Discuție
Un parametru important în HELM este unghiul α al fasciculului față de axa optică, care determină frecvența spațială a excitației u. În Fig. 4, se poate observa că alegerea lui u necesită negocierea frecvenței maxime de tăiere de-a lungul axei kx și ky vs. frecvența maximă de tăiere. anizotropia benzii pasante rezultate.
Valoarea aleasă (55°) este un compromis bun și, în plus, permite observarea directă a modelului de interferență cu obiective de imersie.
Din cauza benzii pasante neizotrope, imaginile bilelor prezintă o anumită anizotropie și o supradimensionare în apropierea marginilor bilelor; cele mai vizibile sunt zonele întunecate în direcțiile diagonale din Fig. 2A. Acest efect ar putea fi evitat în mare măsură prin utilizarea a șase sau opt fascicule laser orientate în multipli de 60° sau, respectiv, 45°.‡
În comparație cu CFM, raportul semnal-zgomot al imaginii HELM este superior, chiar dacă puterea laser integrată în timp a fost de peste 100 de ori mai mare pentru imaginea CFM din Fig. 2C. Un motiv fundamental pentru această îmbunătățire constă în faptul că îmbunătățirea rezoluției CFM în comparație cu microscopia cu fluorescență standard poate fi obținută numai prin utilizarea unui mic orificiu în calea luminii de emisie (5, 13, 14). Acest aranjament necesită un compromis între nivelul de zgomot și rezoluție. Dimpotrivă, în HELM, toți fotonii care intră în lentile pot fi colectați de cameră.
Pentru studiile obiectelor dinamice, viteza de imagistică este de o importanță majoră. Limitarea fundamentală a vitezei de imagistică în microscopia de fluorescență este dată de rata maximă de emisie a fluoroforilor cauzată de durata de viață finită a stării excitate („saturația colorantului”; ref. 15). În HELM, aproximativ jumătate din fluorofori sunt iluminați de modelul de interferență în același timp, în timp ce, în cazul obișnuit al CFM cu un singur punct, doar o fracțiune infimă din fluorofori este iluminată în același timp (≈1 la un milion pentru o imagine de 1 024 × 1 024 pixeli). În consecință, fluxul total de fotoni de la specimen este limitat la valori care sunt cu câteva ordine de mărime mai mici pentru funcționarea secvențială a CFM decât pentru cea paralelă a HELM. Deoarece este necesar un număr minim de fotoni pe imagine pentru un anumit nivel de semnal/zgomot, HELM are potențialul de a achiziționa date de imagine mult mai rapid decât CFM. Pe lângă acest considerent fundamental, HELM reduce problemele de viteză legate de mecanismele mecanice de scanare, deoarece sunt efectuate doar cinci scanări pe imagine, spre deosebire de CFM, unde este necesară o scanare pe linie. Cu toate acestea, atât problema saturației colorantului, cât și dificultățile de scanare mecanică ale CFM pot fi reduse de noile scanere multipunct.
Vantajele în domeniul vitezei de imagistică pot fi observate, de asemenea, în datele noastre experimentale. Timpul total de achiziție pentru cele cinci imagini necesare pentru HELM (Fig. 2A) a fost de 1,6 s, comparativ cu 6,5 s pentru imaginea confocală (Fig. 2C). Ținând cont de raportul semnal-zgomot mai mare al imaginii HELM care se obține cu o cameră CCD de calitate industrială nerăcită, diferența este clară.
Un punct de interes practic este stabilitatea necesară a modelului de interferență în timpul măsurătorii. Am constatat că erorile de decalaj de fază de 1/10 din distanța nodală (20 nm) sunt doar tolerabile, dar erorile mai mari duc la deteriorări semnificative ale imaginii. Deriva termică a instalației noastre (de obicei, 20 nm/min într-o cameră fără control al temperaturii) limitează timpul de achiziție la câteva zeci de secunde. Cu toate acestea, această limitare ar putea fi depășită cu ușurință prin recalibrarea decalajelor de fază în timpul unei măsurători pe termen lung. Heterogenitatea indicelui de refracție al specimenului conduce, de asemenea, la erori de fază nedorite ale modelului de interferență, care sunt dependente de spațiu în acest caz. Ca și înainte, pentru a limita aceste erori la valori tolerabile, distorsiunile frontului de undă introduse de eterogenitatea indicelui de refracție nu ar trebui să depășească câteva zeci de nanometri. Ne așteptăm ca cerințele care se aplică la HELM să nu difere prea mult de cele care garantează obținerea de imagini de înaltă rezoluție cu obiective de înaltă NA bine corectate în microscopia standard. Vor fi necesare date experimentale suplimentare pentru a studia sensibilitatea HELM față de eterogenitatea indicelui de refracție în practică.
Pentru multe aplicații, investigarea structurii tridimensionale a specimenului prezintă un interes major. Datele imaginii tridimensionale pot fi obținute prin deplasarea focalizării prin specimenul marcat (16) sau neetichetat (17, 18). Din păcate, rezoluția axială pentru microscopia standard cu fluorescență este puternic limitată la aproximativ 0,9 μm pentru obiecte punctiforme și, chiar mai rău, se poate întrerupe complet pentru obiecte arbitrare (19). Această problemă corespunde faptului că OTF tridimensională are un con lipsă în jurul axei kz la origine și, în consecință, imaginea tridimensională rezultată prezintă potențiale artefacte. CFM, în schimb, nu are niciun con lipsă și permite achiziția de imagini tridimensionale cu o rezoluție axială de aproximativ 0,8 μm (20), care, cu toate acestea, este încă inferioară celei laterale.
Au fost descrise diferite metode pentru a îmbunătăți în continuare rezoluția axială. Așa-numitul microscop 4π (21) este un derivat al CFM cu un al doilea obiectiv pentru a colecta și fotonii care se propagă spre partea din spate a camerei specimenului. Rezoluția axială poate fi, teoretic, de până la 100 nm, în timp ce puterea de rezoluție laterală este egală cu cea a CFM. Microscopul 4π este, de asemenea, unul de scanare.
O abordare fără scanare este descrisă în ref. 22 și 23. O capacitate de separare axială puternic crescută este obținută prin intermediul unui câmp de interferență care are planurile sale nodale și antinodale paralele cu planul imaginii. Această metodă este bine adaptată obiectelor care sunt mai subțiri decât o perioadă a modelului de excitație. Imagistica specimenelor mai groase poate duce la apariția unor artefacte, deoarece banda de trecere rezultată are încă un con lipsă la origine (9).
O altă dezvoltare care împărtășește aspecte ale acestei din urmă metode și ale microscopiei 4π a fost demonstrată recent (microscopia I5M; ref. 24). Microscopia I5M utilizează un câmp de interferență mai complicat generat de o sursă de lumină necoerentă pentru a ilumina selectiv planul obiectului și este o metodă fără scanare. Rezoluția axială este egală cu cea a microscopiei 4π (100 nm), dar rezoluția laterală nu este deloc crescută.
Rezoluția axială îmbunătățită poate fi, de asemenea, obținută prin iluminarea specimenului cu un model de franje produs, de exemplu, prin formarea imaginii unui grilaj pe obiect (25) sau prin interferența a două fascicule laser (26). Pentru aceste metode, algoritmul de reconstrucție aplicat diferă semnificativ de al nostru, deoarece cercul central de transmisie din figura 4 este omis și deoarece informația despre obiect este transferată doar în două benzi laterale (27). Se poate demonstra, în acest caz, că neclaritatea din afara focalizării este redusă.
Deziderabil este un microscop cu o rezoluție uniform de înaltă de 100 nm în toate direcțiile spațiale, fără a fi nevoie de o metodă de scanare. HELM, așa cum a fost stabilit în configurația noastră actuală, nu mărește rezoluția axială în comparație cu microscopia standard cu fluorescență. Cu toate acestea, ideea cheie este că excitarea armonică, împreună cu un algoritm de reconstrucție similar cu cel descris aici, funcționează și în direcții spațiale care nu sunt paralele cu planul obiectului. Prin utilizarea unor modele de intensitate armonică care au planurile lor nodale și antinodale în direcții spațiale corespunzătoare, se obțin copii suplimentare ale OTF tridimensionale în orice direcție dorită. Astfel de regiuni suplimentare ale benzii de trecere ar putea fi suprapuse la o bandă de trecere extinsă cu o frecvență de tăiere ridicată în tot spațiul reciproc.
Ideea noastră pentru o configurație viitoare este de a utiliza unități de deviere continuă a fasciculului (cum ar fi galvanometre sau dispozitive acustico-optice) pentru a produce cu ușurință modele de interferență în orientări selectate în spațiu și cu diferite distanțe nodale. O astfel de configurație ar permite obținerea de imagini tridimensionale și, simultan, ar rezolva problemele de anizotropie cauzate de OTF bidimensională în formă de trifoi.
.