Discussie
Een belangrijke parameter in HELM is de hoek van de bundel α ten opzichte van de optische as, die de ruimtelijke frequentie van excitatie u bepaalt. In Fig. 4 is te zien dat de keuze van u een afweging vereist tussen de maximale afsnijfrequentie langs de kx- en ky-as en de anisotropie van de resulterende passband.
De gekozen waarde (55°) is een goed compromis en maakt bovendien directe waarneming van het interferentiepatroon met immersie-objectieven mogelijk.
anisotropie van de resulterende passband.
De gekozen waarde (55 °) is een goed compromis en bovendien maakt directe observatie van de interferentie patroon met onderdompeling objectieven.
Want van de niet-isotrope passband, de beelden van de kralen vertonen enige anisotropie en een overshooting in de buurt van de randen van de kralen; het meest merkbaar zijn de donkere zones in de diagonale richtingen in Fig. 2A. Dit effect kan grotendeels worden vermeden door het gebruik van zes of acht laserstralen georiënteerd in veelvouden van 60 ° of 45 °, respectievelijk.‡
Vergeleken met CFM, de signaal-ruisverhouding van de HELM beeld is superieur, ook al is de tijd geïntegreerde laservermogen was meer dan 100 keer hoger voor de CFM beeld in Fig. 2C. Een fundamentele reden voor deze verbetering ligt in het feit dat de resolutie verbetering van CFM in vergelijking met standaard fluorescentie microscopie kan alleen worden bereikt door het gebruik van een kleine pinhole in de emissie lichtpad (5, 13, 14). Deze regeling vereist een afweging van ruisniveau en resolutie. Omgekeerd, in HELM, alle fotonen die de lenzen kan worden opgevangen door de camera.
Voor studies van dynamische objecten, beeldvorming snelheid is van groot belang. De fundamentele beperking van de beeldsnelheid in fluorescentiemicroscopie wordt gegeven door de maximale emissiesnelheid van de fluoroforen veroorzaakt door de eindige levensduur van de aangeslagen toestand (“kleurstofverzadiging”; ref. 15). Bij HELM wordt ruwweg de helft van de fluoroforen in één keer door het interferentiepatroon belicht, terwijl bij de gebruikelijke CFM met één punt slechts een zeer klein deel van de fluoroforen in één keer wordt belicht (≈1 per miljoen voor een beeld van 1.024 × 1.024 pixel). Dientengevolge is de totale fotonenflux van het preparaat beperkt tot waarden die verscheidene orden van grootte kleiner zijn voor de sequentiële werking van CFM dan voor de parallelle werking van HELM. Omdat een minimum aantal fotonen per beeld nodig is voor een bepaald signaal-ruis niveau, heeft HELM de mogelijkheid om veel sneller beeldgegevens te verkrijgen dan CFM. Naast deze fundamentele overweging vermindert HELM de snelheidsproblemen in verband met mechanische scanmechanismen, omdat slechts vijf scans per beeld worden uitgevoerd, in tegenstelling tot CFM, waar één scan per lijn vereist is. Zowel het kleurstofverzadigingsprobleem als de mechanische scanproblemen van CFM kunnen echter worden verminderd door de nieuwere meerpuntscanners.
De voordelen op het gebied van beeldvormingssnelheid zijn ook te zien in onze experimentele gegevens. De totale acquisitietijd voor de vijf beelden die nodig zijn voor HELM (Fig. 2A) was 1,6 s in vergelijking met 6,5 s voor de confocale beeld (Fig. 2C). Rekening houdend met de hogere signaal-ruisverhouding van de HELM beeld dat wordt bereikt met een ongekoelde industriële-grade CCD-camera, het verschil is duidelijk.
Een punt van praktisch belang is de vereiste stabiliteit van het interferentiepatroon tijdens de meting. We vonden dat fase offset fouten van 1/10 van de nodal spacing (20 nm) zijn net tolereerbaar, maar grotere fouten leiden tot aanzienlijke beeld verslechteringen. De thermische drift van onze opstelling (typisch 20 nm/min in een niet-temperatuur-gecontroleerde kamer) beperkt de opnametijd tot enkele tientallen seconden. Deze beperking kan echter gemakkelijk worden overwonnen door het opnieuw kalibreren van de fase offsets tijdens een lange-termijn meting. Brekingsindex heterogeniteit van het preparaat leidt ook tot ongewenste fasefouten van het interferentiepatroon, die in dit geval ruimte-afhankelijk zijn. Om deze fouten tot aanvaardbare waarden te beperken, mogen de door brekingsindexheterogeniteit veroorzaakte golffrontvervormingen niet groter zijn dan enkele tientallen nanometers. Wij verwachten dat de eisen voor HELM niet veel verschillen van die welke een beeldvorming met hoge resolutie garanderen met goed gecorrigeerde hoge NA objectieven in standaard microscopie. Verdere experimentele gegevens zullen nodig zijn om de gevoeligheid van HELM tegen brekingsindex heterogeniteit in de praktijk te bestuderen.
Voor veel toepassingen is het onderzoeken van de driedimensionale structuur van het preparaat van groot belang. Drie-dimensionale beeldgegevens kunnen worden verkregen door het stappen van de focus door de gelabelde (16) of ongelabelde specimen (17, 18). Helaas is de axiale resolutie voor standaard fluorescentiemicroscopie sterk beperkt tot ongeveer 0,9 urn voor puntvormige objecten en, nog erger, kan volledig afbreken voor willekeurige objecten (19). Dit probleem komt overeen met het feit dat de driedimensionale OTF een ontbrekende kegel heeft rond de kz-as bij de oorsprong, en bijgevolg vertoont het resulterende driedimensionale beeld mogelijke artefacten. CFM, in tegenstelling, heeft geen ontbrekende kegel en maakt de verwerving van drie-dimensionale beelden met een axiale resolutie van ongeveer 0,8 micrometer (20), die echter nog steeds inferieur aan de laterale one.
Verschillende methoden zijn beschreven om de axiale resolutie verder te verbeteren. De zogenaamde 4π microscoop (21) is een afgeleide van de CFM met een tweede objectief om de fotonen te verzamelen die zich ook naar de achterzijde van de preparaatkamer voortplanten. De axiale resolutie kan theoretisch oplopen tot 100 nm, terwijl het laterale oplossend vermogen gelijk is aan dat van de CFM. De 4π microscoop is ook een scannende.
Een niet-scannende benadering wordt beschreven in refs. 22 en 23. Een sterk verhoogd axiaal scheidend vermogen wordt bereikt door middel van een interferentieveld dat zijn nodale en antinodale vlakken evenwijdig heeft aan het beeldvlak. Deze methode is zeer geschikt voor objecten die dunner zijn dan één periode van het excitatiepatroon. Beeldvorming van dikkere exemplaren kan resulteren in artefacten, omdat de resulterende passband nog steeds een ontbrekende kegel bij de oorsprong (9).
Een verdere ontwikkeling die aspecten van de laatste methode en 4π microscopie deelt werd onlangs aangetoond (I5M microscopie; ref. 24). I5M microscopie maakt gebruik van een meer ingewikkelde interferentie veld gegenereerd door een niet-coherente lichtbron selectief te verlichten het object vlak en is een niet-scannen methode. De axiale resolutie is gelijk aan die van 4π microscopie (100 nm), maar de laterale resolutie neemt in het geheel niet toe.
Een verbeterde axiale resolutie kan ook worden bereikt door het specimen te verlichten met een fringepatroon dat bijvoorbeeld wordt verkregen door een tralie op het object af te beelden (25) of door interferentie van twee laserbundels (26). Bij deze methoden verschilt het toegepaste reconstructie-algoritme aanzienlijk van het onze, omdat de centrale transmissiecirkel in fig. 4 wordt weggelaten en omdat de objectinformatie slechts in twee zijbanden wordt overgedragen (27). In dit geval kan worden aangetoond dat de onscherpte buiten het beeld wordt verminderd.
Wenselijk is een microscoop met een uniform hoge resolutie van 100 nm in alle ruimterichtingen zonder dat een scanmethode nodig is. HELM, zoals vastgesteld in onze huidige opstelling, verhoogt de axiale resolutie niet in vergelijking met standaard fluorescentiemicroscopie. Het sleutelidee is echter dat harmonische excitatie, samen met een reconstructie-algoritme dat lijkt op het hier beschrevene, ook werkt in ruimtelijke richtingen die niet evenwijdig zijn aan het objectvlak. Door gebruik te maken van harmonische intensiteitspatronen die hun nodale en antinodale vlakken in de juiste ruimterichtingen hebben, worden extra kopieën van de driedimensionale OTF verkregen in elke gewenste richting. Dergelijke extra passbandregio’s zouden kunnen worden overlapt tot één uitgebreide passband met een hoge afsnijfrequentie in de gehele reciproke ruimte.
Ons idee voor een toekomstige opstelling is het gebruik van continue bundelafbuigingseenheden (zoals galvanometers of akoestisch-optische apparaten) om gemakkelijk interferentiepatronen te produceren in geselecteerde oriëntaties in de ruimte en met verschillende knikafstanden. Een dergelijke configuratie zou driedimensionale beeldvorming mogelijk maken en tegelijkertijd de anisotropieproblemen oplossen die worden veroorzaakt door de klaverbladvormige tweedimensionale OTF.