Alai

Mecanica învelișurilor subțiri în formă de tije

Creșterea în formă de tije necesită, în cele din urmă, o ruptură de simetrie, care poate apărea din cauza direcționalității proprietăților materiale ale peretelui celular, a tensiunilor, a organizării mașinăriei de sinteză sau a oricărei combinații a acestora. Modelele fizice pentru morfogeneza celulelor cu pereți consideră celula ca fiind un înveliș viscoelastic subțire, care este umflat uniform din interior prin presiunea turgescenței. Pentru a prezice forma celulei care rezultă dintr-un anumit mecanism de creștere, este esențial să se ia în considerare distribuția forțelor datorate presiunii de turgescență, forțele de contrabalansare ale întinderii peretelui și modul în care proprietățile materiale ale peretelui cuplează aceste forțe cu gradul de extindere. Pentru un material elastic liniar, tensiunea σ (forța pe unitatea de suprafață) este legată de deformația mecanică ε (întinderea fracționată) prin intermediul modulului lui Young:

o măsură a rigidității intrinseci a materialului similară cu constanta de forță k a unui resort (pentru care legea lui Hooke dictează că k = F/x, unde F este forța necesară pentru întinderea resortului cu o valoare x). Într-o cochilie subțire elastică, tensiunile ar trebui să crească odată cu creșterea razei celulei r și a presiunii de turgescență P, și să scadă odată cu creșterea grosimii peretelui celulei d. Într-o cochilie sferică, tensiunile sunt egale în toate direcțiile. În schimb, geometria unei cochilii cilindrice impune ca tensiunile circumferențiale (σ r ) să fie de două ori mai mari decât tensiunile longitudinale (σ l ) (figura 1c):

Combinând ecuațiile 1 și 2, aceste relații model prevăd că tensiunile circumferențiale și longitudinale (ε r și, respectiv, ε l ) ar trebui să depindă în mod liniar de lățime și de presiunea de turgescență și în mod invers de grosimea peretelui. Dacă modulul lui Young este egal în toate direcțiile (izotropie mecanică), atunci ε r ar trebui să fie de două ori mai mare decât ε l .

Această relație dintre deformațiile în diferite direcții a fost utilizată pentru a sonda proprietățile mecanice ale peretelui celular al celulelor în formă de tijă. La drojdia de fisiune, măsurarea gradului de contracție a celulelor atunci când presiunea de turgescență este redusă relevă acest raport de deformare prezis de 2:1, sugerând că peretele celular din aceste celule se comportă ca un material izotrop (Atilgan și Chang, observații nepublicate). În schimb, la bacteriile în formă de tijă, cum ar fi E. coli și B. subtilis, celulele prezintă un grad mai mare de întindere longitudinală decât radială , ceea ce indică anizotropie mecanică (sau dependență direcțională), cu o rigiditate mai mare în direcția circumferențială în raport cu cea longitudinală . Aceste observații sunt în concordanță cu tomogramele crio-electronice care arată că peretele celular al E. coli este organizat cu componentele mai rigide (firele de glicani) orientate de-a lungul direcției circumferențiale . Va fi interesant de descoperit dacă există anizotropie mecanică în pereții celulari ai plantelor sau dacă aceștia se aseamănă mai mult cu peretele celular al drojdiei de fisiune.

Este important de remarcat că anizotropia creșterii (alungirea de-a lungul unei singure axe) poate avea loc folosind fie un material de perete anizotrop, fie unul izotrop; de fapt, materialul izotrop poate fi folosit pentru a construi practic orice formă celulară. În plus, proprietățile mecanice ale peretelui celular pot fi mult mai complexe decât relațiile simple de scalare pe care le-am descris mai sus. De exemplu, relația dintre tensiuni și tensiuni nu va mai urma ecuația 1 la tensiuni suficient de mari; măsurătorile recente ale microscopiei de forță atomică indică faptul că peretele celular E. coli prezintă proprietăți neliniare în starea sa presurizată, care pot ajuta celula să reziste la expansiune în timpul șocului hipoosmotic . Ipoteza unei grosimi constante de-a lungul învelișului subțire poate, de asemenea, să cedeze, în special în timpul septației, din cauza diferențelor în modul de construcție a peretelui la nivelul septului . În cele din urmă, aceste caracteristici mecanice trebuie să fie integrate cu modelele de inserție și remodelare a peretelui, care pot modifica atât grosimea peretelui celular, cât și să conducă la un răspuns viscoelastic în care materialul peretelui curge ca un lichid vâscos atunci când este solicitat. Acest lucru produce o gamă diversă de mecanisme potențiale de creștere în celulele cu pereți. Modelele biofizice pot oferi predicții testabile pentru relațiile dintre presiunea de turgescență, modelele de creștere și distribuția tulpinilor și a ratei de creștere pe suprafața celulară ,,

Creștere prin alungire cilindrică

La multe bacterii, creșterea celulară se realizează prin inserția de material nou de perete celular în locuri din întreaga parte cilindrică a peretelui celular, în timp ce inserția este diminuată la polii celulari. Cel mai bine studiat organism din perspectiva creșterii peretelui celular este E. coli, cu mai multe recenzii care se concentrează asupra biochimiei , mașinăriei de sinteză , morfologiei , și caracteristicilor fizice ale peretelui celular. La fel ca majoritatea bacteriilor, E. coli are un perete celular compus din peptidoglican, o rețea macromoleculară de fire de zahăr (glicani) reticulate de peptide scurte. După cum s-a menționat mai sus, firele de glican mai rigide sunt orientate circumferențial , ceea ce face ca peretele celular să fie anizotrop din punct de vedere mecanic, pe lângă anizotropia de creștere a formei de tijă. Proteina citoscheletală MreB, un omolog al actinei eucariote , se deplasează într-o manieră aproximativ circumferențială de-a lungul feței interioare a membranei citoplasmatice, iar antibioticul mecillinam, care țintește peretele celular, inhibă această mișcare, sugerând un model în care urmele MreB indică căile de inserție a noului material pe peretele lateral ,. Mai mult, celulele E. coli se răsucesc pe măsură ce se alungesc într-un mod dependent de MreB, datorită orientării șirurilor de glicani cu o ușoară înclinație unghiulară în afara direcției circumferențiale . La B. subtilis, a fost observată o cuplare similară a mișcării MreB la sinteza peretelui celular , precum și la răsucirea (cu sens opus), ceea ce sugerează existența unor reguli comune cu E. coli pentru stabilirea ordinii în interiorul peretelui, în ciuda diferenței de grosime a acestuia. Nu se știe dacă modelul de inserție a peretelui celular ghidat de MreB ajută, de asemenea, celula să își determine și/sau să își mențină lățimea în timpul creșterii, deși mutațiile în mreB pot avea ca rezultat tije de diferite dimensiuni .

O consecință prezisă a alungirea cilindrică este creșterea exponențială, în care celulele lungi unice cresc mai repede decât cele scurte. Într-adevăr, celulele E. coli se alungesc exponențial atunci când diviziunea este blocată , și par să facă acest lucru și în timpul creșterii și diviziunii normale . Creșterea exponențială ar putea fi așteptată de la un organism a cărui zonă de creștere crește proporțional cu creșterea celulei; în mod interesant, natura creșterii exponențiale (L = L02t/τ, unde τ este timpul de dublare) impune ca 1/L (dL/dt) = (ln 2)/τ să fie constantă independent de L, ceea ce indică faptul că nu există o scară de lungime preferată pentru un timp de dublare dat.

E. coli, împreună cu bacteria curbată Caulobacter crescentus, a fost un subiect principal al studiilor teoretice și computaționale privind morfogeneza bacteriană. Modelele s-au încadrat în două clase largi și complementare: simulări de dinamică moleculară cu granulație grosieră ale mecanicii peretelui și ale creșterii, motivate de mecanismele ipotezate de coordonare moleculară și/sau de măsurătorile experimentale ale modelelor de inserție a peretelui celular ,,; și modele mecanochimice cu elemente finite care încorporează remodelarea peretelui cu relaxare mecanică pentru a prezice instabilitățile potențiale și relațiile de scalare între dimensiunile celulare și parametrii de creștere ,-. Un model care ia în considerare echilibrul dintre energia chimică eliberată în timpul inserției și modificarea energiei de deformare datorată noii geometrii după creștere prezice o lățime stabilă și o rată de creștere pentru creșterea în formă de tijă care este în concordanță cu măsurătorile efectuate la E. coli și B. subtilis pentru alegeri rezonabile ale parametrilor . Simulările bazate pe acest model sugerează că MreB exercită o forță interioară asupra peretelui celular, împiedicând instabilitățile în creștere datorate presiunii turgescente . Modelele computaționale au sugerat, în general, că determinarea robustă a formei necesită coordonarea încorporării peretelui celular ,, iar simulările la scară moleculară sugerează că mișcarea MreB poate contribui la menținerea lățimii celulei de-a lungul corpului celular, în special în timpul perturbațiilor, cum ar fi șocul osmotic .

Creșterea prin extinderea vârfului celulei

În contrast cu E. coli, unele celule în formă de tijă cresc prin inserția unui nou perete celular și a membranei la vârfurile celulelor, în timp ce peretele lateral este relativ inert. Mecanismele de creștere a vârfurilor au fost studiate la multe organisme cu pereți, inclusiv la S. pombe, ciuperci cu hifă, mușchi și tuburi de polen, precum și la bacterii precum A. tumefaciens. În general, se consideră că creșterea vârfului este determinată de o presiune turgescență ridicată care extinde peretele celular la vârf, cuplată cu adăugarea de material nou și remodelarea materialului vechi de către o varietate de factori intracelulari (figura 1b).

Modelele fizice de creștere a vârfului au postulat că o formă de tijă este formată prin inserția unui perete mai moale, asemănător unui gel, chiar la vârful celulei, care apoi se maturizează într-o rețea mai rigidă pe laturile celulelor ,-. Parametrii morfogenetici care definesc forma vârfului celulei sunt apoi interrelaționați prin echilibrul dintre maturare, presiune și inserție, cu conservarea masei ca o constrângere. Unele modele biofizice generalizate de creștere a vârfului au fost abstractizate dincolo de detaliile moleculare și de structura unui anumit sistem și, prin urmare, au fost utile pentru a furniza legi de scalare care relaționează forma vârfului, dimensiunea celulei și rata de creștere, care pot fi testate și validate cu ajutorul unor studii comparative între specii (figura 2) . Într-un studiu recent, se preconizează că raza maximă de curbură a vârfului R A se măsoară cu 1/P, în timp ce raza celulei se măsoară cu (a2/P)1/3, unde a este dimensiunea regiunii în care se secretă material nou. Se obține astfel un raport între cele două cantități:

unde R și R A sunt ușor de măsurat din imagini ale celulelor. În acest model, se presupune că vâscozitatea peretelui este o funcție fixă a unghiului din jurul vârfului celulei, independentă de alți parametri; rămâne de văzut cât de sensibile sunt predicțiile la această ipoteză. Cu toate acestea, este intrigant faptul că diferite specii de ciuperci și tuburi de polen de plante prezintă toate o relație liniară între R și R A (R A /R constantă); astfel, dacă ecuația 3 este valabilă, atunci aceste date implică faptul că dimensiunea a a zonei de inserție se scalează, de asemenea, cu R, iar speciile strâns înrudite au chiar pante similare . În concordanță cu aceste modele, în tuburile de polen și în S. pombe, sintazele peretelui celular sunt localizate la vârfurile celulelor în creștere, unde introduc noul material de perete. În tuburile de polen, măsurătorile prin microscopie de forță atomică au evidențiat un gradient de rigiditate a peretelui celular, în care peretele de la apex este cel mai moale. Deși astfel de măsurători nu au fost efectuate la drojdia de fisiune, colorațiile peretelui, cum ar fi albul de calcofluor, sugerează, de asemenea, un gradient de rigiditate a peretelui celular ,,,. În plus, modelele de migrare a markerilor fiduciali de-a lungul celulei în timpul creșterii sunt în concordanță cu modelele mecanice de expansiune a unei emisfere într-un cilindru ,,, ilustrând utilitatea imagisticii modelelor dinamice de creștere pentru sondarea mecanismelor morfogenetice ,,.

În S. pombe, au fost identificate rețele moleculare complexe care modulează forma celulei și, prin urmare, pot fi implicate la un anumit nivel în reglarea mașinăriei peretelui celular. Procesele celulare cheie de bază includ exocitoza, endocitoza, citoscheletele de actină și microtubuli și GTPaze mici, cum ar fi Rho și Cdc42 (a se vedea pentru o analiză). Cdc42 poate regla traficul de actină și de membrană pentru a direcționa veziculele secretorii care conțin sintaze ale peretelui celular, precursori ai peretelui celular și membrană către locul de creștere (figura 1b) . Deși se crede că atât actina, cât și microtubulii exercită forțe care împing și deformează membrana plasmatică în celulele animale, există puține dovezi că aceștia modelează celulele cu pereți prin exercitarea directă de forțe . În schimb, actina joacă cel puțin două roluri critice în creșterea celulelor polarizate: ca trasee pentru transportul pe bază de miozină al veziculelor către vârful celulei și pentru endocitoză . Microtubulii au un rol direct în transportul polarizat al veziculelor în unele ciuperci, cum ar fi Aspergillus și Ustilago,. În S. pombe, microtubulii joacă un rol reglator în polaritate prin depunerea proteinelor Tea care reglează actina și Cdc42 la vârfurile celulelor , și pot direcționa formarea unei ramificații în anumite circumstanțe ,. Modelele matematice au explorat modul în care proteinele Tea acționează ca repere pentru a stabili gradienți de Cdc42 activat ,. În mod interesant, s-a observat că activitatea Cdc42 oscilează între cele două vârfuri celulare cu o scală de timp de aproximativ cinci minute, care poate fi modelată folosind bucle de feedback pozitiv și negativ . Nu se știe dacă creșterea drojdiei de fisiune variază în funcție de aceste oscilații Cdc42, deși tuburile de polen și unele ciuperci hifale prezintă o creștere a vârfurilor în impulsuri oscilatorii . Mai mult, unii mutanți cu activitate Cdc42 modificată prezintă lățimi celulare modificate, sugerând un model în care un gradient al activității Cdc42 la vârfurile celulelor este utilizat pentru a specifica lățimea tijei ,,. Modul în care modelele spațiale ale factorilor de polaritate, cum ar fi Cdc42, controlează forma celulei prin creșterea peretelui celular, rămâne puțin înțeles.

Dimensiunile tijelor

Dimensiunile celulare, cum ar fi lățimea, lungimea și grosimea peretelui celular, variază foarte mult la diferite organisme, având un impact potențial asupra distribuției tensiunilor și, prin urmare, asupra formei celulare rezultate . Astfel, cuantificarea distribuției acestor dimensiuni celulare, împreună cu caracteristicile morfologice, cum ar fi profilul de curbură al corpului și vârfului celulei, va fi esențială pentru studierea și contrastarea mecanismelor de creștere . Recent au fost dezvoltate instrumente computaționale care permit analiza rapidă și automată a unor populații mari de celule cu o rezoluție subpixelară ,. Pentru a ilustra variabilitatea dimensiunilor absolute ale celulelor între speciile bacteriene și fungice, am imaginat celulele și am analizat formele lor folosind un cadru computațional comun bazat pe Matlab aplicat anterior la cuantificarea lățimii celulelor la bacterii (Figura 3a) . Aceste măsurători ne-au permis, de asemenea, să măsurăm curbura conturului celulei; am observat că în cazul celulelor conice (de exemplu, Schizosaccharomyces japonicus), laturile au rămas drepte, în timp ce polii aveau curburi diferite (Figura 3b). Raportul de aspect este aproximativ conservat la toate bacteriile studiate și la S. pombe, deși alte ciuperci, cum ar fi S. japonicus, au un raport de aspect ceva mai turtit.

Măsurătorile cantitative ale presiunii de turgescență și ale proprietăților peretelui celular sunt, de asemenea, esențiale pentru înțelegerea mecanismelor de determinare a formei celulelor. Deși presiunea de turgescență a fost măsurată direct în celulele mari ale plantelor ,,,, dimensiunile mai mici ale bacteriilor și drojdiilor au necesitat dezvoltarea unor metode indirecte de estimare a presiunii de turgescență ,,,,. Organismele cu pereți par să se dezvolte sub presiuni de turgescență de câteva până la zeci de atmosfere ,. În concordanță cu necesitatea de a suporta aceste tensiuni de turgescență, pereții lor au module Young de zeci până la sute de MPa (1 atm = 0,1 MPa) ,,, și se pot rigidiza sub presiune . Peretele celulei E. coli are un modul Young de 25 până la 100 MPa , iar celulele suportă o presiune de turgescență de aproximativ 1 atm ,. Este interesant faptul că celulele B. subtilis au presiuni de turgescență de aproximativ 10 ori mai mari decât cele ale E. coli, iar pereții lor au un modul de Young similar, dar sunt de 10 ori mai groase , ceea ce sugerează că, probabil, formele lor similare ar putea apărea printr-un echilibru mecanic comun al presiunii de turgescență și al tensiunilor din perete . Estimări recente ale celulelor S. pombe plasează modulul Young la aproximativ 50 MPa și presiunea de turgescență la 10 până la 15 atm (datele noastre nepublicate).

Modul în care este specificată dimensiunea absolută a celulei este necunoscut la orice tip de celulă și rămâne una dintre întrebările nerezolvate în morfogeneză. Cum își specifică celulele dimensiunile și cum este o anumită dimensiune (ca și forma celulei) avantajoasă din punct de vedere evolutiv? Este clar că multe celule își mențin cu strictețe dimensiunea pe măsură ce cresc și se divid folosind mecanisme homeostatice ,. De exemplu, unele celule se angajează în diviziune sau în replicarea ADN-ului numai după ce au atins o dimensiune minimă a celulei, ceea ce sugerează că acestea au capacitatea de a-și simți propria dimensiune sau geometrie. Celulele S. pombe cresc până la 14 μm în lungime înainte de a intra în mitoză și de a se diviza. Progrese recente au identificat un sistem de factori corticali, inclusiv Cdr2 și Pom1, care par să monitorizeze suprafața celulei în acest proces . În cazul bacteriilor au fost propuși și factori de dimensionare similari . Factorii suplimentari care influențează dimensiunea celulei sunt considerații mecanice, cum ar fi stresul peretelui celular și presiunea de turgescență. Pentru o bacterie de dimensiuni de ordinul micronilor, o creștere a lățimii celulei ar fi cuplată cu o creștere a stresului care ar atrage după sine o creștere a întinderii peretelui; cu excepția cazului în care proprietățile mecanice sau grosimea peretelui celular ar fi ajustate, o bacterie probabil nu s-ar putea extinde pentru a atinge dimensiunea unei celule S. pombe fără a se rupe. Va fi interesant de determinat modul în care proprietățile mecanice și grosimea peretelui variază între specii strâns înrudite de dimensiuni diferite, cum ar fi Bacillus megaterium (care are o lățime de aproximativ 1,5 μm) sau drojdia de fisiune mai mare S. japonicus (figura 3a). Astfel, fiecare specie poate atinge o anumită dimensiune care se potrivește proprietăților sale mecanice și de creștere.

Formarea unei tije dintr-o sferă

În plus față de propagarea formei în timpul creșterii, celulele se pot confrunta cu provocarea stabilirii inițiale a formei. Au fost stabilite mai multe sisteme pentru a examina formarea de novo a formei tijei. Atunci când sporii de S. pombe germinează, aceștia se umflă, în general, într-o formă aproape sferică și apoi cresc o proeminență care, în cele din urmă, se extinde într-o tijă de lățimea corectă. Anizotropia mecanică cauzată de o ruptură în peretele sporului și o acumulare locală de activitate Cdc42 pot declanșa creșterea inițială a proeminenței. Cu toate acestea, se știu puține lucruri despre modul în care sunt stabilite dimensiunile și forma tijei proeminente. Un alt exemplu de formare de novo a formei este în regenerarea sferoplastului. La îndepărtarea peretelui celular, sferoplastul S. pombe rezultat este sferic; atunci când peretele se regenerează, o tijă cu lățimea corespunzătoare se extinde din celula rotundă mai mare din prima generație . Bacteriile sunt, de asemenea, capabile să se regenereze în tije. Spre deosebire de drojdie, sferoplastele bacteriene trec prin forme amorfe pentru a forma celule cu pereți, în formă de tijă, în decursul a câteva generații ,, și s-a demonstrat recent că această revenire la forma de tijă la B. subtilis poate fi inițiată dintr-o stare complet lipsită de pereți . Aceste comportamente demonstrează că forma și dimensiunile celulei sunt reglementate de mecanisme intracelulare robuste și nu depind numai de forma celulelor din generațiile anterioare.

Menținerea lățimii și menținerea tijei drepte

O provocare pentru celulele în formă de tijă este menținerea lățimii celulei în timpul creșterii. Pentru bacteriile în formă de tijă E. coli și B. subtilis, ambele alungite de-a lungul porțiunii cilindrice a celulei ,, lățimea celulei rămâne constantă chiar și în cazul celulelor filamentoase care cresc până la lungimi care se apropie de 100 de microni ,. O menținere similară a lățimii este observată S. pombe- și în tuburile de polen ale plantelor. La tijele care cresc în vârf, zona de creștere a vârfului trebuie să rămână constantă. La bacterii precum E. coli, creșterea trebuie să fie coordonată cu extensia, astfel încât lățimea să fie menținută pe măsură ce crește lungimea celulei. Studiile de modelare au prezis că introducerea stresului în noul material în timpul încorporării este necesară pentru a preveni expansiunea radială mediată de turgescență ,,; depolimerizarea MreB determină o creștere treptată a lățimii celulei , ceea ce indică faptul că MreB poate juca un rol în introducerea acestui stres. Esențial pentru testarea acestor modele va fi dezvoltarea de metode genetice și chimice pentru reglarea lățimii celulelor fără a perturba forma generală de tijă.

O altă provocare pentru celulele în formă de tijă este de a menține o axă liniară de creștere în timpul alungirilor. Cum ar putea o celulă să monitorizeze „rectitudinea”? În celulele E. coli, citoscheletul MreB, asemănător cu actină, se localizează preferențial în regiunile de curbură gaussiană negativă, sugerând că polimerii MreB detectează curbura celulei și îndreaptă activ celula prin direcționarea inserției peretelui celular în locuri specifice de pe suprafața celulară pe baza geometriei locale . La S. pombe, citoscheletul microtubulilor poate menține celulele drepte prin coordonarea creșterii peretelui celular la vârfurile celulelor; microtubulii se întind pe toată lungimea celulei și transportă factorii de polaritate, cum ar fi proteinele Tea, către vârfuri . Mutanții cu microtubuli anormal de scurți sau cărora le lipsesc proteinele Tea cresc adesea într-o formă curbată sau, uneori, stabilesc o zonă de creștere anormală pe partea laterală a celulei, ceea ce duce la formarea unui fenotip ramificat, în formă de „T” , ceea ce sugerează că microtubulii contribuie la rectitudine prin coordonarea zonelor adecvate de creștere la cele două vârfuri celulare ,. Luate împreună, atât la procariote, cât și la eucariote, citoscheletul este cel puțin parțial responsabil pentru menținerea formei celulei prin coordonarea modelelor locale de creștere cu morfologia globală .

Formarea de noi capete: un mecanism mecanic

Celelalte capete ale multor celule în formă de tijă sunt aproximativ semisferice, cu dimensiuni în concordanță cu porțiunile cilindrice ale celulei. În timp ce capătul în creștere al unei celule care crește în vârf este reglat de mulți factori intracelulari care modulează remodelarea progresivă a peretelui celular, formarea noului capăt celular la S. pombe oferă un exemplu al modului în care presiunea de turgescență în sine poate modela peretele celular. În timpul citocinezei, se formează un sept al peretelui celular la locul diviziunii, ghidat de inelul contractil pe bază de actină. Ulterior, o parte a septului este digerată pentru a provoca separarea celulelor; imediat după separare, septul se schimbă de la o formă plată la noul capăt rotunjit. Această morfologie, care este distinctă de forma ușor mai ascuțită a vârfului celulei în creștere, poate fi produsă de un mecanism predominant mecanic în care presiunea turgescenței umflă peretele celular (observațiile noastre nepublicate). Va fi interesant de văzut dacă orice bacterie Gram-pozitivă, care are un perete celular mai gros decât cel al bacteriilor Gram-negative și care formează un sept asemănător cu cel din S. pombe, își modelează, de asemenea, noile capete într-o manieră mediată de turgescență. În schimb, celulele E. coli se contractă la mijlocul celulei cu mult înainte de separarea celulelor . Această constricție este mediată de omologul tubulinei FtsZ ,, cuplată cu remodelarea progresivă a peretelui celular pentru a crea o morfologie polară emisferică .