Dyskusja
Jednym z ważnych parametrów w HELM jest kąt nachylenia wiązki α do osi optycznej, który określa częstotliwość przestrzenną wzbudzenia u. Na Rys. 4 widać, że wybór u wymaga przehandlowania maksymalnej częstotliwości odcięcia wzdłuż osi kx i ky vs. Wybrana wartość (55°) jest dobrym kompromisem i dodatkowo pozwala na bezpośrednią obserwację wzoru interferencyjnego za pomocą obiektywów immersyjnych.
Z powodu nieizotropowego pasma przepustowego, obrazy paciorków wykazują pewną anizotropię i przeostrzenie w pobliżu krawędzi paciorków; najbardziej zauważalne są ciemne strefy w kierunkach ukośnych na Rys. 2A. Efektu tego można w dużym stopniu uniknąć, stosując sześć lub osiem wiązek laserowych zorientowanych odpowiednio pod kątem wielokrotności 60° lub 45°.‡
W porównaniu z CFM, stosunek sygnału do szumu obrazu HELM jest lepszy, mimo że moc lasera zintegrowana w czasie była ponad 100 razy większa w przypadku obrazu CFM na Rys. 2C. Jednym z podstawowych powodów tej poprawy jest fakt, że zwiększenie rozdzielczości CFM w porównaniu ze standardową mikroskopią fluorescencyjną może być osiągnięte tylko poprzez zastosowanie małego otworka w torze światła emisyjnego (5, 13, 14). Takie rozwiązanie wymaga kompromisu pomiędzy poziomem szumu a rozdzielczością. I odwrotnie, w HELM wszystkie fotony wchodzące do obiektywów mogą być zbierane przez kamerę.
W badaniach obiektów dynamicznych szybkość obrazowania ma duże znaczenie. Podstawowym ograniczeniem szybkości obrazowania w mikroskopii fluorescencyjnej jest maksymalna szybkość emisji fluoroforów spowodowana skończonym czasem życia stanu wzbudzonego („nasycenie barwnika”; ref. 15). W HELM mniej więcej połowa fluoroforów jest oświetlona przez wzór interferencyjny w jednym czasie, podczas gdy w zwykłej jednopunktowej CFM, tylko niewielka część fluoroforów jest oświetlona w jednym czasie (≈1 na milion dla obrazu 1,024 × 1,024 pikseli). W konsekwencji, całkowity strumień fotonów z próbki jest ograniczony do wartości, które są o kilka rzędów wielkości mniejsze dla sekwencyjnego działania CFM niż dla równoległego działania HELM. Ponieważ minimalna liczba fotonów na obraz jest wymagana dla pewnego poziomu sygnału do szumu, HELM ma potencjał do pozyskiwania danych obrazowych znacznie szybciej niż CFM. Poza tym podstawowym aspektem, HELM redukuje problemy związane z prędkością mechanicznych mechanizmów skanowania, ponieważ wykonywanych jest tylko pięć skanów na obraz, w przeciwieństwie do CFM, gdzie wymagany jest jeden skan na linię. Zarówno problem nasycenia barwnika jak i mechaniczne trudności skanowania CFM, mogą być jednak zredukowane przez nowsze skanery wielopunktowe.
Zalety w dziedzinie szybkości obrazowania mogą być również widoczne w naszych danych eksperymentalnych. Całkowity czas akwizycji dla pięciu obrazów wymaganych dla HELM (ryc. 2A) wynosił 1,6 s w porównaniu z 6,5 s dla obrazu konfokalnego (ryc. 2C). Biorąc pod uwagę wyższy stosunek sygnału do szumu obrazu HELM, który jest osiągany za pomocą niechłodzonej kamery CCD klasy przemysłowej, różnica jest wyraźna.
Punktem o praktycznym znaczeniu jest wymagana stabilność wzoru interferencyjnego podczas pomiaru. Stwierdziliśmy, że błędy przesunięcia fazowego rzędu 1/10 odstępu węzłowego (20 nm) są po prostu tolerowane, ale większe błędy prowadzą do znacznego pogorszenia obrazu. Dryft termiczny naszego urządzenia (typowo 20 nm/min w pomieszczeniu o niekontrolowanej temperaturze) ogranicza czas akwizycji do kilkudziesięciu sekund. Ograniczenie to może być jednak łatwo pokonane poprzez rekalibrację offsetów fazowych podczas długotrwałych pomiarów. Niejednorodność współczynnika załamania światła w próbce również prowadzi do niepożądanych błędów fazowych wzorca interferencyjnego, które w tym przypadku są zależne od przestrzeni. Podobnie jak poprzednio, aby ograniczyć te błędy do tolerowanych wartości, zniekształcenia czoła fali wprowadzane przez niejednorodność współczynnika załamania nie powinny przekraczać kilkudziesięciu nanometrów. Oczekujemy, że wymagania stawiane HELM nie różnią się znacznie od tych, które gwarantują obrazowanie wysokiej rozdzielczości przy użyciu dobrze skorygowanych obiektywów o wysokiej NA w standardowej mikroskopii. Dalsze dane eksperymentalne będą potrzebne do zbadania czułości HELM na heterogeniczność współczynnika załamania światła w praktyce.
Dla wielu zastosowań, badanie trójwymiarowej struktury próbki jest głównym przedmiotem zainteresowania. Trójwymiarowe dane obrazowe mogą być uzyskane poprzez przesuwanie ogniska przez znakowaną (16) lub nie znakowaną próbkę (17, 18). Niestety, rozdzielczość osiowa dla standardowej mikroskopii fluorescencyjnej jest silnie ograniczona do około 0.9 μm dla obiektów punktowych i, co gorsza, może się całkowicie załamać dla obiektów arbitralnych (19). Problem ten odpowiada faktowi, że trójwymiarowy OTF ma brakujący stożek wokół osi kz w punkcie początkowym, a co za tym idzie, wynikowy obraz trójwymiarowy wykazuje potencjalne artefakty. CFM natomiast nie posiada brakującego stożka i umożliwia akwizycję obrazów trójwymiarowych z rozdzielczością osiową około 0,8 μm (20), która jednak nadal jest gorsza od bocznej.
Opisano różne metody pozwalające na dalszą poprawę rozdzielczości osiowej. Tak zwany mikroskop 4π (21) jest pochodną CFM z drugim obiektywem do zbierania fotonów propagujących w kierunku tylnej strony komory preparatu. Rozdzielczość osiowa teoretycznie może wynosić nawet 100 nm, podczas gdy rozdzielczość boczna jest równa CFM. Mikroskop 4π jest również mikroskopem skaningowym.
Podejście nie skaningowe jest opisane w ref. 22 i 23. Silnie zwiększona zdolność rozdzielania osiowego jest osiągana za pomocą pola interferencyjnego, którego płaszczyzny węzłowe i antywęzłowe są równoległe do płaszczyzny obrazu. Metoda ta jest dobrze dostosowana do obiektów, które są cieńsze niż jeden okres wzorca wzbudzenia. Obrazowanie grubszych próbek może skutkować artefaktami, ponieważ wynikowe pasmo przepustowe nadal ma brakujący stożek na początku (9).
Dalszy rozwój, który dzieli aspekty tej ostatniej metody i mikroskopii 4π został zademonstrowany ostatnio (mikroskopia I5M; ref. 24). Mikroskopia I5M wykorzystuje bardziej skomplikowane pole interferencyjne generowane przez niekoherentne źródło światła do selektywnego oświetlania płaszczyzny obiektu i jest metodą nieskaningową. Rozdzielczość osiowa jest równa tej w mikroskopii 4π (100 nm), ale rozdzielczość boczna nie jest w ogóle zwiększona.
Większą rozdzielczość osiową można również osiągnąć poprzez oświetlanie próbki wzorem frędzlowym wytworzonym, na przykład, przez obrazowanie siatki na obiekcie (25) lub przez interferencję dwóch wiązek laserowych (26). W przypadku tych metod stosowany algorytm rekonstrukcji różni się znacznie od naszego, ponieważ pomijane jest centralne koło transmisyjne na Rys. 4, a informacja o obiekcie przekazywana jest tylko w dwóch pasmach bocznych (27). Można wykazać, w tym przypadku, że nieostre rozmycie jest zredukowane.
Pożądany jest mikroskop o jednolicie wysokiej rozdzielczości 100 nm we wszystkich kierunkach przestrzeni bez konieczności stosowania metody skanowania. HELM, jak ustalono w naszej obecnej konfiguracji, nie zwiększa rozdzielczości osiowej w porównaniu ze standardową mikroskopią fluorescencyjną. Kluczową ideą jest jednak to, że wzbudzenie harmoniczne, wraz z algorytmem rekonstrukcji podobnym do opisanego tutaj, działa również w kierunkach przestrzennych nie równoległych do płaszczyzny obiektu. Poprzez zastosowanie harmonicznych wzorców intensywności, które mają swoje płaszczyzny węzłowe i antywęzłowe w odpowiednich kierunkach przestrzennych, uzyskuje się dodatkowe kopie trójwymiarowej OTF w dowolnym pożądanym kierunku. Takie dodatkowe regiony pasmowe mogłyby zostać nałożone na jedno rozszerzone pasmo o wysokiej częstotliwości odcięcia w całej przestrzeni wzajemnej.
Nasz pomysł na przyszłą konfigurację polega na wykorzystaniu jednostek odchylania wiązki ciągłej (jak galwanometry lub urządzenia akustyczno-optyczne) do łatwego wytwarzania wzorów interferencyjnych w wybranych orientacjach w przestrzeni i z różnymi odstępami między węzłami. Taka konfiguracja umożliwiłaby obrazowanie trójwymiarowe i jednocześnie rozwiązałaby problemy anizotropii spowodowane dwuwymiarowym OTF w kształcie liścia koniczyny.