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La meccanica dei gusci sottili a forma di bastoncino

La crescita a forma di bastoncino richiede in definitiva una rottura della simmetria, che può derivare dalla direzionalità nelle proprietà materiali della parete cellulare, dalle sollecitazioni, dall’organizzazione del macchinario di sintesi, o da qualsiasi combinazione di queste. I modelli fisici per la morfogenesi delle cellule a parete considerano la cellula come un sottile guscio viscoelastico, che è uniformemente gonfiato dall’interno dalla pressione del turgore. Per prevedere la forma della cellula risultante da un dato meccanismo di crescita, è fondamentale considerare la distribuzione delle forze dovute alla pressione del turgore, le forze di controbilanciamento dell’allungamento della parete, e come le proprietà materiali della parete accoppiano queste forze al grado di estensione. Per un materiale elastico lineare, lo stress σ (forza per unità di superficie) è legato alla deformazione meccanica ε (allungamento frazionario) attraverso il modulo di Young:

una misura della rigidità intrinseca del materiale simile alla costante di forza k di una molla (per la quale la legge di Hooke impone che k = F/x, dove F è la forza richiesta per allungare la molla di una quantità x). In un guscio sottile ed elastico, le sollecitazioni dovrebbero aumentare con l’aumentare del raggio della cellula r e con la pressione di turgore P, e diminuire con uno spessore maggiore della parete della cellula d. In un guscio sferico, le sollecitazioni sono uguali in ogni direzione. Al contrario, la geometria di un guscio cilindrico impone che le sollecitazioni circonferenziali (σ r ) siano due volte più grandi delle sollecitazioni longitudinali (σ l ) (Figura 1c):

Combinando le equazioni 1 e 2, queste relazioni di modello prevedono che le tensioni circonferenziali e longitudinali (ε r e ε l , rispettivamente) dovrebbero essere linearmente dipendenti dalla larghezza e dalla pressione di turgore e inversamente dipendenti dallo spessore della parete. Se il modulo di Young è uguale in ogni direzione (meccanicamente isotropo), allora ε r dovrebbe essere due volte più grande di ε l.

Questa relazione tra le deformazioni in diverse direzioni è stata usata per sondare le proprietà meccaniche della parete cellulare delle cellule a forma di bastoncello. Nel lievito di fissione, la misurazione del grado di contrazione delle cellule quando la pressione di turgore è ridotta rivela questo rapporto di deformazione 2:1 previsto, suggerendo che la parete cellulare in queste cellule si comporta come un materiale isotropo (Atilgan e Chang, osservazioni non pubblicate). Al contrario, nei batteri a forma di asta come E. coli e B. subtilis, le cellule mostrano un maggior grado di allungamento longitudinale piuttosto che radiale, indicando l’anisotropia meccanica (o dipendenza direzionale), con una maggiore rigidità nella direzione circonferenziale rispetto a quella longitudinale. Queste osservazioni sono coerenti con i tomogrammi crio-elettronici che mostrano che la parete cellulare di E. coli è organizzata con i componenti più rigidi (fili di glicano) orientati lungo la direzione circonferenziale. Sarà interessante scoprire se c’è anisotropia meccanica nelle pareti cellulari delle piante, o se sono più simili alla parete cellulare del lievito di fissione.

È importante notare che l’anisotropia della crescita (allungamento lungo un solo asse) può avvenire utilizzando materiale anisotropo o isotropo della parete; infatti, il materiale isotropo può essere utilizzato per costruire praticamente qualsiasi forma cellulare. Inoltre, le proprietà meccaniche della parete cellulare possono essere molto più complesse delle semplici relazioni di scala che abbiamo descritto sopra. Per esempio, la relazione tra sollecitazioni e deformazioni non seguirà più l’equazione 1 a deformazioni sufficientemente grandi; recenti misure di microscopia a forza atomica indicano che la parete cellulare di E. coli esibisce proprietà non lineari nel suo stato pressurizzato che possono aiutare la cellula a resistere all’espansione durante lo shock ipoosmotico. Il presupposto di uno spessore costante attraverso il guscio sottile può anche rompere, in particolare durante la settaggio a causa delle differenze nella modalità di costruzione della parete al setto. In definitiva, queste caratteristiche meccaniche devono essere integrate con i modelli di inserimento e rimodellamento della parete, che possono sia alterare lo spessore della parete cellulare che portare ad una risposta viscoelastica in cui il materiale della parete scorre come un liquido viscoso quando viene sollecitato. Questo produce una vasta gamma di potenziali meccanismi di crescita nelle cellule a parete. I modelli biofisici possono fornire previsioni verificabili per le relazioni tra la pressione di turgore, i modelli di crescita e la distribuzione degli sforzi e del tasso di crescita attraverso la superficie cellulare.

Crescita per allungamento cilindrico

In molti batteri, la crescita cellulare si ottiene mediante l’inserimento di nuovo materiale della parete cellulare in siti in tutta la parte cilindrica della parete cellulare, mentre l’inserimento è diminuito ai poli cellulari. L’organismo più studiato dal punto di vista della crescita della parete cellulare è l’E. coli, con diverse recensioni che si concentrano sulla biochimica, sul meccanismo di sintesi, sulla morfologia e sulle caratteristiche fisiche della parete cellulare. Come la maggior parte dei batteri, E. coli ha una parete cellulare composta da peptidoglicano, una rete macromolecolare di filamenti di zucchero (glicani) reticolati da brevi peptidi. Come notato sopra, i filamenti di glicano più rigidi sono orientati in modo circonferenziale, rendendo la parete cellulare meccanicamente anisotropa oltre all’anisotropia di crescita della forma a bastoncello. La proteina citoscheletrica MreB, un omologo dell’actina eucariotica, si muove in modo approssimativamente circonferenziale lungo la faccia interna della membrana citoplasmatica, e il mecillinam, antibiotico mirato alla parete cellulare, inibisce questo movimento, suggerendo un modello in cui le tracce MreB indicano i percorsi di inserimento di nuovo materiale sulla parete laterale. Inoltre, le cellule di E. coli si attorcigliano mentre si allungano in un modo MreB-dipendente, a causa dell’orientamento dei filamenti di glicano con una leggera distorsione angolare lontano dalla direzione circonferenziale. In B. subtilis, è stato osservato un simile accoppiamento del movimento MreB alla sintesi della parete cellulare e alla torsione (con mano opposta), suggerendo regole comuni con E. coli per stabilire l’ordine all’interno della parete nonostante la differenza di spessore della parete. Non si sa se il modello MreB-guidato di inserimento della parete cellulare aiuta anche la cellula a determinare e/o mantenere la sua larghezza durante la crescita, anche se le mutazioni in mreB possono portare a barre di diverse dimensioni.

Una conseguenza prevista di allungamento cilindrico è la crescita esponenziale, in cui singole cellule lunghe crescono più velocemente di quelle corte. Infatti, le cellule di E. coli si allungano esponenzialmente quando la divisione è bloccata, e sembrano farlo anche durante la normale crescita e divisione. La crescita esponenziale potrebbe essere attesa da un organismo la cui zona di crescita aumenta proporzionalmente alla crescita della cellula; è interessante notare che la natura della crescita esponenziale (L = L02t/τ, dove τ è il tempo di raddoppio) impone che 1/L (dL/dt) = (ln 2)/τ è costante indipendente da L, indicando che non esiste una scala di lunghezza preferita per un dato tempo di raddoppio.

E. coli, insieme al batterio curvo Caulobacter crescentus, è stato un soggetto principale degli studi teorici e computazionali della morfogenesi batterica. I modelli sono stati suddivisi in due classi ampie e complementari: simulazioni di dinamica molecolare a grana grossa della meccanica della parete e della crescita, motivate da meccanismi ipotizzati di coordinazione molecolare e/o misure sperimentali di modelli di inserimento della parete cellulare, e modelli meccanico-chimici ad elementi finiti che incorporano il rimodellamento della parete con il rilassamento meccanico per prevedere potenziali instabilità e relazioni di scala tra le dimensioni cellulari e i parametri di crescita. Un modello che considera l’equilibrio tra l’energia chimica rilasciata durante l’inserimento e il cambiamento nell’energia di deformazione dovuta alla nuova geometria dopo la crescita predice una larghezza stabile e un tasso di crescita per la crescita a forma di asta che concorda con le misure di E. coli e B. subtilis per scelte ragionevoli dei parametri. Le simulazioni basate su questo modello suggeriscono che MreB esercita una forza verso l’interno sulla parete cellulare, impedendo instabilità nella crescita dovuta alla pressione di turgore. I modelli computazionali hanno generalmente suggerito che una robusta determinazione della forma richiede la coordinazione dell’incorporazione della parete cellulare, e le simulazioni su scala molecolare suggeriscono che il movimento di MreB può aiutare a mantenere la larghezza della cellula lungo il corpo cellulare, in particolare durante le perturbazioni come lo shock osmotico.

Crescita per estensione della punta cellulare

In contrasto con E. coli, alcune cellule a forma di asta crescono tramite inserimento di nuova parete cellulare e membrana sulle punte delle cellule, mentre la parete laterale è relativamente inerte. I meccanismi di crescita della punta sono stati studiati in molti organismi con parete, tra cui S. pombe, funghi ifali, muschio e tubi di polline, così come in batteri come A. tumefaciens. In generale, si pensa che la crescita della punta sia guidata da un’elevata pressione di turgore che estende la parete cellulare alla punta, accoppiata all’aggiunta di nuovo materiale e al rimodellamento del vecchio materiale da una varietà di fattori intracellulari (Figura 1b).

I modelli fisici della crescita della punta hanno postulato che una forma a bastoncello si forma inserendo una parete più morbida simile al gel sulla punta stessa della cellula, che poi matura in una rete più rigida sui lati delle cellule, -. I parametri morfogenetici che definiscono la forma della punta della cellula sono quindi correlati dall’equilibrio tra maturazione, pressione e inserimento, con la conservazione della massa come vincolo. Alcuni modelli biofisici generalizzati della crescita della punta sono stati astratti al di là dei dettagli molecolari e della struttura di un particolare sistema, e quindi sono stati utili per fornire leggi di scala relative alla forma della punta, alle dimensioni delle cellule e al tasso di crescita che possono essere testate e convalidate utilizzando studi comparativi tra le specie (Figura 2). In uno studio recente, il raggio massimo di curvatura della punta R A è previsto in scala come 1/P mentre il raggio della cellula è previsto in scala come (a2/P)1/3, dove a è la dimensione della regione in cui viene secreto nuovo materiale. Questo dà un rapporto tra le due quantità:

dove R e R A sono facilmente misurabili dalle immagini delle cellule. In questo modello, si assume che la viscosità della parete sia una funzione fissa dell’angolo intorno alla punta della cellula, indipendente da altri parametri; resta da vedere quanto le previsioni siano sensibili a questa assunzione. Tuttavia, è intrigante che diverse specie di funghi e tubi di polline delle piante mostrano tutte una relazione lineare tra R e R A (R A /R costante); quindi, se l’equazione 3 è valida, questi dati implicano che la dimensione a della zona di inserzione scala anche con R, e specie strettamente correlate hanno anche pendenze simili. Coerentemente con questi modelli, nei tubi di polline e in S. pombe, le sintasi della parete cellulare sono localizzate alle punte delle cellule in crescita dove introducono nuovo materiale della parete. Nei tubi di polline, le misure di microscopia a forza atomica hanno rivelato un gradiente di rigidità della parete cellulare, in cui la parete all’apice è la più morbida. Anche se tali misure non sono state effettuate nel lievito di fissione, le macchie della parete come il bianco calcofluor suggeriscono anche un gradiente di rigidità della parete cellulare,,. Inoltre, i modelli di migrazione dei marcatori fiduciali lungo la cella durante la crescita sono coerenti con i modelli meccanici di espansione di un emisfero in un cilindro, illustrando l’utilità di imaging di modelli di crescita dinamica per sondare i meccanismi morfogenetici,.

In S. pombe, sono state identificate complesse reti molecolari che modulano la forma cellulare, e quindi possono essere coinvolte a qualche livello nella regolazione del meccanismo della parete cellulare. I processi cellulari chiave includono l’esocitosi, l’endocitosi, i citoscheletri di actina e di microtubuli, e le piccole GTPasi come Rho e Cdc42 (vedi per una revisione). Cdc42 può regolare l’actina e il traffico di membrana per indirizzare le vescicole secretorie contenenti sintasi della parete cellulare, precursori della parete cellulare e membrana al sito di crescita (Figura 1b). Anche se sia l’actina che i microtubuli sono pensati per esercitare forze che spingono e distorcono la membrana plasmatica nelle cellule animali, ci sono poche prove che essi modellano le cellule a parete esercitando direttamente delle forze. Invece, l’actina svolge almeno due ruoli critici nella crescita delle cellule polarizzate: come piste per il trasporto di vescicole basato sulla miosina verso la punta della cellula e per l’endocitosi. I microtubuli hanno un ruolo diretto nel trasporto polarizzato di vescicole in alcuni funghi, come Aspergillus e Ustilago,. In S. pombe, i microtubuli svolgono un ruolo normativo nella polarità depositando le proteine Tea che regolano l’actina e Cdc42 alle punte delle cellule, e possono dirigere la formazione di un ramo in determinate circostanze,. Modelli matematici hanno esplorato come le proteine Tea agiscono come punti di riferimento per stabilire gradienti di Cdc42 attivato,. È interessante notare che l’attività Cdc42 è stata osservata per oscillare tra le due punte delle cellule con una scala temporale di circa cinque minuti, che può essere modellata utilizzando cicli di feedback positivo e negativo. Non è noto se la crescita del lievito di fissione varia con queste oscillazioni Cdc42, anche se i tubi di polline e alcuni funghi ifali mostrano la crescita della punta in impulsi oscillatori. Inoltre, alcuni mutanti con alterata attività Cdc42 esibiscono larghezze cellulari alterate, suggerendo un modello in cui un gradiente di attività Cdc42 alle punte delle cellule è usato per specificare la larghezza dell’asta,,. Come i modelli spaziali dei fattori di polarità come Cdc42 controllano la forma delle cellule attraverso la crescita della parete cellulare rimane poco compreso.

Le dimensioni delle aste

Le dimensioni cellulari come la larghezza, la lunghezza e lo spessore della parete cellulare variano notevolmente in diversi organismi, potenzialmente influenzando la distribuzione delle sollecitazioni e quindi la forma delle cellule risultante. Quindi, la quantificazione della distribuzione di queste dimensioni cellulari, insieme alle caratteristiche morfologiche come il profilo di curvatura del corpo cellulare e della punta, sarà fondamentale per studiare e contrastare i meccanismi di crescita. Strumenti computazionali sono stati recentemente sviluppati che consentono l’analisi rapida e automatizzata di grandi popolazioni di cellule con risoluzione sub-pixel,. Per illustrare la variabilità delle dimensioni assolute delle cellule tra le specie batteriche e fungine, abbiamo fotografato le cellule e analizzato le loro forme utilizzando un quadro computazionale comune basato su Matlab precedentemente applicato alla quantificazione della larghezza delle cellule nei batteri (Figura 3a) . Queste misurazioni ci hanno anche permesso di misurare la curvatura del contorno delle cellule; abbiamo notato che nelle cellule affusolate (per esempio, Schizosaccharomyces japonicus), i lati sono rimasti dritti mentre i poli avevano curvature diverse (Figura 3b). Il rapporto d’aspetto è approssimativamente conservato tra i batteri studiati e in S. pombe, anche se altri funghi come S. japonicus sono un po’ più tozzi nel rapporto d’aspetto.

Misure quantitative di pressione di turgore e le proprietà della parete cellulare sono anche fondamentali per la comprensione dei meccanismi di determinazione della forma delle cellule. Sebbene la pressione di turgore sia stata misurata direttamente in grandi cellule vegetali, le dimensioni più piccole dei batteri e del lievito hanno reso necessario lo sviluppo di metodi indiretti per stimare la pressione di turgore,,,. Gli organismi murati sembrano crescere sotto pressioni di turgore da poche a decine di atmosfere,. Coerentemente con la necessità di sopportare queste sollecitazioni di turgore, le loro pareti hanno moduli di Young da decine a centinaia di MPa (1 atm = 0,1 MPa),, e potenzialmente irrigidire sotto stress. La parete cellulare di E. coli ha un modulo di Young da 25 a 100 MPa, e le cellule subiscono una pressione di turgore di circa 1 atm,. È interessante notare che le cellule di B. subtilis hanno pressioni di turgore circa 10 volte quelle di E. coli, e le loro pareti hanno un modulo di Young simile, ma sono 10 volte più spesse, suggerendo che forse le loro forme simili potrebbero sorgere attraverso un equilibrio meccanico comune di pressione di turgore e stress di parete. Stime recenti delle cellule di S. pombe collocano il modulo di Young a circa 50 MPa e la pressione di turgore a 10-15 atm (i nostri dati non pubblicati).

Come le dimensioni assolute delle cellule siano specificate è sconosciuto in qualsiasi tipo di cellula, e rimane una delle domande in sospeso nella morfogenesi. Come fanno le cellule a specificare le loro dimensioni, e in che modo una certa dimensione (come la forma delle cellule) è vantaggiosa in termini evolutivi? È chiaro che molte cellule mantengono strettamente le loro dimensioni mentre crescono e si dividono usando meccanismi omeostatici. Per esempio, alcune cellule si impegnano nella divisione o nella replicazione del DNA solo dopo aver raggiunto una dimensione cellulare minima, suggerendo che hanno la capacità di percepire la propria dimensione o geometria. Le cellule di S. pombe crescono fino a 14 μm di lunghezza prima di entrare in mitosi e dividersi. Recenti progressi hanno identificato un sistema di fattori corticali tra cui Cdr2 e Pom1 che sembrano controllare la superficie della cellula in questo processo . Simili dimensionatori sono stati proposti nei batteri. Ulteriori fattori che influenzano le dimensioni delle cellule sono considerazioni meccaniche come lo stress della parete cellulare e la pressione di turgore. Per un batterio delle dimensioni di un micron, un aumento della larghezza delle cellule sarebbe accoppiato a un aumento dello stress che comporterebbe un aumento dello stiramento della parete; a meno che le proprietà meccaniche o lo spessore della parete cellulare siano stati regolati, un batterio probabilmente non potrebbe espandersi per raggiungere le dimensioni di una cellula di S. pombe senza rompersi. Sarà interessante determinare come le proprietà meccaniche e lo spessore della parete variano tra specie strettamente correlate di dimensioni diverse, come Bacillus megaterium (che è circa 1,5 μm di larghezza) o il più grande lievito di fissione S. japonicus (Figura 3a). Ogni specie può quindi raggiungere una certa dimensione che si adatta alle sue proprietà meccaniche e di crescita.

Formazione di un’asta da una sfera

Oltre alla propagazione della forma durante la crescita, le cellule possono affrontare la sfida di stabilire inizialmente la forma. Diversi sistemi sono stati stabiliti per esaminare la formazione della forma dell’asta de novo. Quando le spore di S. pombe germinano, generalmente si gonfiano in una forma quasi sferica e poi crescono una sporgenza che alla fine si estende in un’asta della larghezza corretta. L’anisotropia meccanica causata da una rottura nella parete della spora e un accumulo locale di attività Cdc42 possono innescare la crescita iniziale della protrusione. Tuttavia, poco si sa su come vengono stabilite le dimensioni e la forma dell’asta sporgente. Un altro esempio di formazione di forma de novo è nella rigenerazione degli sferoplasti. Dopo la rimozione della parete cellulare, lo sferoplasto S. pombe risultante è sferico; quando la parete si rigenera, un’asta della larghezza adeguata si estende dalla cellula rotonda più grande della prima generazione. Anche i batteri sono in grado di rigenerarsi in bastoncini. In contrasto con il lievito, gli sferoplasti batterici passano attraverso forme amorfe per formare cellule murate a forma di asta nel corso di poche generazioni, ed è stato recentemente dimostrato che questa inversione a forma di asta in B. subtilis può iniziare da uno stato completamente privo di parete. Questi comportamenti dimostrano che la forma e le dimensioni della cellula sono regolate da robusti meccanismi intracellulari e non dipendono esclusivamente dalla forma delle cellule nelle generazioni precedenti.

Mantenere la larghezza e mantenere l’asta dritta

Una sfida per le cellule a forma di asta è mantenere la larghezza della cellula durante la crescita. Per i batteri a forma di asta E. coli e B. subtilis, entrambi i quali si allungano lungo la porzione cilindrica della cellula, la larghezza delle cellule rimane costante anche nelle cellule filamentose che crescono fino a lunghezze che si avvicinano a 100 micron. Un simile mantenimento della larghezza è visto S. pombe- e nei tubi di polline delle piante. Nei bastoncelli che crescono di punta, la zona di crescita della punta deve rimanere costante. In batteri come E. coli, la crescita deve essere coordinata con l’estensione in modo che la larghezza sia mantenuta mentre la lunghezza delle cellule aumenta. Studi di modellazione hanno previsto che l’introduzione di stress nel nuovo materiale durante l’incorporazione è necessaria per prevenire l’espansione radiale mediata dal turgore,,; la depolimerizzazione di MreB causa un graduale aumento della larghezza delle cellule, indicando che MreB può svolgere un ruolo nell’introduzione di questo stress. Critico per testare questi modelli sarà lo sviluppo di metodi genetici e chimici per sintonizzare la larghezza delle cellule senza interrompere la forma complessiva a bastoncello.

Un’altra sfida per le cellule a bastoncello è quella di mantenere un asse lineare di crescita durante l’allungamento. Come può una cellula monitorare la “linearità”? Nelle cellule di E. coli, il citoscheletro MreB simile all’actina si localizza preferenzialmente nelle regioni di curvatura gaussiana negativa, suggerendo che i polimeri MreB percepiscono la curvatura cellulare e raddrizzano attivamente la cellula dirigendo l’inserimento della parete cellulare in siti specifici sulla superficie cellulare in base alla geometria locale. In S. pombe, il citoscheletro dei microtubuli può mantenere le cellule dritte coordinando la crescita della parete cellulare alle punte delle cellule; i microtubuli si estendono attraverso la lunghezza delle cellule e trasportano i fattori di polarità, come le proteine Tea, alle punte. I mutanti con microtubuli anormalmente corti o che mancano di proteine Tea spesso crescono in una forma curva o talvolta stabiliscono una zona di crescita anormale sul lato della cellula, portando alla formazione di un fenotipo ramificato, a forma di ‘T’, suggerendo che i microtubuli contribuiscono alla linearità coordinando le zone appropriate di crescita alle due punte delle cellule,. Nel complesso, sia nei procarioti che negli eucarioti, il citoscheletro è almeno parzialmente responsabile del mantenimento della forma cellulare coordinando i modelli di crescita locale con la morfologia globale.

La formazione di nuove estremità: un meccanismo meccanico

Le estremità di molte cellule a forma di asta sono approssimativamente emisferiche, con dimensioni in accordo con le porzioni cilindriche della cellula. Mentre l’estremità in crescita di una cellula a punta è regolata da molti fattori intracellulari che modulano il progressivo rimodellamento della parete cellulare, la formazione della nuova estremità della cellula in S. pombe fornisce un esempio di come la pressione del turgore stesso possa modellare la parete cellulare. Durante la citochinesi, un setto della parete cellulare si forma nel sito di divisione, guidato dall’anello contrattile basato sull’actina. In seguito, parte del setto viene digerito per causare la separazione delle cellule; immediatamente dopo la separazione, il setto passa da una forma piatta alla nuova estremità arrotondata. Questa morfologia, che si distingue dalla forma leggermente più appuntita della punta della cellula in crescita, può essere prodotta da un meccanismo prevalentemente meccanico in cui la pressione del turgore gonfia la parete cellulare (le nostre osservazioni non pubblicate). Sarà interessante vedere se i batteri Gram-positivi, che hanno una parete cellulare più spessa dei Gram-negativi, e formano un setto come in S. pombe, modellano anche le loro nuove estremità in un modo mediato dal turgore. Al contrario, le cellule di E. coli si restringono a metà della cellula ben prima della separazione cellulare. Questa costrizione è mediata dall’omologo della tubulina FtsZ, accoppiato al progressivo rimodellamento della parete cellulare per creare una morfologia polare emisferica.