recettore cellulare attraverso il quale 2019-nCoV entra nelle cellule (Fig. 3). Mostriamo anche che 2019-nCoV non utilizza altri recettori del coronavirus, come l’aminopeptidasi N (APN) e la dipeptidil peptidasi 4 (DPP4) (Dati estesi Fig. 7).

Lo studio fornisce un rapporto dettagliato sul 2019-nCoV, il probabile agente eziologico responsabile dell’attuale epidemia di sindrome respiratoria acuta in Cina e in altri paesi. La sieroconversione nucleotidica e proteica virale-specifica è stata osservata in tutti i pazienti esaminati e fornisce la prova di un’associazione tra la malattia e la presenza di questo virus. Tuttavia, ci sono ancora molte domande urgenti a cui deve essere data una risposta. L’associazione tra il 2019-nCoV e la malattia non è stata verificata da esperimenti su animali per soddisfare i postulati di Koch per stabilire una relazione causale tra un microrganismo e una malattia. Non conosciamo ancora la routine di trasmissione di questo virus tra gli ospiti. Sembra che il virus stia diventando più trasmissibile tra gli esseri umani. Dovremmo monitorare da vicino se il virus continua ad evolversi per diventare più virulento. A causa della carenza di trattamenti specifici e considerando la parentela del 2019-nCoV con il SARS-CoV, alcuni farmaci e vaccini preclinici contro il SARS-CoV potrebbero probabilmente essere utilizzati per trattare questo virus. Infine, considerando l’ampia diffusione di SARSr-CoV nei loro serbatoi naturali, la ricerca futura dovrebbe concentrarsi sulla sorveglianza attiva di questi virus per regioni geografiche più ampie. A lungo termine, i farmaci antivirali ad ampio spettro e i vaccini dovrebbero essere preparati per le malattie infettive emergenti che sono causate da questo gruppo di virus in futuro. Soprattutto, dovrebbero essere implementati regolamenti rigorosi contro l’addomesticamento e il consumo di fauna selvatica.

Nota aggiunta in bozza: Da quando questo articolo è stato accettato, l’ICTV ha designato il virus come SARS-CoV-215; inoltre, l’OMS ha rilasciato il nome ufficiale della malattia causata da questo virus, che è COVID-1916.