Alai

Mechanika tyčinkovitých tenkých obalů

Růst ve tvaru tyčinek nakonec vyžaduje narušení symetrie, které může vyplývat ze směrovosti materiálových vlastností buněčné stěny, napětí, organizace syntézního aparátu nebo z jakékoli kombinace těchto faktorů. Fyzikální modely morfogeneze stěnových buněk považují buňku za tenký viskoelastický obal, který je zevnitř rovnoměrně nafukován turgorovým tlakem. Pro předpověď tvaru buňky, který je výsledkem daného mechanismu růstu, je rozhodující vzít v úvahu rozložení sil způsobených turgorovým tlakem, vyvažující síly roztažení stěny a to, jak materiálové vlastnosti stěny spojují tyto síly se stupněm roztažení. U lineárně pružného materiálu souvisí napětí σ (síla na jednotku plochy) s mechanickou deformací ε (dílčí protažení) prostřednictvím Youngova modulu:

míra vnitřní tuhosti materiálu podobná silové konstantě k pružiny (pro kterou Hookův zákon říká, že k = F/x, kde F je síla potřebná k protažení pružiny o velikost x). V pružné tenké slupce by se napětí měla zvyšovat s rostoucím poloměrem buňky r a s turgorovým tlakem P a snižovat s větší tloušťkou stěny buňky d. V kulové slupce jsou napětí v každém směru stejná. Naproti tomu geometrie válcové skořápky diktuje, že obvodová napětí (σ r ) jsou dvakrát větší než podélná napětí (σ l ) (obrázek 1c):

Kombinací rovnic 1 a 2 tyto modelové vztahy předpovídají, že obvodové a podélné deformace (ε r a ε l ) by měly být lineárně závislé na šířce a turgorovém tlaku a nepřímo závislé na tloušťce stěny. Pokud je Youngův modul v každém směru stejný (mechanicky izotropní), pak by ε r mělo být dvakrát větší než ε l .

Tento vztah mezi deformacemi v různých směrech byl použit ke zkoumání mechanických vlastností buněčné stěny tyčinkovitých buněk. U štěpných kvasinek měření míry smrštění buněk při snížení turgorového tlaku odhaluje tento předpokládaný poměr deformace 2:1, což naznačuje, že se buněčná stěna v těchto buňkách chová jako izotropní materiál (Atilgan a Chang, nepublikovaná pozorování). Naproti tomu u tyčinkovitých bakterií, jako jsou E. coli a B. subtilis, vykazují buňky vyšší stupeň podélného než radiálního protažení , což svědčí o mechanické anizotropii (nebo směrové závislosti) s větší tuhostí v obvodovém směru oproti podélnému. Tato pozorování jsou v souladu s kryoelektronovými tomogramy, které ukazují, že buněčná stěna E. coli je uspořádána s tužšími složkami (glykanovými vlákny) orientovanými podél obvodového směru . Bude zajímavé zjistit, zda v rostlinných buněčných stěnách existuje mechanická anizotropie, nebo zda jsou spíše podobné buněčné stěně štěpných kvasinek.

Důležité je poznamenat, že k anizotropii růstu (prodlužování pouze podél jedné osy) může dojít při použití anizotropního nebo izotropního materiálu stěny; izotropní materiál lze totiž použít ke konstrukci prakticky jakéhokoli tvaru buňky. Mechanické vlastnosti buněčné stěny mohou být navíc mnohem složitější než jednoduché vztahy škálování, které jsme popsali výše. Například vztah mezi napětími a deformacemi se při dostatečně velkých deformacích již nebude řídit rovnicí 1; nedávná měření pomocí mikroskopie atomárních sil naznačují, že buněčná stěna E. coli vykazuje v tlakovém stavu nelineární vlastnosti, které mohou pomoci buňce odolávat expanzi během hypoosmotického šoku . Předpoklad konstantní tloušťky v celém tenkém obalu se také může rozpadnout, zejména během septace v důsledku rozdílů ve způsobu stavby stěny v septu . Nakonec je třeba tyto mechanické charakteristiky integrovat se zákonitostmi vkládání a přetváření stěny, které mohou jak měnit tloušťku buněčné stěny, tak vést k viskoelastické reakci, při níž materiál stěny při namáhání teče jako viskózní kapalina. To vytváří rozmanitou škálu potenciálních růstových mechanismů ve stěnových buňkách. Biofyzikální modely mohou poskytnout testovatelné předpovědi vztahů mezi turgorovým tlakem, vzorci růstu a rozložením deformace a rychlosti růstu na povrchu buňky ,.

Růst cylindrickým prodlužováním

U mnoha bakterií je růst buněk dosahován vkládáním nového materiálu buněčné stěny na místech v celé cylindrické části buněčné stěny, zatímco na pólech buněk je vkládání sníženo. Nejlépe prostudovaným organismem z hlediska růstu buněčné stěny je E. coli, s několika přehledy zaměřenými na biochemii , mechanismus syntézy , morfologii , a fyzikální vlastnosti buněčné stěny. Stejně jako většina bakterií má E. coli buněčnou stěnu složenou z peptidoglykanu, makromolekulární sítě cukerných vláken (glykanů) zesíťovaných krátkými peptidy. Jak bylo uvedeno výše, tužší glykany jsou orientovány po obvodu , takže buněčná stěna je kromě růstové anizotropie tyčinkového tvaru mechanicky anizotropní. Cytoskeletální protein MreB, homolog eukaryotického aktinu , se pohybuje přibližně cirkumferenciálně podél vnitřní strany cytoplazmatické membrány a antibiotikum mecillinam cílící na buněčnou stěnu tento pohyb inhibuje, což naznačuje model, ve kterém stopy MreB označují cesty vkládání nového materiálu na boční stěnu ,. Kromě toho se buňky E. coli při prodlužování kroutí v závislosti na MreB v důsledku orientace glykanových vláken s mírným úhlovým vychýlením od obvodového směru . U B. subtilis bylo pozorováno podobné propojení pohybu MreB se syntézou buněčné stěny , a kroucení (s opačným směrem), což naznačuje společná pravidla s E. coli pro zavedení řádu ve stěně navzdory rozdílu v tloušťce stěny. Není známo, zda vzorec vkládání buněčné stěny řízený MreB také pomáhá buňce určit a/nebo udržet její šířku během růstu, ačkoli mutace v mreB mohou vést k tyčinkám různých velikostí .

Jedním z předpokládaných důsledků cylindrického prodlužování je exponenciální růst, při kterém jednotlivé dlouhé buňky rostou rychleji než krátké. Buňky E. coli se skutečně exponenciálně prodlužují, když je dělení blokováno , a zdá se, že tak činí i během normálního růstu a dělení . Exponenciální růst by se dal očekávat u organismu, jehož růstová zóna se úměrně zvětšuje s růstem buňky; zajímavé je, že povaha exponenciálního růstu (L = L02t/τ, kde τ je doba zdvojení) diktuje, že 1/L (dL/dt) = (ln 2)/τ je konstantní nezávisle na L, což naznačuje, že pro danou dobu zdvojení neexistuje preferované měřítko délky.

E. coli je spolu se zakřivenou bakterií Caulobacter crescentus hlavním předmětem teoretických a výpočetních studií bakteriální morfogeneze. Modely se dělí do dvou širokých, vzájemně se doplňujících tříd: hrubozrnné simulace molekulární dynamiky mechaniky stěn a růstu, motivované předpokládanými mechanismy molekulární koordinace a/nebo experimentálními měřeními vzorců vkládání buněčných stěn ,,; a mechanochemické modely konečných prvků, které zahrnují remodelaci stěn s mechanickou relaxací k předpovědi potenciálních nestabilit a škálovacích vztahů mezi rozměry buněk a parametry růstu ,-. Model, který zohledňuje rovnováhu mezi chemickou energií uvolněnou během vkládání a změnou energie deformace v důsledku nové geometrie po růstu, předpovídá stabilní šířku a rychlost růstu pro růst ve tvaru tyčinky, která se shoduje s měřeními E. coli a B. subtilis při rozumné volbě parametrů . Simulace založené na tomto modelu naznačují, že MreB působí na buněčnou stěnu silou dovnitř, čímž zabraňuje nestabilitě růstu v důsledku turgorového tlaku . Výpočetní modely obecně naznačují, že robustní určení tvaru vyžaduje koordinaci zabudování buněčné stěny , a simulace v molekulárním měřítku naznačují, že pohyb MreB může pomáhat udržovat šířku buňky podél buněčného těla, zejména během perturbací, jako je osmotický šok .

Růst prodloužením buněčné špičky

Na rozdíl od E. coli rostou některé tyčinkovité buňky prostřednictvím zabudování nové buněčné stěny a membrány na špičkách buněk, zatímco boční stěna je relativně inertní. Mechanismy růstu špiček byly zkoumány u mnoha stěnových organismů, včetně S. pombe, hyfovitých hub, mechů a pylových trubic, a také u bakterií, jako je A. tumefaciens. Obecně se předpokládá, že růst špičky je poháněn vysokým turgorovým tlakem, který prodlužuje buněčnou stěnu na špičce, ve spojení s přidáváním nového materiálu a přetvářením starého materiálu různými vnitrobuněčnými faktory (obr. 1b).

Fyzikální modely růstu špičky postulovaly, že tyčinkovitý tvar vzniká vložením měkčí gelovité stěny na samé špičce buňky, která pak vyzrává v tužší síť po stranách buněk ,-. Morfogenetické parametry určující tvar buněčné špičky jsou pak vzájemně propojeny rovnováhou mezi zráním, tlakem a vkládáním, přičemž omezením je zachování hmotnosti. Některé zobecněné biofyzikální modely růstu špiček byly abstrahovány mimo molekulární detaily a strukturu konkrétního systému, a proto byly užitečné pro poskytnutí škálovacích zákonů vztahujících se k tvaru špiček, velikosti buněk a rychlosti růstu, které lze testovat a ověřovat pomocí srovnávacích studií různých druhů (obr. 2) . V nedávné studii se předpokládá, že maximální poloměr zakřivení hrotu R A se bude měnit jako 1/P, zatímco poloměr buňky se bude měnit jako (a2/P)1/3, kde a je velikost oblasti, ve které se vylučuje nový materiál. To dává poměr mezi oběma veličinami:

kde R a R A jsou snadno měřitelné ze snímků buněk. V tomto modelu se předpokládá, že viskozita stěny je pevnou funkcí úhlu kolem špičky buňky, nezávislou na ostatních parametrech; zbývá zjistit, jak citlivé jsou předpovědi na tento předpoklad. Nicméně je zajímavé, že různé druhy hub a rostlinných pylových trubic vykazují lineární vztah mezi R a R A (R A /R konstanta); pokud tedy platí rovnice 3, pak tato data znamenají, že velikost a zóny vnoření se také škáluje s R, a blízce příbuzné druhy mají dokonce podobné sklony . V souladu s těmito modely jsou v pylových trubicích a u S. pombe syntázy buněčné stěny lokalizovány na rostoucích špičkách buněk, kde zavádějí nový materiál stěny. V pylových trubicích odhalila měření mikroskopií atomárních sil gradient tuhosti buněčné stěny, v němž je stěna na vrcholu nejměkčí. Ačkoli taková měření nebyla provedena u štěpných kvasinek, barvení stěn, jako je kalcofluorová běloba, rovněž naznačují gradient tuhosti buněčné stěny ,,. Kromě toho jsou vzorce migrace fiduciálních značek podél buňky během růstu v souladu s mechanickými modely expanze polokoule do válce , což ilustruje užitečnost zobrazování dynamických vzorců růstu pro zkoumání morfogenetických mechanismů ,,.

U S. pombe byly identifikovány složité molekulární sítě, které modulují tvar buněk, a proto se mohou na určité úrovni podílet na regulaci mechanismu buněčné stěny. Mezi klíčové základní buněčné procesy patří exocytóza, endocytóza, aktinové a mikrotubulární cytoskelety a malé GTPázy, jako jsou Rho a Cdc42 (viz přehled). Cdc42 může regulovat obchodování s aktinem a membránou s cílem nasměrovat sekreční vezikuly obsahující syntetázy buněčné stěny, prekurzory buněčné stěny a membránu do místa růstu (obr. 1b) . Ačkoli se předpokládá, že aktin i mikrotubuly vyvíjejí síly, které tlačí a deformují plazmatickou membránu v živočišných buňkách, existuje jen málo důkazů, že tvarují stěny buněk přímým působením sil . Místo toho aktin hraje v polarizovaném buněčném růstu přinejmenším dvě kritické role: jako dráhy pro myozinový transport vezikul k buněčnému hrotu a pro endocytózu . Mikrotubuly mají přímou úlohu v polarizovaném transportu vezikul u některých hub, jako jsou Aspergillus a Ustilago, . U S. pombe hrají mikrotubuly regulační roli v polaritě tím, že ukládají Tea proteiny, které regulují aktin a Cdc42 na špičkách buněk , a za určitých okolností mohou řídit tvorbu větve ,. Matematické modely zkoumaly, jak proteiny Tea fungují jako orientační body pro vytvoření gradientů aktivovaného Cdc42 ,. Zajímavé je, že byla pozorována oscilace aktivity Cdc42 mezi dvěma buněčnými špičkami v časovém měřítku přibližně pěti minut, kterou lze modelovat pomocí smyček pozitivní a negativní zpětné vazby . Není známo, zda se růst štěpných kvasinek s těmito oscilacemi Cdc42 mění, ačkoli pylové trubice a některé hyfovité houby vykazují růst špiček v oscilačních impulzech . Navíc někteří mutanti se změněnou aktivitou Cdc42 vykazují změněnou šířku buněk, což naznačuje model, ve kterém se gradient aktivity Cdc42 na špičkách buněk používá k určení šířky tyčinky ,,. Jak prostorové vzorce faktorů polarity, jako je Cdc42, řídí tvar buněk prostřednictvím růstu buněčné stěny, není dosud dostatečně známo.

Rozměry tyčinek

Buněčné rozměry, jako je šířka, délka a tloušťka buněčné stěny, se u různých organismů značně liší, což může mít vliv na rozložení napětí, a tím i na výsledný tvar buněk . Kvantifikace rozložení těchto buněčných rozměrů spolu s morfologickými znaky, jako je profil zakřivení buněčného těla a špičky, bude tedy klíčová pro studium a porovnávání mechanismů růstu . V poslední době byly vyvinuty výpočetní nástroje, které umožňují rychlou automatizovanou analýzu velkých populací buněk se subpixelovým rozlišením , . Abychom ilustrovali variabilitu absolutních velikostí buněk mezi bakteriálními a houbovými druhy, zobrazovali jsme buňky a analyzovali jejich tvary pomocí běžného výpočetního rámce založeného na Matlabu, který byl dříve použit pro kvantifikaci šířky buněk u bakterií (obr. 3a) . Tato měření nám také umožnila změřit zakřivení obrysu buňky; zaznamenali jsme, že u zúžených buněk (například Schizosaccharomyces japonicus) zůstávají strany rovné, zatímco póly mají různé zakřivení (obrázek 3b). Poměr stran je přibližně zachován u všech studovaných bakterií a u S. pombe, ačkoli u jiných hub, jako je S. japonicus, je poměr stran poněkud hranatější.

Kvantitativní měření turgorového tlaku a vlastností buněčné stěny jsou rovněž zásadní pro pochopení mechanismů určování tvaru buněk. Ačkoli turgorový tlak byl přímo měřen u velkých rostlinných buněk ,, menší rozměry bakterií a kvasinek si vyžádaly vývoj nepřímých metod pro odhad turgorového tlaku ,,. Zdá se, že stěnové organismy rostou pod turgorovým tlakem několika málo až desítek atmosfér ,. V souladu s potřebou snášet tyto turgorové tlaky mají jejich stěny Youngův modul desítky až stovky MPa (1 atm = 0,1 MPa) ,,, a potenciálně tuhnou pod tlakem . Buněčná stěna E. coli má Youngův modul 25 až 100 MPa a buňky jsou vystaveny turgorovému tlaku přibližně 1 atm ,. Zajímavé je, že buňky B. subtilis mají turgorový tlak zhruba desetkrát vyšší než buňky E. coli a jejich stěny mají podobný Youngův modul, ale jsou desetkrát silnější, což naznačuje, že by jejich podobný tvar mohl vzniknout díky společné mechanické rovnováze turgorového tlaku a napětí ve stěnách. Podle nejnovějších odhadů pro buňky S. pombe je Youngův modul přibližně 50 MPa a turgorový tlak 10 až 15 atm (naše nepublikované údaje).

Jak je specifikována absolutní velikost buněk, není známo u žádného typu buněk a zůstává jednou z nevyřešených otázek v morfogenezi. Jak buňky specifikují své rozměry a jak je určitá velikost (stejně jako tvar buňky) výhodná z evolučního hlediska? Je zřejmé, že mnoho buněk pevně udržuje svou velikost při růstu a dělení pomocí homeostatických mechanismů ,. Některé buňky se například zavazují k dělení nebo replikaci DNA až po dosažení minimální velikosti buňky, což naznačuje, že mají schopnost vnímat svou vlastní velikost nebo geometrii. Buňky S. pombe před vstupem do mitózy a dělením dorůstají délky 14 μm. Nedávné pokroky identifikovaly systém kortikálních faktorů včetně Cdr2 a Pom1, které při tomto procesu zřejmě monitorují povrch buňky . Podobné rozdělovače byly navrženy i u bakterií . Dalšími faktory ovlivňujícími velikost buňky jsou mechanické faktory, jako je napětí buněčné stěny a turgorový tlak . U bakterií mikronové velikosti by zvětšení šířky buňky bylo spojeno se zvýšením napětí, které by znamenalo zvýšení roztažení stěny; pokud by nebyly upraveny mechanické vlastnosti nebo tloušťka buněčné stěny, bakterie by se pravděpodobně nemohla rozšířit tak, aby dosáhla velikosti buňky S. pombe, aniž by praskla. Bude zajímavé zjistit, jak se mechanické vlastnosti a tloušťka stěny liší u blízce příbuzných druhů různých velikostí, jako je Bacillus megaterium (který má šířku přibližně 1,5 μm) nebo větší štěpná kvasinka S. japonicus (obr. 3a). Každý druh tak může dosáhnout určité velikosti, která odpovídá jeho mechanickým a růstovým vlastnostem.

Tvorba tyčinky z koule

Kromě šíření tvaru během růstu mohou buňky čelit výzvě počátečního ustavení tvaru. Bylo vytvořeno několik systémů, které zkoumají tvorbu tvaru tyče de novo. Když spory S. pombe klíčí, obvykle nabobtnají do téměř kulovitého tvaru a poté jim vyroste výběžek, který se nakonec rozšíří do tyčinky správné šířky. Mechanická anizotropie způsobená zlomem ve stěně spory a lokální akumulace aktivity Cdc42 mohou spustit počáteční růst výběžku . O tom, jak se ustavují rozměry a tvar vyčnívající tyčinky, je však známo jen málo. Dalším příkladem tvorby tvaru de novo je regenerace sféroplastu. Po odstranění buněčné stěny je výsledný sféroplast S. pombe kulovitý; po regeneraci stěny se z větší kulaté buňky v první generaci vysune tyčinka správné šířky . Bakterie jsou rovněž schopny regenerovat do tyčinek. Na rozdíl od kvasinek přecházejí bakteriální sféroplasty přes amorfní tvary do podoby tyčinkovitých buněk se stěnou v průběhu několika generací ,, a nedávno bylo prokázáno, že tato reverze do tyčinkovitého tvaru u B. subtilis může začít ze stavu zcela bez stěny . Tato chování ukazují, že tvar a rozměry buňky jsou regulovány robustními vnitrobuněčnými mechanismy a nezávisí pouze na tvaru buněk v předchozích generacích.

Udržení šířky a udržení tyčinky rovné

Problémem tyčinkovitých buněk je udržení šířky buňky během růstu. U tyčinkovitých bakterií E. coli a B. subtilis, které se prodlužují podél válcové části buňky , zůstává šířka buňky konstantní i u vláknitých buněk, které rostou do délky blížící se 100 mikrometrům ,. Podobné zachování šířky je pozorováno u S. pombe- a u pylových trubic rostlin. U tyčinek rostoucích na špičce musí zóna růstu špičky zůstat konstantní. U bakterií, jako je E. coli, musí být růst koordinován s prodlužováním, aby se šířka udržovala s rostoucí délkou buňky. Modelové studie předpověděly, že zavedení stresu do nového materiálu během inkorporace je nezbytné, aby se zabránilo radiální expanzi zprostředkované turgorem ,,; depolymerizace MreB způsobuje postupný nárůst šířky buňky , což naznačuje, že MreB může hrát roli při zavádění tohoto stresu. Rozhodující pro testování těchto modelů bude vývoj genetických a chemických metod pro ladění šířky buněk bez narušení celkového tyčinkovitého tvaru.

Další výzvou pro tyčinkovité buňky je udržení lineární osy růstu během prodlužování. Jak může buňka sledovat „přímost“? V buňkách E. coli se aktinu podobný cytoskelet MreB lokalizuje přednostně do oblastí se záporným Gaussovým zakřivením, což naznačuje, že polymery MreB vnímají zakřivení buňky a aktivně ji narovnávají tím, že na základě místní geometrie směřují zasouvání buněčné stěny do specifických míst na povrchu buňky . U S. pombe může mikrotubulární cytoskelet udržovat buňky rovné tím, že koordinuje růst buněčné stěny na špičkách buněk; mikrotubuly se táhnou po celé délce buňky a transportují faktory polarity, jako jsou proteiny Tea, ke špičkám . Mutanti s abnormálně krátkými mikrotubuly nebo s nedostatkem proteinů Tea často rostou zakřiveně nebo někdy vytvářejí abnormální růstovou zónu na straně buňky, což vede k vytvoření rozvětveného fenotypu ve tvaru písmene „T“ , což naznačuje, že mikrotubuly přispívají k rovnosti tím, že koordinují správné zóny růstu na obou špičkách buněk ,. Celkově lze říci, že jak u prokaryot, tak u eukaryot je cytoskelet alespoň částečně zodpovědný za udržování tvaru buňky tím, že koordinuje lokální růstové vzorce s globální morfologií .

Tvorba nových konců: mechanický mechanismus

Konce mnoha tyčinkovitých buněk jsou zhruba polokulovité, s rozměry odpovídajícími válcovým částem buňky. Zatímco rostoucí konec buňky rostoucí na špičce je regulován mnoha vnitrobuněčnými faktory, které modulují postupnou remodelaci buněčné stěny, tvorba nového konce buňky u S. pombe poskytuje příklad toho, jak samotný turgorový tlak může formovat buněčnou stěnu. Během cytokineze se v místě dělení vytváří přepážka buněčné stěny, která je vedena kontraktilním prstencem na bázi aktinu. Poté je část septa odštěpena, aby došlo k oddělení buňky ; ihned po oddělení se septum změní z plochého tvaru na nový zaoblený konec. Tato morfologie, která se liší od mírně špičatějšího tvaru rostoucího konce buňky, může být vytvořena převážně mechanickým mechanismem, při kterém turgorový tlak nafoukne buněčnou stěnu (naše nepublikovaná pozorování). Bude zajímavé zjistit, zda grampozitivní bakterie, které mají silnější buněčnou stěnu než gramnegativní bakterie a vytvářejí septum podobně jako u S. pombe, také tvarují své nové konce turgorovým způsobem. Naproti tomu buňky E. coli se v polovině buňky zužují dlouho před oddělením buněk . Toto zúžení je zprostředkováno tubulinovým homologem FtsZ , spolu s postupnou přestavbou buněčné stěny, která vytváří polokulovitou polární morfologii .

.