Discussão
Um parâmetro importante em HELM é o ângulo do feixe α para o eixo óptico, que determina a frequência espacial de excitação u. Na Fig. 4, pode ser visto que a escolha de u requer a troca da frequência máxima de corte ao longo do eixo kx e ky vs. anisotropia da banda passante resultante.
O valor escolhido (55°) é um bom compromisso e, adicionalmente, permite a observação direta do padrão de interferência com objetivos de imersão.
Por causa da banda passante não isotrópica, as imagens dos grânulos mostram alguma anisotropia e um overhooting próximo às bordas dos grânulos; mais notáveis são as zonas escuras nas direções diagonais na Fig. 2A. Este efeito poderia ser evitado em grande parte utilizando seis ou oito feixes laser orientados em múltiplos de 60° ou 45°, respectivamente.‡
Comparado com CFM, a relação sinal/ruído da imagem HELM é superior, embora a potência do laser integrado tenha sido mais de 100 vezes superior para a imagem CFM na Fig. 2C. Uma razão fundamental para esta melhoria reside no facto de o melhoramento da resolução do CFM em comparação com a microscopia de fluorescência padrão só poder ser alcançado utilizando um pequeno orifício no percurso da luz de emissão (5, 13, 14). Este arranjo exige a troca do nível de ruído por resolução. Por outro lado, no HELM, todos os fotões que entram nas lentes podem ser recolhidos pela câmara.
Para estudos de objectos dinâmicos, a velocidade da imagem é da maior importância. A limitação fundamental da velocidade de imagem em microscopia de fluorescência é dada pela taxa máxima de emissão dos fluoróforos causada pela vida útil finita do estado excitado (“saturação do corante”; ref. 15). No HELM, cerca de metade dos fluoróforos são iluminados pelo padrão de interferência de uma só vez, enquanto que no CFM comum de ponto único, apenas uma pequena fracção dos fluoróforos é iluminada de uma só vez (≈1 por milhão para uma imagem de 1.024 × 1.024 pixel). Como consequência, o fluxo total de fotões da amostra é limitado a valores que são várias ordens de magnitude menores para a operação sequencial do CFM do que para a operação paralela do HELM. Como é necessário um número mínimo de fotões por imagem para um determinado nível de sinal-ruído, o HELM tem o potencial de adquirir dados de imagem muito mais rapidamente do que o CFM. Além desta consideração fundamental, o HELM reduz os problemas de velocidade ligados aos mecanismos mecânicos de varredura, pois apenas cinco varreduras por imagem são realizadas em contraste com o CFM, onde uma varredura por linha é necessária. Tanto o problema de saturação de corante como as dificuldades de varredura mecânica do CFM, no entanto, podem ser reduzidos pelos mais novos scanners multiponto.
As vantagens no campo da velocidade de varredura também podem ser vistas em nossos dados experimentais. O tempo total de aquisição das cinco imagens necessárias para o HELM (Fig. 2A) foi de 1,6 s em comparação com 6,5 s para a imagem confocal (Fig. 2C). Considerando a maior relação sinal/ruído da imagem HELM que é obtida com uma câmera CCD de grau industrial não refrigerada, a diferença é clara.
Um ponto de interesse prático é a estabilidade necessária do padrão de interferência durante a medição. Descobrimos que erros de deslocamento de fase de 1/10 do espaçamento nodal (20 nm) são apenas toleráveis, mas erros maiores levam a deteriorações significativas da imagem. O desvio térmico da nossa configuração (normalmente 20 nm/min em uma sala sem temperatura controlada) limita o tempo de aquisição a várias dezenas de segundos. Esta limitação, no entanto, poderia ser facilmente superada através da recalibragem dos offsets de fase durante uma medição a longo prazo. A heterogeneidade do índice de refração da amostra também leva a erros de fase indesejados do padrão de interferência, que dependem do espaço, neste caso. Como antes, para limitar esses erros a valores toleráveis, as distorções de frente de onda introduzidas pela heterogeneidade do índice de refração não devem exceder algumas dezenas de nanômetros. Esperamos que os requisitos aplicáveis ao HELM não difiram muito daqueles que garantem imagens de alta resolução com objetivos de NA elevados e bem corrigidos em microscopia padrão. Outros dados experimentais serão necessários para estudar a sensibilidade do HELM contra a heterogeneidade do índice de refração na prática.
Para muitas aplicações, a investigação da estrutura tridimensional do espécime é de grande interesse. Os dados da imagem tridimensional podem ser adquiridos através de um passo do foco através do espécime rotulado (16) ou não rotulado (17, 18). Infelizmente, a resolução axial para microscopia de fluorescência padrão é fortemente limitada a cerca de 0,9 μm para objetos pontiagudos e, pior ainda, pode quebrar completamente para objetos arbitrários (19). Este problema corresponde ao fato de que a OTF tridimensional tem um cone ausente em torno do eixo kz na origem e, consequentemente, a imagem tridimensional resultante mostra artefatos potenciais. A CFM, ao contrário, não tem cone ausente e permite a aquisição de imagens tridimensionais com resolução axial de cerca de 0,8 μm (20), que, no entanto, ainda é inferior à lateral.
Diferentes métodos foram descritos para melhorar ainda mais a resolução axial. O chamado microscópio 4π (21) é um derivado do CFM com um segundo objetivo de coletar os fótons que se propagam também para a parte de trás da câmara do espécime. A resolução axial teoricamente pode ser de até 100 nm, enquanto a potência de resolução lateral é igual à do CFM. O microscópio 4π também é um microscópio de varredura.
Uma abordagem sem varredura é descrita em refs. 22 e 23. Uma capacidade de separação axial fortemente aumentada é obtida por meio de um campo de interferência que tem seus planos nodal e antinodal paralelo ao plano da imagem. Este método é bem adequado para objetos que são mais finos do que um período do padrão de excitação. A imagem de espécimes mais espessos pode resultar em artefatos, porque a banda passante resultante ainda tem um cone ausente na origem (9).
Um desenvolvimento posterior que compartilha aspectos deste último método e 4π microscopia foi demonstrado recentemente (microscopia I5M; ref. 24). A microscopia I5M emprega um campo de interferência mais complicado gerado por uma fonte de luz nãocoerente para iluminar seletivamente o plano do objeto e é um método não-digitalizante. A resolução axial é igual à da microscopia 4π (100 nm), mas a resolução lateral não é de todo aumentada.
Resolução axial aumentada também pode ser obtida iluminando a amostra com um padrão de franja produzido, por exemplo, pela imagem de uma grade sobre o objeto (25) ou por interferência de dois feixes de laser (26). Para estes métodos, o algoritmo de reconstrução aplicado difere significativamente do nosso, porque o círculo de transmissão central na Fig. 4 é omitido e porque a informação do objeto é transferida apenas em duas bandas laterais (27). Pode-se mostrar, neste caso, que o desfocamento desfocado é reduzido.
Desejável é um microscópio com uma resolução uniformemente alta de 100 nm em todas as direções espaciais, sem a necessidade de um método de varredura. O HELM, como estabelecido em nossa configuração atual, não aumenta a resolução axial em comparação com o microscópio de fluorescência padrão. No entanto, a ideia chave é que a excitação harmónica, juntamente com um algoritmo de reconstrução semelhante ao aqui descrito, também funciona em direcções espaciais não paralelas ao plano do objecto. Usando padrões de intensidade harmônica que têm seus planos nodal e antinodal em direções espaciais apropriadas, cópias adicionais da OTF tridimensional são obtidas em qualquer direção desejada. Essas regiões adicionais de banda passante poderiam ser sobrepostas a uma banda passante estendida com uma alta freqüência de corte em todo o espaço recíproco.
Nossa idéia para uma configuração futura é usar unidades de deflexão de feixe contínuo (como galvanômetros ou dispositivos acústico-ópticos) para produzir padrões de interferência facilmente em orientações selecionadas no espaço e com vários espaçamentos nodais. Tal configuração permitiria a geração de imagens tridimensionais e, simultaneamente, resolver os problemas de anisotropia causados pela OTF bidimensional em forma de trevo.