Alai

Mekanikken bag stavformede tynde skaller

Stavformet vækst kræver i sidste ende et brud på symmetrien, hvilket kan skyldes retningsbestemte materialeegenskaber i cellevæggen, spændinger, organiseringen af syntesemaskineriet eller en kombination af disse forhold. Fysiske modeller for morfogenese af celler med vægge betragter cellen som en tynd viskoelastisk skal, der er ensartet oppustet indefra af turgotryk. For at forudsige den celleform, der er resultatet af en given vækstmekanisme, er det afgørende at tage hensyn til fordelingen af kræfterne som følge af turgortrykket, de udlignende kræfter, som væggen strækker sig, og hvordan væggenes materialeegenskaber kobler disse kræfter til graden af udvidelse. For et lineært elastisk materiale er spændingen σ (kraft pr. arealenhed) forbundet med den mekaniske deformation ε (brøkdel af strækningen) via Young’s modul:

et mål for materialets iboende stivhed svarende til kraftkonstanten k for en fjeder (for hvilken Hookes lov dikterer, at k = F/x, hvor F er den kraft, der kræves for at strække fjederen med en mængde x). I en elastisk tynd skal bør spændingerne stige med stigende celleradius r og med turgortrykket P og falde med større celletykkelse d. I en kugleformet skal er spændingerne lige store i alle retninger. I modsætning hertil dikterer geometrien i en cylindrisk skal, at spændingerne i omkreds (σ r ) er dobbelt så store som spændingerne i længderetningen (σ l ) (figur 1c):

Kombineres ligning 1 og 2, forudsiger disse modelrelationer, at de cirkumferentielle og longitudinale spændinger (henholdsvis ε r og ε l ) bør være lineært afhængige af bredden og turgortrykket og omvendt afhængige af vægtykkelsen. Hvis Young-modulet er lige stort i alle retninger (mekanisk isotropisk), bør ε r være dobbelt så stort som ε l .

Dette forhold mellem belastningerne i forskellige retninger er blevet anvendt til at undersøge de mekaniske egenskaber ved cellevæggen i stavformede celler. I fissionsgær afslører måling af graden af krympning af cellerne, når turgortrykket reduceres, dette forudsagte 2:1-forhold mellem deformationer, hvilket tyder på, at cellevæggen i disse celler opfører sig som et isotropt materiale (Atilgan og Chang, upublicerede observationer). I modsætning hertil udviser cellerne i stavformede bakterier som E. coli og B. subtilis en højere grad af langsgående end radial strækning , hvilket indikerer mekanisk anisotropi (eller retningsafhængighed) med større stivhed i omkredsretningen end i længderetningen . Disse observationer stemmer overens med kryo-elektrontomogrammer, der viser, at E. coli-cellevæggen er organiseret med de mere stive komponenter (glykanstrenge) orienteret langs den cirkumferentielle retning . Det vil være interessant at finde ud af, om der er mekanisk anisotropi i plantecellevægge, eller om de er mere lig fissionsgær-cellevæggen.

Det er vigtigt at bemærke, at vækstanisotropi (forlængelse langs kun én akse) kan forekomme ved hjælp af enten anisotropisk eller isotropisk vægmateriale; faktisk kan isotropisk materiale bruges til at konstruere stort set enhver celleform. Desuden kan cellevæggenes mekaniske egenskaber være langt mere komplekse end de simple skaleringsrelationer, som vi har beskrevet ovenfor. For eksempel vil forholdet mellem spændinger og belastninger ikke længere følge ligning 1 ved tilstrækkeligt store belastninger; nylige målinger med atomkraftmikroskopi viser, at E. coli-cellevæggen udviser ikke-lineære egenskaber i sin tryksatte tilstand, som kan hjælpe cellen til at modstå ekspansion under hypoosmotisk chok . Antagelsen om en konstant tykkelse på tværs af den tynde skal kan også bryde sammen, især under septation på grund af forskelle i den måde, væggen er opbygget på ved septum . I sidste ende skal disse mekaniske egenskaber integreres med mønstrene for indføring og ombygning af væggen, som både kan ændre cellevæggenes tykkelse og føre til en viskoelastisk reaktion, hvor vægmaterialet flyder som en viskøs væske, når det belastes. Dette giver en bred vifte af potentielle vækstmekanismer i celler med vægge. Biofysiske modeller kan give testbare forudsigelser for relationerne mellem turgortryk, vækstmønstre og fordelingen af belastninger og væksthastighed på tværs af celleoverfladen ,.

Vækst ved cylindrisk forlængelse

I mange bakterier opnås cellevækst ved indsættelse af nyt cellevægsmateriale på steder i hele den cylindriske del af cellevæggen, mens indsættelsen er mindsket ved cellepolerne. Den mest velundersøgte organisme set ud fra et perspektiv af cellevægsvækst er E. coli, med adskillige oversigter med fokus på cellevæggenes biokemi , syntesemaskineri , morfologi , og fysiske egenskaber. Som de fleste bakterier har E. coli en cellevæg, der består af peptidoglykan, et makromolekylært netværk af sukkerstrenge (glykaner), der er tværbundet af korte peptider. Som nævnt ovenfor er de stivere glykanstrenge orienteret i omkreds, hvilket gør cellevæggen mekanisk anisotrop ud over stavformens vækstanisotropi. Det cytoskeletale protein MreB, et homologe af eukaryote actin , bevæger sig på en omtrent cirkulær måde langs cytoplasmamembranens inderside, og det cellevægsmålrettede antibiotikum mecillinam hæmmer denne bevægelse, hvilket tyder på en model, hvor MreB-sporene angiver banerne for indsættelse af nyt materiale på sidevæggen ,. Desuden vrider E. coli-cellerne sig, når de strækker sig på en MreB-afhængig måde, på grund af orienteringen af glykanstrenge med en lille vinkelbias væk fra omkredsretningen . I B. subtilis er der observeret en lignende kobling af MreB-bevægelse til syntese af cellevæggen og vridning (med modsat fortegn), hvilket tyder på fælles regler med E. coli for etablering af orden i væggen på trods af forskellen i vægtykkelse. Det er ukendt, om det MreB-vejledte mønster af cellevægsindsættelse også hjælper cellen med at bestemme og/eller bevare sin bredde under vækst, selv om mutationer i mreB kan resultere i stænger af forskellige størrelser .

En forudsagt konsekvens af cylindrisk forlængelse er eksponentiel vækst, hvor enkelte lange celler vokser hurtigere end korte celler. E. coli-celler strækker sig faktisk eksponentielt, når delingen er blokeret , og synes at gøre det også under normal vækst og deling . Eksponentiel vækst kan forventes af en organisme, hvis vækstzone vokser proportionalt med cellens vækst; interessant nok dikterer den eksponentielle væksts natur (L = L02t/τ, hvor τ er fordoblingstiden), at 1/L (dL/dt) = (ln 2)/τ er konstant uafhængig af L, hvilket indikerer, at der ikke er nogen foretrukken længde skala for en given fordoblingstid.

E. coli har sammen med den krumme bakterie Caulobacter crescentus været et hovedemne for teoretiske og beregningsmæssige undersøgelser af bakteriel morfogenese. Modellerne er faldet i to brede, komplementære klasser: grovkornede molekylærdynamiske simuleringer af vægmekanik og vækst, motiveret af hypoteser om mekanismer for molekylær koordinering og/eller eksperimentelle målinger af cellevæggenes indsættelsesmønstre ,,; og finite-element mekanokemiske modeller, der inkorporerer væggenes remodellering med mekanisk afslapning for at forudsige potentielle ustabiliteter og skaleringsrelationer mellem celledimensioner og vækstparametre ,-. En model, der tager hensyn til balancen mellem den kemiske energi, der frigives under indsættelsen, og ændringen i belastningsenergi som følge af den nye geometri efter væksten, forudsiger en stabil bredde og væksthastighed for stavformet vækst, der stemmer overens med målinger af E. coli og B. subtilis for rimelige valg af parametre . Simuleringer baseret på denne model tyder på, at MreB udøver en indadgående kraft på cellevæggen og forhindrer ustabilitet i væksten som følge af turgotryk . Beregningsmodeller har generelt antydet, at robust formbestemmelse kræver koordinering af inkorporering af cellevæggen , , og simuleringer på molekylærskala tyder på, at MreB-bevægelse kan bidrage til at opretholde cellens bredde langs cellekroppen, især under forstyrrelser såsom osmotisk chok .

Vækst ved cellespidsudvidelse

I modsætning til E. coli vokser nogle stavformede celler via indsættelse af ny cellevæg og membran ved cellespidserne, mens den laterale væg er relativt inaktiv. Mekanismerne for spidsvækst er blevet undersøgt i mange væggede organismer, herunder S. pombe, hyfale svampe, mos og pollenrør, samt i bakterier som A. tumefaciens. Generelt menes spidsvækst at være drevet af et højt turgortryk, der udvider cellevæggen ved spidsen, kombineret med tilføjelse af nyt materiale og ombygning af gammelt materiale ved hjælp af en række intracellulære faktorer (figur 1b).

Fysiske modeller for spidsvækst har postuleret, at en stanglignende form dannes ved at indsætte en blødere gel-lignende væg ved selve spidsen af cellen, som derefter modnes til et stivere netværk på siderne af cellerne ,-. De morfogenetiske parametre, der definerer cellespidsens form, er derefter indbyrdes forbundet af balancen mellem modning, tryk og indsættelse, med massebevarelse som en begrænsning. Nogle generaliserede biofysiske modeller for spidsvækst er blevet abstraheret ud over de molekylære detaljer og strukturen af et bestemt system og har derfor været nyttige til at tilvejebringe skaleringslove, der relaterer spidsform, cellestørrelse og væksthastighed, som kan testes og valideres ved hjælp af sammenlignende undersøgelser på tværs af arter (figur 2) . I en nyere undersøgelse forudsiges det, at den maksimale krumningsradius for spidsen R A skalerer som 1/P, mens cellens radius forudsiges at skalere som (a2/P)1/3, hvor a er størrelsen af det område, hvor nyt materiale udskilles. Dette giver et forhold mellem de to størrelser:

hvor R og R A let kan måles ud fra billeder af celler. I denne model antages vægviskositeten at være en fast funktion af vinklen omkring cellespidsen, uafhængig af andre parametre; det skal endnu ses, hvor følsomme forudsigelserne er over for denne antagelse. Ikke desto mindre er det interessant, at forskellige arter af svampe og plantepollenrør alle viser et lineært forhold mellem R og R A (R A /R konstant); hvis ligning 3 holder, indebærer disse data således, at størrelsen a af indstikszonen også skalerer med R, og nært beslægtede arter har endda lignende hældninger . I overensstemmelse med disse modeller er cellevægssynteser i pollenrør og i S. pombe lokaliseret til de voksende cellespidser, hvor de indfører nyt vægmateriale. I pollenrør har målinger med atomkraftmikroskopi afsløret en gradient i cellevæggenes stivhed, hvor væggen ved spidsen er den blødeste. Selv om sådanne målinger ikke er blevet foretaget i fissionsgær, tyder vægfarvninger som f.eks. calcofluorhvid også på en gradient af cellevæggens stivhed ,,. Desuden er mønstre for migrationen af referencemarkører langs cellen under væksten i overensstemmelse med mekaniske modeller for udvidelsen af en halvkugle til en cylinder , hvilket illustrerer nytten af billeddannelse af dynamiske vækstmønstre til undersøgelse af morfogenetiske mekanismer ,,.

I S. pombe er der identificeret komplekse molekylære netværk, der modulerer celleformen, og som derfor kan være involveret på et eller andet niveau i reguleringen af cellevægsmaskineriet. Centrale centrale cellulære processer omfatter exocytose, endocytose, aktin- og mikrotubulicytoskeletter og små GTPaser såsom Rho og Cdc42 (se for en gennemgang). Cdc42 kan regulere actin- og membrantrafikken for at målrette sekretoriske vesikler, der indeholder cellevægssyntaser, cellevægsprækursorer og membran til vækststedet (Figur 1b) . Selv om både actin og mikrotubuli menes at udøve kræfter, der skubber og forvrænger plasmamembranen i dyreceller, er der kun få beviser for, at de former celler med vægge ved direkte udøvelse af kræfter . I stedet spiller aktin mindst to kritiske roller i polariseret cellevækst: som spor for myosinbaseret transport af vesikler til cellespidsen og for endocytose . Mikrotubuli har en direkte rolle i polariseret transport af vesikler i nogle svampe, såsom Aspergillus og Ustilago, . I S. pombe spiller mikrotubuli en regulerende rolle i polaritet ved at deponere Tea-proteiner, der regulerer actin og Cdc42 ved cellespidserne , og kan under visse omstændigheder styre dannelsen af en forgrening ,. Matematiske modeller har undersøgt, hvordan Tea-proteinerne fungerer som landemærker til at etablere gradienter af aktiveret Cdc42 ,. Det er interessant, at Cdc42-aktiviteten er blevet observeret til at svinge mellem de to cellespidser med en tidsskala på ca. fem minutter, hvilket kan modelleres ved hjælp af positive og negative feedback-loops . Det vides ikke, om væksten af fissionsgær varierer med disse Cdc42-svingninger, selv om pollenrør og nogle hyfale svampe udviser spidsvækst i oscillerende impulser . Desuden udviser nogle mutanter med ændret Cdc42-aktivitet ændrede cellebredder, hvilket tyder på en model, hvor en gradient af Cdc42-aktivitet ved cellespidserne bruges til at specificere stavens bredde ,,,. Hvordan rumlige mønstre af polaritetsfaktorer som Cdc42 kontrollerer celleformen gennem cellevægsvækst er stadig dårligt forstået.

Dimensionerne af stænger

Cellulære dimensioner som bredde, længde og cellevægstykkelse varierer meget på tværs af forskellige organismer, hvilket potentielt påvirker fordelingen af spændinger og dermed den resulterende celleform . Derfor vil kvantificering af fordelingen af disse celledimensioner sammen med morfologiske træk som f.eks. cellekroppens og spidens krumningsprofil være nøglen til at studere og kontrastere vækstmekanismer . Der er for nylig blevet udviklet beregningsværktøjer, som muliggør hurtig, automatiseret analyse af store cellepopulationer med subpixelopløsning . For at illustrere variationen i absolutte cellestørrelser blandt bakterie- og svampearter, afbildede vi celler og analyserede deres former ved hjælp af en fælles Matlab-baseret beregningsramme, der tidligere er anvendt til kvantificering af cellebredde i bakterier (Figur 3a) . Disse målinger gjorde det også muligt for os at måle krumningen af cellekonturen; vi bemærkede, at i koniske celler (for eksempel Schizosaccharomyces japonicus) forblev siderne lige, mens polerne havde forskellige krumninger (Figur 3b). Aspektforholdet er omtrent bevaret på tværs af de undersøgte bakterier og i S. pombe, selv om andre svampe, såsom S. japonicus, er noget mere squat i aspektforholdet.

Kvantitative målinger af turgotryk og cellevægsegenskaber er også afgørende for at forstå mekanismerne for bestemmelse af celleform. Selv om turgortrykket er blevet direkte målt i store planteceller ,, har de mindre størrelser af bakterier og gær gjort det nødvendigt at udvikle indirekte metoder til vurdering af turgortrykket ,,,,. Organismer med vægge ser ud til at vokse under et turgortryk på nogle få til nogle få ti atmosfærer ,. I overensstemmelse med behovet for at kunne modstå disse turgorspændinger har deres vægge Young-moduli på titusinder til hundreder af MPa (1 atm = 0,1 MPa) , og de kan potentielt stivne under stress . E. coli-cellevæggen har et Young-modul på 25 til 100 MPa , og cellerne udsættes for et turgortryk på ca. 1 atm ,. Interessant nok har B. subtilis-celler et turgortryk, der er ca. 10 gange større end E. coli’s, og deres vægge har et lignende Young-modul, men er 10 gange tykkere , hvilket tyder på, at deres lignende former måske kan opstå på grund af en fælles mekanisk balance mellem turgortryk og vægspændinger . Nylige skøn for S. pombe-celler placerer Young-modulet på omkring 50 MPa og turgortrykket på 10 til 15 atm (vores upublicerede data).

Hvordan den absolutte cellestørrelse er specificeret, er ukendt i nogen celletype og er fortsat et af de udestående spørgsmål inden for morfogenese. Hvordan specificerer cellerne deres dimensioner, og hvordan er en bestemt størrelse (ligesom celleform) fordelagtig i evolutionær henseende? Det er klart, at mange celler nøje fastholder deres størrelse, mens de vokser og deler sig ved hjælp af homøostatiske mekanismer ,. F.eks. går nogle celler først i gang med deling eller DNA-replikation, når de har nået en minimal cellestørrelse, hvilket tyder på, at de har evnen til at mærke deres egen størrelse eller geometri. S. pombe-celler vokser til 14 μm i længden, før de går ind i mitose og deler sig. Nylige fremskridt har identificeret et system af kortikale faktorer, herunder Cdr2 og Pom1, der synes at overvåge cellens overfladeareal i denne proces . Der er blevet foreslået lignende sizers i bakterier . Yderligere faktorer, der påvirker cellestørrelsen, er mekaniske overvejelser som f.eks. cellevægspres og turgortryk. For en bakterie i mikrometerstørrelse ville en forøgelse af cellens bredde være koblet til en stigning i stress, der ville medføre en øget strækning af væggen; medmindre de mekaniske egenskaber eller tykkelsen af cellevæggen blev justeret, ville en bakterie sandsynligvis ikke kunne udvide sig til at nå op på størrelsen af en S. pombe-celle uden at briste. Det vil være interessant at afgøre, hvordan de mekaniske egenskaber og vægtykkelsen varierer på tværs af nært beslægtede arter af forskellig størrelse, såsom Bacillus megaterium (som er ca. 1,5 μm bred) eller den større fissionsgær S. japonicus (figur 3a). Hver art kan således opnå en bestemt størrelse, der passer til dens mekaniske og vækstmæssige egenskaber.

Formation af en stang fra en kugle

Ud over udbredelsen af formen under vækst kan cellerne stå over for udfordringen med den indledende etablering af formen. Der er blevet etableret flere systemer til at undersøge dannelsen af stavform de novo. Når S. pombe-sporer spirer, svulmer de generelt op til en næsten sfærisk form og vokser derefter en fremspringende del, der til sidst strækker sig til en stang med den korrekte bredde. Mekanisk anisotropi forårsaget af et brud i sporevæggen og en lokal ophobning af Cdc42-aktivitet kan udløse den indledende vækst af fremspringet . Man ved imidlertid kun lidt om, hvordan dimensionerne og formen af den fremspringende stang etableres. Et andet eksempel på de novo formdannelse findes i spheroplast regeneration. Ved fjernelse af cellevæggen er den resulterende S. pombe spheroplast sfærisk; når væggen regenereres, udgår en stang af den rette bredde fra den større runde celle i den første generation . Bakterier er også i stand til at regenerere sig til stave. I modsætning til gær overgår bakterielle spheroplaster gennem amorfe former til at danne væggede, stavformede celler i løbet af nogle få generationer ,, og det er for nylig blevet vist, at denne tilbagevenden til en stavform i B. subtilis kan indledes fra en helt vægløs tilstand . Denne adfærd viser, at cellens form og dimensioner reguleres af robuste intracellulære mekanismer og ikke udelukkende afhænger af formen af cellerne i tidligere generationer.

Holdelse af bredden og opretholdelse af staven lige

En udfordring for stavformede celler er at opretholde cellens bredde under væksten. For de stavformede bakterier E. coli og B. subtilis, som begge strækker sig langs den cylindriske del af cellen , forbliver cellebredden konstant selv i trådformede celler, der vokser til længder nærmer sig 100 mikrometer ,. Tilsvarende opretholdelse af bredden ses i S. pombe- og i plantepollenrør. I spidsvoksende stave skal spidens vækstzone forblive konstant. I bakterier som E. coli skal væksten koordineres med udvidelsen, således at bredden opretholdes, mens cellens længde øges. Modelleringsundersøgelser har forudsagt, at det er nødvendigt at indføre stress i det nye materiale under inkorporering for at forhindre turgormedieret radial udvidelse ,,; MreB depolymerisering forårsager en gradvis stigning i cellens bredde , hvilket indikerer, at MreB kan spille en rolle i indførelsen af denne stress. Afgørende for afprøvning af disse modeller vil være udviklingen af genetiske og kemiske metoder til at indstille cellebredden uden at forstyrre den overordnede stavform.

En anden udfordring for stavformede celler er at opretholde en lineær vækstakse under forlængelse. Hvordan kan en celle overvåge “rethed”? I E. coli-celler lokaliseres det actinlignende MreB-cytoskelet fortrinsvis til regioner med negativ gaussisk krumning, hvilket tyder på, at MreB-polymerer registrerer cellens krumning og aktivt retter cellen ud ved at lede cellevæggen til specifikke steder på celleoverfladen baseret på den lokale geometri . I S. pombe kan mikrotubuli-cytoskelettet holde cellerne lige ved at koordinere cellevægsvæksten ved cellespidserne; mikrotubuli strækker sig over hele cellens længde og transporterer polaritetsfaktorer, såsom Tea-proteinerne, til spidserne . Mutanter med unormalt korte mikrotubuli eller som mangler Tea-proteiner vokser ofte i en buet form eller etablerer undertiden en unormal vækstzone på siden af cellen, hvilket fører til dannelse af en forgrenet, “T”-formet fænotype , hvilket tyder på, at mikrotubuli bidrager til ligehed ved at koordinere de rigtige vækstzoner ved de to cellespidser , . Samlet set er cytoskelettet hos både prokaryoter og eukaryoter i det mindste delvist ansvarligt for at opretholde celleformen ved at koordinere lokale vækstmønstre med den globale morfologi .

Ny endedannelse: en mekanisk mekanisme

Enderne af mange stavformede celler er groft sagt halvkugleformede, med dimensioner i overensstemmelse med de cylindriske dele af cellen. Mens den voksende ende af en spidsvoksende celle reguleres af mange intracellulære faktorer, der modulerer den progressive remodellering af cellevæggen, giver dannelsen af den nye celleende i S. pombe et eksempel på, hvordan turgortrykket i sig selv kan forme cellevæggen. Under cytokinese dannes der en cellevægsseptum på delingsstedet, som styres af den aktinbaserede kontraktile ring. Derefter fordøjes en del af septummet for at forårsage celledeling ; umiddelbart efter delingen ændrer septummet sig fra en flad form til den afrundede nye ende. Denne morfologi, som adskiller sig fra den voksende cellespids’ lidt mere spidse form, kan være frembragt af en overvejende mekanisk mekanisme, hvor turgotrykket puster cellevæggen op (vores upublicerede observationer). Det vil være interessant at se, om Gram-positive bakterier, som har en tykkere cellevæg end Gram-negative, og som danner et septum ligesom i S. pombe, også former deres nye ender på en turgormedieret måde. Derimod indsnævrer E. coli-cellerne sig ved midten af cellen længe før celledelingen . Denne indsnævring formidles af tubulinhomologet FtsZ ,, kombineret med en progressiv omformning af cellevæggen for at skabe en halvkugleformet polær morfologi .